第 1 章 Biological Sequence Databases

Introduction

在过去几十年中，人们一直以近乎急切的速度，试图从最基本的层面理解构成“生命之书”的究竟是什么。生物学家（以及一般意义上的科学家）希望理解，一个生物体基因组中数以百万计或数以十亿计的碱基，如何包含细胞开展维持该生物体生存所必需的无数代谢过程所需的全部信息；这些信息又如何一代一代地传递下去。为了从基础层面理解单个核苷酸碱基的集合如何驱动生命这台机器，必须收集大量序列数据，并以便于检索和分析的方式加以存储。为此，研究者在生物序列数据库的设计和维护方面投入了大量工作。这些数据库不仅从计算角度显著推动了我们对生物学的理解，也通过与实验台研究的整合使用，对生物学认识的进展产生了重要影响。

序列数据库的历史始于 20 世纪 60 年代初。当时，Margaret Dayhoff 及其在 National Biomedical Research Foundation（NBRF）的同事（1965）收集了当时已知的全部蛋白质序列——总共 65 条——并将它们出版在一本名为 Atlas of Protein Sequence and Structure 的书中。需要记住的是，在生物学发展的这一阶段，研究重点是通过 Edman degradation 等传统技术测定蛋白质序列，而不是测定 DNA 序列，因此可用序列的总体数量很少。到 20 世纪 70 年代末，随着相当数量的核苷酸序列变得可用，这些序列也被纳入 Atlas 的后续版本中。随着这一资料集的发展，它不仅包含蛋白质序列，还包含与之配套的基于文本的描述，以及关于许多蛋白质家族进化的信息。从本质上说，这项工作是第一个带注释的序列数据库，尽管它当时是以印刷形式存在的。随着时间推移，Atlas 中包含的数据量变得难以管理，将其转为电子形式的需求也日益明显。从 20 世纪 70 年代初到 20 世纪 80 年代末，Atlas 的内容由 NBRF（后来由 Protein Information Resource，PIR）以磁带形式进行电子分发；这些分发内容还包括一些基础程序，可用于搜索并评估较远的进化关系。

序列数据库历史的下一个阶段，是由 20 世纪 70 年代末研究人员可用的核苷酸序列数据量真正爆炸式增长所推动的。为满足更强大的公共序列数据库需求，Los Alamos National Laboratory（LANL）于 1979 年创建了 Los Alamos DNA Sequence Database，该数据库于 1982 年被称为 GenBank（Benson et al. 2018）。与此同时，European Molecular Biology Laboratory（EMBL）于 1980 年创建了 EMBL Nucleotide Sequence Data Library。整个 20 世纪 80 年代，EMBL（当时位于德国 Heidelberg）、LANL，以及后来加入的 National Center for Biotechnology Information（NCBI，隶属于 National Library of Medicine，后者属于 National Institutes of Health）共同向这些数据库贡献 DNA 序列数据。这些数据由多组人工审查人员处理：他们手工转录并解读印刷期刊中发表的内容，将其转化为更适合计算分析的电子格式。几年后，DNA Databank of Japan（DDBJ；Kodama et al. 2018）加入了这一 DNA 数据收集协作。

到 20 世纪 80 年代末，产生的 DNA 序列数据量已经非常庞大，以至于印刷期刊开始要求科学家将其 DNA 序列直接以电子方式提交到这些数据库，而不是发表在纸质期刊或论文中。1988 年，在这三个组织召开会议之后（如今统称为 International Nucleotide Sequence Database Collaboration，即 INSDC；Karsch-Mizrachi et al. 2018），它们达成协议：使用共同的数据交换格式，并且每个数据库只更新直接提交给自己的记录。由于这一协议，三个中心（EMBL、DDBJ 和 NCBI）现在都接收直接提交的 DNA 序列，并对这些序列进行分发，使每个中心都保存全部序列的副本；同时，每个中心也都是这些序列的主要分发中心。DDBJ/EMBL/GenBank 记录会在三个站点每 24 小时自动更新一次，这意味着所有序列很快都可以在 DDBJ、European Nucleotide Archive（ENA；Silvester et al. 2018）和 GenBank 中找到。尽管如此，INSDC 内的每个数据库仍可按照自己认为合适的方式展示和注释序列数据。

在 DNA 序列数据库早期工作展开的同时，Swiss-Prot 蛋白质序列数据库的基础也在 20 世纪 80 年代初由 Amos Bairoch 奠定；Bairoch 在一篇第一人称综述中以引人入胜的视角回顾了这段历史（Bairoch 2000）。Bairoch 将 PIR 的 Atlas 转换为一种类似于 EMBL 核苷酸数据库所用格式的格式。在这个最初名为 PIR+ 的版本中，每种蛋白质都被加入了额外信息，从而提高了它作为经过策展、注释良好的蛋白质信息来源的价值。1986 年夏，Bairoch 开始通过 US BIONET（互联网的前身）分发 PIR+，并将其更名为 Swiss-Prot。当时，它总共包含 3900 条蛋白质序列。与今天的标准相比，这一数量显得很小，但在当时已被视为极其庞大的数据量。

由于 Swiss-Prot 和 EMBL 采用相似的格式，这两个团队之间自然发展出合作关系；当 EMBL 和 Swiss-Prot 的业务都迁移到位于英国 Hinxton 的 EMBL European Bioinformatics Institute（EBI；Cook et al. 2018）后，这些合作进一步加强。Swiss-Prot 和 EMBL 团队最早开展的合作项目之一，是创建一个新的、规模大得多的蛋白质序列数据库，作为 Swiss-Prot 的补充。由于维护 Swiss-Prot 条目的高质量是一项耗时工作，需要专家注释人员进行广泛的序列分析和细致策展（Apweiler 2001），同时也为了快速发布尚未达到 Swiss-Prot 严格注释标准的蛋白质数据，一个名为 TrEMBL 的新数据库被创建出来；TrEMBL 意为“translation of EMBL nucleotide sequences”。这个 Swiss-Prot 补充库最初由计算注释的序列条目构成，这些条目来自 INSDC 数据库中所有编码序列（coding sequences, CDSs）的翻译结果。

2002 年，Swiss Institute of Bioinformatics、EMBL-EBI 和 PIR 发起了一项新的合作，即 UniProt consortium（UniProt Consortium 2017）。这一工作催生了 UniProt Knowledgebase（UniProtKB），其中包括 Swiss-Prot、TrEMBL 和 PIR。类似的工作也促成了 NCBI Protein Database 的形成；该数据库汇集了来自众多来源的数据，并将在下文中作更充分的介绍。人类基因组测序的完成、众多模式生物基因组的测序，以及总体上数量极其庞大的序列数据的存在，共同构成了充分理由：读者首先需要扎实理解这些主要公共序列数据库，进而才能开展稳健而准确的生物信息学分析。

第 1 章 Biological Sequence Databases

Nucleotide Sequence Databases

如上所述，核苷酸序列数据的主要来源，是参与 INSDC 的各个数据库——DDBJ、ENA 和 GenBank。这三方每 24 小时共享一次新增或更新的数据。这种数据传递之所以能够实现，是因为它们使用了共同的数据格式来描述下文将详细介绍的各类信息。

序列数据库中保存信息的基本格式，是一种称为 flatfile 的文本文件。不同 flatfile 格式之间的对应关系，极大地方便了这些数据库之间每天进行数据交换。在多数情况下，一个 flatfile 格式中的字段都可以一一映射到另一个 flatfile 格式中。随着时间推移，多种文件格式被采用，其中一些一直被广泛使用，另一些则由于各种原因逐渐被淘汰。某一种格式能否成功，取决于它在多种场景中的实用性，也取决于它能否有效容纳并表达那些需要被归档并传达给科学家的生物学数据类型。

在最简单的形式中，一条序列记录可以表示为一串核苷酸，再加上某种基本标签或标识符。在这些简单格式中，使用最广泛的是 FASTA。FASTA 最初是 Lipman 和 Pearson（1985）开发的 FASTA 软件套件的一部分，本书第 3 章将对其作详细介绍。这种格式本身非常简单，因而为人和计算机处理原始数据都提供了一种方便方式。其形式如下。

>U54469.1
CGGTTGCTTGGGTTTTATAACATCAGTCAGTGACAGGCATTTCCAGAGTTGCCCTGTTCAACAATCGATA
GCTGCCTTTGGCCACCAAAATCCCAAACTTAATTAAAGAATTAAATAATTCGAATAATAATTAAGCCCAG
TAACCTACGCAGCTTGAGTGCGTAACCGATATCTAGTATACATTTCGATACATCGAAATCATGGTAGTGT
TGGAGACGGAGAAGGTAAGACGATGATAGACGGCGAGCCGCATGGGTTCGATTTGCGCTGAGCCGTGGCA
GGGAACAACAAAAACAGGGTTGTTGCACAAGAGGGGAGGCGATAGTCGAGCGGAAAAGAGTGCAGTTGGC

为简洁起见，这里只显示了该序列最开始的几行。在 FASTA 格式最简单的实现中，“大于号”字符（>）表示一条新序列记录的开始；这一行称为定义行（definition line，通常也称为 def line）。唯一标识符——在本例中是 accession.version 编号（U54469.1）——之后接核苷酸序列；序列可以使用大写或小写字母表示，通常每行 60 个字符。登录号是始终与这条序列关联的编号，也是在论文中引用时应使用的编号；而版本号后缀则便于用户判断自己查看的是否是某条特定序列的最新记录。每当序列被更新时，版本号后缀就会递增 1。

还可以在定义行中加入更多信息，使这种简单格式稍微更具信息量。例如：

>ENA|U54469|U54469.1 Drosophila melanogaster eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E)
gene, complete cds, alternatively spliced.

这个修改后的 FASTA 定义行现在包含了来源数据库（ENA）、accession.version 编号（U54469.1），以及对该序列所代表的生物学实体的简短描述。

第 1 章 Biological Sequence Databases

Nucleotide Sequence Flatfiles: A Dissection

由于 flatfile 是序列数据库中信息的基本单位，并且承担着促进这些数据库之间信息交换的作用，因此有必要理解 flatfile 中每一个字段代表什么，以及记录的不同部分可以包含哪些类型的信息。虽然不同 flatfile 格式之间存在一些细微差异，但它们都可以分为三个主要部分：header，即包含整条记录相关信息和描述符的头部；feature table，即为序列提供相关注释的特征表；以及序列本身。

The Header

header 是一条记录中最能体现数据库特异性的部分。这里我们将以 ENA 版本的记录作为讨论对象（完整记录见附录 1.1），并在附录 1.2 中给出相应的 DDBJ 和 GenBank 版本 header。记录的第一行提供了该记录所含序列的基本识别信息，名称也很贴切，称为 ID 行；它对应于 DDBJ/GenBank 中的 LOCUS 行。

ID
U54469; SV 1; linear; genomic DNA; STD; INV; 2881 BP.

登录号显示在 ID 行中，后面跟着它的序列版本（这里是第一个版本，即 SV 1）。由于这里是 SV 1，因此它等同于前文所述的 U54469.1。随后给出的是 DNA 分子的拓扑结构（linear，线性）和分子类型（genomic DNA，基因组 DNA）。下一个元素表示该序列在 ENA 中的数据类别：STD，表示一条“标准的、已注释并已组装的序列”。数据类别用于将序列记录归入不同的功能分区，使用户能够查询数据库中的特定子集。Box 1.1 对这些功能分区作了说明。最后，ID 行还给出目标序列的分类分区（INV，表示无脊椎动物；见 Internet Resources）及其长度（2881 个碱基对）。登录号也会单独出现在紧随 ID 行之后的 AC 行中。

Box 1.1 核苷酸数据库中的功能分区

将核苷酸序列记录组织为彼此分离的功能类型，使用户能够查询这些数据库中特定的记录子集。此外，如果知道某条序列来自某个以特定技术为导向的数据库，用户就可以从适当的生物学角度解释这些数据。下面介绍其中几个分区。每类功能分区的示例（ENA 称之为“数据类别”）可通过本章 Internet Resources 部分列出的 ENA Data Formats 页面中的示例链接查看。

CON

由全基因组测序工作产生的染色体、基因组和其他长 DNA 序列的构建记录（或“contigged”记录）。这一分区中的记录不包含序列数据；相反，它们包含的是组装指令，用于说明如何组装多个数据库记录中的序列数据。

EST

Expressed Sequence Tags，表达序列标签。这些记录包含来自 mRNA（cDNA）的短单次读取序列，长度通常为 300-500 bp，且通常会大量产生。EST 代表给定组织或给定发育阶段中表达情况的一个快照。它们是给定 cDNA 文库中表达的标签，其中有些编码蛋白，有些则不编码。

GSS

Genome Survey Sequences，基因组调查序列。它与 EST 分区类似，但这些序列来源于基因组。GSS 分区包含但不限于：单次通过读取的基因组调查序列、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC）或酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC）的末端序列、外显子捕获的基因组序列，以及 Alu 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）序列。

HTG

High-Throughput Genome sequences，高通量基因组序列。它们是由高通量测序中心产生的未完成 DNA 序列，会以加速方式提供给科学界，用于同源性和相似性搜索。这一分区中的条目包含关键词，用来指示其在测序流程中所处的阶段。HTG 序列一旦完成，就会被移入相应的数据库分类分区。

STD

包含一条标准的、已注释并已组装序列的记录。

STS

Sequence-Tagged Sites，序列标签位点。这类序列较短，长度为 200-500 bp，是操作上唯一的序列，可识别 PCR 实验中使用的一组引物对，从而生成一种能够定位到基因组中单一位置的试剂。STS 分区旨在促进 STS 与其他分区中序列之间的交叉比较，以便将匿名序列的图谱位置与已知基因关联起来。

WGS

Whole-Genome Shotgun sequences，全基因组鸟枪法序列。它们是采用鸟枪法策略的项目所产生的序列数据。这类项目会生成大量短序列读段，随后可由计算机算法将这些读段组装为序列重叠群（contigs）、更高阶的脚手架序列（scaffolds），有时还可以组装为接近染色体长度或达到染色体长度的序列。

ID 行之后是一个或多个日期行（以 DT 表示），用于说明该条目最初创建或最后更新的时间。对于我们关注的这条序列，该条目最初创建于 1996 年 5 月 19 日，并于 2017 年 6 月 23 日在 ENA 中最后更新：

DT
19-MAY-1996 (Rel. 47, Created)
DT
23-JUN-2017 (Rel. 133, Last updated, Version 5)

每一行中的 release number 表示该条目创建或最后更新之后的第一个季度发布版本。条目的版本号出现在第二行，使用户能够很容易地判断自己查看的是否是某条特定序列的最新记录。请注意，这不同于前面描述的 accession.version 格式：记录中的某些元素可能发生了变化，但序列本身可能保持不变，因此这两种不同类型的版本号并不总是彼此对应。

header 的下一部分包含 definition lines，用于简明描述该记录中包含的生物学信息类型。definition line 在 ENA 中标记为 DE，在 DDBJ/GenBank 中标记为 DEFINITION，其形式如下。

DE
Drosophila melanogaster eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) gene,
DE
complete cds, alternatively spliced.

生成这些 definition lines 时需要非常谨慎。虽然许多 definition lines 可以由记录中的其他部分自动生成，但仍会经过人工审查，以确保信息的一致性和丰富度。显然，想用一行文本捕捉一条序列背后的全部生物学信息是不可能的；不过，同一条记录后续部分很快就会给出这些丰富的信息。

沿着 flatfile 记录继续往下看，可以看到目标序列的完整分类学信息。OS 行（在 DDBJ/GenBank 中为 SOURCE 行）给出该序列来源物种的首选科学名称，后面用括号给出生物体的常用名称。OC 行（在 DDBJ/GenBank 中为 ORGANISM 行）包含来源生物体的完整分类学分类。分类信息按照自上而下的方式列出，就像分类树中的节点一样，最一般的类群（Eukaryota，真核生物）排在最前面。

OS
Drosophila melanogaster (fruit fly)
OC
Eukaryota; Metazoa; Ecdysozoa; Arthropoda; Hexapoda; Insecta; Pterygota;
OC
Neoptera; Holometabola; Diptera; Brachycera; Muscomorpha; Ephydroidea;
OC
Drosophilidae; Drosophila; Sophophora.

每条记录都必须至少包含一条参考文献或引用，记录在所谓的 reference blocks 中。这些 reference blocks 用于给予科学贡献归属，并提供背景，说明为什么要测定这条特定序列。reference blocks 的形式如下。

RN
[1]
RP
1-2881
RX
DOI; .1074/jbc.271.27.16393.
RX
PUBMED; 8663200.
RA
Lavoie C.A., Lachance P.E., Sonenberg N., Lasko P.;
RT
"Alternatively spliced transcripts from the Drosophila eIF4E gene produce
RT
two different Cap-binding proteins";
RL
J Biol Chem 271(27):16393-16398(1996).
XX
RN
[2]
RP
1-2881
RA
Lasko P.F.;
RT
;
RL
Submitted (09-APR-1996) to the INSDC.
RL
Paul F. Lasko, Biology, McGill University, 1205 Avenue Docteur Penfield,
RL
Montreal, QC H3A 1B1, Canada

在这个例子中显示了两条参考信息，一条指向已发表的论文，另一条指向该序列记录本身的提交。上面的第二个 reference block 提供了第一篇论文中资深作者的信息，以及该作者的邮寄地址。虽然第二个 reference block 中的日期说明了该序列（及其附带信息）提交到数据库的时间，但它并不表示该记录首次公开发布的时间，因此不能根据这个日期推断或声称该记录的首次公开发布时间。每当序列更新时，还可以向记录中添加新的提交者信息块。

有些 header 可能包含 COMMENT 行（DDBJ/GenBank）或 CC 行（ENA）。这些行可以包含多种多样的说明和注释（描述符），它们都指向整条记录。基因组中心常常使用这些行提供联系信息并表达致谢。注释还可以包含序列的历史。如果某条记录中的序列被更新，comment 会包含一个指向该记录先前版本的指针。反过来，如果检索到的是较早版本的记录，comment 会指向较新的版本；如果还存在更早的版本，也会向后指向那些版本。最后，还有数据库交叉引用行（标记为 DR），它们提供链接，指向包含目标序列相关信息的关联数据库。在附录 1.1 中这条记录的完整 header 里，可以看到一条指向 FlyBase 的交叉引用。需要注意的是，附录 1.2 中相应的 DDBJ/GenBank header 并不包含这些交叉引用。

The Feature Table

在 INSDC 各合作机构早期协作时，人们就努力寻找一种共同方式，用来表示某一数据库记录中包含的生物学信息。这种共同表示方式称为 feature table，即特征表。它由三类内容组成：feature keys，即特征键，用一个单词或缩写表示所描述的生物学属性；location information，即位置信息，说明该特征位于序列中的什么位置；以及额外的 qualifiers，即限定符，用于提供关于该特征的补充描述信息。INSDC 在线 feature table 文档非常详尽，详细说明了允许使用哪些特征，以及每一种特征可以搭配哪些限定符。feature table 中的措辞会尽可能采用常见的生物学研究术语，并且在 DDBJ、ENA 和 GenBank 条目之间保持一致。

这里我们将解析来自 Drosophila melanogaster 的 eukaryotic transcription factor 4E 基因的 feature table。该表在附录 1.3（ENA 格式）和附录 1.4（DDBJ/GenBank 格式）中均完整给出。这条特定序列存在可变剪接，产生两个不同的基因产物：4E-I 和 4E-II。feature table 中的第一个信息块始终是 source feature，它指出序列的生物学来源，以及与整条序列相关的补充信息。所有 INSDC 条目都必须包含这个 feature，因为所有 DNA 或 RNA 序列都来源于某种具体的生物学来源，包括合成 DNA。

FT
source
1..2881
FT
/organism="Drosophila melanogaster"
FT
/chromosome="3"
FT
/map="67A8-B2"
FT
/mol_type="genomic DNA"
FT
/db_xref="taxon:7227"
FT
gene
80..2881
FT
/gene="eIF4E"

在 source key 的第一行中，请注意其编号方式：它用两个由两个点分隔的数字（1..2881）表示该 feature key 覆盖的位置范围。由于 source key 涉及整条序列，因此可以推断，这个条目所描述的序列长度为 2881 个核苷酸。表 1.1 展示了表示任一特征位置的多种方式，这些方式能够覆盖范围很广的生物学场景。随后出现的是限定符，每个限定符前面都有一个斜杠。这里给出了该生物体的完整科学名称，也给出了具体的图谱坐标，说明这条序列位于 3 号染色体的 67A8-B2 图谱位置。同时还指出了被测序的分子类型（genomic DNA）。最后一行表示一个数据库交叉引用，缩写为 db_xref，指向 NCBI taxonomy database；其中 taxon 7227 对应 D. melanogaster。一般来说，这些交叉引用是受控限定符，允许条目通过外部数据库中唯一的标识符连接到外部数据库。在上面的 source block 之后是 gene feature，它表明该基因本身是此条目中整条序列的一个子集，起始于位置 80，终止于位置 2881。

FT
mRNA
join(80..224,892..1458,1550..1920,1986..2085,2317..2404,
FT
2466..2881)
FT
/gene="eIF4E"
FT
/product="eukaryotic initiation factor 4E-I"
FT
mRNA
join(80..224,1550..1920,1986..2085,2317..2404,2466..2881)
FT
/gene="eIF4E"
FT
/product="eukaryotic initiation factor 4E-II"

Table 1.1 feature table 中位置的表示方式

本例中的下一个 feature 指出哪些区域构成该基因的两个 mRNA 转录本：第一个对应 eukaryotic initiation factor 4E-I，第二个对应 eukaryotic initiation factor 4E-II。在第一种情况（如上所示）中，join 行表示 6 个不同的 DNA 片段被转录形成成熟 RNA 转录本；而在第二种情况中，第二个区域缺失，只有 5 个不同的 DNA 片段被转录为成熟 RNA 转录本。因此，这个分子最终编码出两个剪接变体。

FT
CDS
join(201..224,1550..1920,1986..2085,2317..2404,2466..2629)
FT
/codon_start=1
FT
/gene="eIF4E"
FT
/product="eukaryotic initiation factor 4E-II"
FT
/note="Method: conceptual translation with partial peptide
FT
sequencing"
FT
/db_xref="GOA:P48598"
FT
/db_xref="InterPro:IPR001040"
FT
/db_xref="InterPro:IPR019770"
FT
/db_xref="InterPro:IPR023398"
FT
/db_xref="PDB:4AXG"
FT
/db_xref="PDB:4UE8"
FT
/db_xref="PDB:4UE9"
FT
/db_xref="PDB:4UEA"
FT
/db_xref="PDB:4UEB"
FT
/db_xref="PDB:4UEC"
FT
/db_xref="PDB:5ABU"
FT
/db_xref="PDB:5ABV"
FT
/db_xref="PDB:5T47"
FT
/db_xref="PDB:5T48"
FT
/db_xref="UniProtKB/Swiss-Prot:P48598"
FT
/protein_id="AAC03524.1"
FT
/translation="MVVLETEKTSAPSTEQGRPEPPTSAAAPAEAKDVKPKEDPQETGE
FT
PAGNTATTTAPAGDDAVRTEHLYKHPLMNVWTLWYLENDRSKSWEDMQNEITSFDTVED
FT
FWSLYNHIKPPSEIKLGSDYSLFKKNIRPMWEDAANKQGGRWVITLNKSSKTDLDNLWL
FT
DVLLCLIGEAFDHSDQICGAVINIRGKSNKISIWTADGNNEEAALEIGHKLRDALRLGR
FT
NNSLQYQLHKDTMVKQGSNVKSIYTL"

mRNA feature 之后是上面所示的 CDS feature，它描述最终编码蛋白质产物的区域。只看 eukaryotic initiation factor 4E-II，CDS feature 也显示了一个 join 行，其坐标与 mRNA feature 中显示的坐标略有不同，差异尤其体现在起始位置和终止位置。原因在于，5′ 和 3′ untranslated regions（UTRs，非翻译区）包含在 mRNA feature 中，但不包含在 CDS feature 中。CDS feature 对应于翻译后蛋白质产物中的氨基酸序列，该序列显示在上面的 /translation 限定符中。/codon_start 限定符表示，第一个密码子的氨基酸翻译从这一连接区域的第一个位置开始，没有偏移。

/protein_id 限定符显示蛋白质数据库中相应条目的登录号（AAC03524.1），并带有超链接，使用户能够直接进入该条目。这些唯一标识符采用“3 + 5”格式，即三个字母后接五个数字。版本号由后面的十进制小数表示；当记录中的蛋白质序列发生变化时，版本号递增 1。为基因产物或蛋白质指定名称（通过 /protein 限定符）往往带有主观性，有时是根据其与其他序列之间较弱的相似性来指定的，而那些其他序列本身有时也注释不佳。由于低质量注释可能会传递式扩散（也就是说，坏数据往往会产生更多坏数据），因此建议用户查阅经过人工审查的核苷酸和蛋白质序列数据库，以获得关于某条序列推定功能的最新、准确信息。最后，请注意 /db_xref 限定符通过大量交叉引用，链接到 InterPro、Protein Data Bank（PDB）和 UniProtKB/Swiss-Prot 中的条目，以及 Gene Ontology annotation（GOA；Gene Ontology Consortium 2017）。

当记录中存在 CDS feature 时，source feature 及其指定的生物体隐含了用于将核酸序列翻译为蛋白质序列的遗传密码。此外，这些 feature table 以 DNA 为中心，这意味着所有特征都是通过 DNA 坐标系统进行定位的，而不是通过氨基酸参考点来定位；附录 1.3 和附录 1.4 中的示例体现了这一点。

SQ
Sequence 2881 BP; 849 A; 699 C; 585 G; 748 T; 0 other;
cggttgcttg ggttttataa catcagtcag tgacaggcat ttccagagtt gccctgttca
60
acaatcgata gctgcctttg gccaccaaaa tcccaaactt aattaaagaa ttaaataatt
120
cgaataataa ttaagcccag taacctacgc agcttgagtg cgtaaccgat atctagtata
180
.
. <truncated for brevity>
.
aaacggaacc ccctttgtta tcaaaaatcg gcataatata aaatctatcc gctttttgta
2820
gtcactgtca ataatggatt agacggaaaa gtatattaat aaaaacctac attaaaaccg
2880
g
2881
//

最后，在每条核苷酸序列记录的末尾，都可以看到实际的核苷酸序列，每行 60 个碱基。请注意，标志着记录这一部分开始的 SQ 行不仅提供了序列的总长度，还给出了每一种核苷酸碱基的数量，因此可以很容易地计算这条序列的 GC 含量。

第 1 章 Biological Sequence Databases

Graphical Interfaces

为了帮助解释基于文本的 flatfile 中包含的数据，研究者开发了图形界面。图 1.1 展示了我们关注的序列（U54469.1）对应 ENA 记录的图形视图示例。当 feature table 中记录了很长一列生物学特征时，这类图形视图尤其有用，因为它能帮助用户直观看到不同生物学特征之间潜在的相互作用或关系。第 2 章关于 NCBI Entrez discovery pathway 的讨论，以及本章后面的内容，还会提供使用图形视图辅助解释数据库记录信息的其他示例。

Figure 1.1

ENA 记录 U54469.1 的登录页面，提供了 Drosophila melanogaster eukaryotic initiation factor 4E（eIF4E）基因序列中生物学特征的图形视图。图形视图中的 tracks 显示了该记录所报告的 2881 bp 序列中，基因、mRNA 和编码区（标记为 CDS）的位置。

图像资产：

第 1 章 Biological Sequence Databases

Box 1.2 RefSeq

本书前几章将介绍序列数据和序列注释进入公共数据库的多种途径。系统性测序项目产生的数据，与单个研究者实验室产生的数据结合在一起，形成了一套丰富且极具价值的序列数据资源；但与此同时，也出现了一些明显的问题。最重要的问题是，同一个生物学实体可能在不同数据库中由许多不同条目表示。此外，有时也并不清楚某条序列究竟是通过实验测定得到的，还是仅仅来自计算预测。

为了解决这些问题，NCBI 开发了 RefSeq 项目。该项目的主要目标，是为中心法则中的每一类分子（DNA、mRNA 和蛋白质）提供一条参考序列。由于每个生物学实体只被表示一次，RefSeq 按定义就是非冗余的。RefSeq 中的核苷酸序列和蛋白质序列彼此之间有明确链接。最重要的是，RefSeq 条目会持续接受人工审查，从而保证 RefSeq 条目能够代表关于某条特定 DNA、mRNA 或蛋白质序列的最新知识状态。

RefSeq 条目通过一套独立的登录号系列，与 GenBank 中的其他条目区分开来。RefSeq 登录号遵循“2 + 6”格式：先是一个表示参考序列类型的双字母代码，随后是一个下划线和一个六位数字。通过实验测定得到的序列数据表示如下：

NT_123456
Genomic contigs (DNA)
NM_123456
mRNAs
NP_123456
Proteins

通过基因组注释工作推导得到的参考序列表示如下：

XM_123456
Model mRNAs
XM_123456
Model proteins

理解“N”编号和“X”编号之间的区别很重要：前者表示真实的、通过实验测定得到的序列，而后者表示从原始 DNA 序列推导出的计算预测结果。

更多类型的 RefSeq 条目，以及关于 RefSeq 项目的更多信息，可以在 NCBI RefSeq 网站上找到。

第 1 章 Biological Sequence Databases

Protein Sequence Databases

随着原核生物和真核生物众多完整基因组序列的可用，研究者正投入大量精力来鉴定这些基因组所编码的蛋白质，并分析它们的功能。这些蛋白质的大规模分析持续产生海量数据，其中包括蛋白质组学方法（第 11 章）和蛋白质结构分析（第 12 章）等方法所产生的数据，只是其中几个例子。这些方法及其他类似方法使得人们能够迅速鉴定大量蛋白质，绘制它们之间的相互作用（第 13 章），确定它们在细胞中的位置，并分析它们的生物学活性。这一不断增长的“信息空间”进一步强化了蛋白质序列数据库的核心地位：这些数据库承担着存储这些努力所产生数据的任务，并将其免费提供给生命科学社区。

由于蛋白质数据库中的大多数序列数据都来源于核苷酸序列的翻译，因此在很大程度上可以把它们视为“二级数据库”。通用蛋白质序列数据库涵盖所有物种的蛋白质，而专门的蛋白质序列数据库则聚焦于特定蛋白家族、蛋白群或某个特定生物体。具有代表性的模式生物数据库包括 Mouse Genome Database（MGD；Smith et al. 2018）和 WormBase（Lee et al. 2018）等（Baxevanis and Bateman 2015; Rigden and Fernández 2018）。关于生物体序列数据库的内容将在第 2 章更详细讨论。

通用蛋白质数据库还可以进一步分为两大类：序列库，即数据几乎不经过人工干预或几乎不经人工干预即存储的数据库；以及人工审查数据库，即专家通过专业人工审查对原始数据进行增强。确保互操作性、建立并实施标准、采用旨在准确表示序列数据库中生物学知识的最佳实践，其重要性无论怎样强调都不为过。事实上，这些审查目标如此重要，以至于还有一个名为 International Society for Biocuration 的组织，其主要使命就是推进这些核心原则。

第 1 章 Biological Sequence Databases

The NCBI Protein Database

NCBI 维护着 Protein database，其内容来源于多个不同来源。其中包括上文所述的 INSDC 数据库中已注释编码区的翻译结果、RefSeq（Box 1.2），以及 NCBI 的 Third Party Annotation（TPA）数据库。TPA 数据集本身就很有意思，因为它收录了由科学界提供的实验数据和推断数据，用于补充 INSDC 核苷酸条目中的信息。顾名思义，TPA 中的信息由第三方提供，而不是由对应 INSDC 条目的原始提交者提供。NCBI Protein database 还包括来自非 NCBI 来源的其他蛋白质序列数据，例如 Swiss-Prot、PIR、PDB 和 Protein Research Foundation。关于如何对 NCBI Protein database 执行检索的逐步方法，将在第 3 章中详细介绍。

第 1 章 Biological Sequence Databases

UniProt

数据仓库固然是科学家尽可能快速获取序列数据的重要途径，但显然，如果再加入来自多个高度可信来源的生物学信息，底层序列数据的效力就会大大增强。UniProt Consortium 正是为了实现这一点而成立的，它把 Swiss-Prot、TrEMBL 和 Protein Information Resource Protein Sequence Database 统一纳入一个称为 UniProt 的框架之下（UniProt Consortium 2017）。UniProt 包含三个主要数据库：UniProt Archive，即对来自多种源数据库的所有公开蛋白质序列进行汇编而成的非冗余集合；UniProtKB，它整合了 UniProtKB/Swiss-Prot 和 UniProtKB/TrEMBL 的条目；以及 UniProt Reference Clusters（UniRef），它提供 UniParc 和 UniProtKB 中数据的非冗余视图，并在三个不同的序列一致性水平上进行聚类（Suzek et al. 2015）。

UniProtKB 条目所包含的信息之丰富，最适合通过一个实例来说明。这里我们以人类 heterogeneous nuclear ribonuclear protein A1 的条目为例，其 accession number 为 P09651。使用该 accession number 作为检索词搜索 UniProtKB，得到的界面如图 1.2 所示。左侧栏下半部分显示了该蛋白可用的信息类型，用户可以根据自己的兴趣选择或取消选择相应部分。窗口的主体部分提供该序列的基本识别信息，并指出该条目是否已由 UniProtKB 人工审查人员手工审查和注释。这里我们可以看到，这一条目确实已经经过审查，而且有实验性证据支持该蛋白的存在。文件中的下一部分用于传达功能信息，同时给出与该条目相关的 Gene Ontology（GO）术语，以及指向 Reactome 等酶和通路数据库的链接（见第 13 章）。点击左侧栏中的任意蓝色块，用户就会跳转到条目的相应部分。例如，如果点击 Subcellular location，便会得到图 1.3 所示的视图，其中展示了一个颜色编码的细胞示意图，说明注释类型（人工或自动），并提供支持该注释的文献链接。图 1.3 的下半部分还显示了该蛋白与疾病相关的信息，记录了与早发型 Paget 病和肌萎缩侧索硬化症相关的变体（Kim et al. 2013; Liu et al. 2016）。

在 UniProtKB 窗口的左上角，有一些显示选项，对于可视化该条目 feature table 中的大量数据非常有用。点击 Feature viewer 后，会出现图 1.4 所示的视图，以坐标化方式清晰总结了该序列的注释。任何部分都可以通过点击图形左侧蓝色方框中的标签来展开。这里已经展开了 post-translational modification（PTM）部分，显示该蛋白中修饰残基的位置；点击轨道中的任一标记都会弹出窗口，提供关于该 PTM 的更多信息，以及相关文献链接。

在图 1.5 中，Structural features 和 Variants 两部分也已展开，显示了蛋白内所有 alpha helices、beta strands 和 beta turns 的位置，以及推定具有临床相关性的点突变位置。这里高亮显示的是位置 351 的一个变体；作为 ClinVar project（Landrum et al. 2016）的一部分所识别出的 proline-to-leucine 变体，可能与 relapsing–remitting multiple sclerosis 有关。通过查看这一非常有用的图形显示中的不同部分，用户可以开始看到各类特征如何彼此重叠，这或许能提示一个已知或预测的致病变体是否位于蛋白的某个结构区域内。这些注释和观察可为实验设计和实验数据解释提供重要启发。

Figure 1.2

以 accession number P09651 作为检索词，在 UniProtKB 中搜索人类 heterogeneous nuclear ribosomal protein A1 记录得到的结果。详见正文。

Figure 1.3

UniProtKB 中人类 heterogeneous nuclear ribosomal protein A1 记录的 Subcellular location 和 Pathology & Biotech 部分。点击窗口左侧栏中的蓝色图块即可访问这些部分。详见正文。

Figure 1.4

UniProtKB 中人类 heterogeneous nuclear ribosomal protein A1 记录的 Feature viewer 渲染图。点击窗口左上方的 Display 链接，可以进入 Feature viewer。点击图形左侧蓝色框中的标签，可展开任一部分。详见正文。

Figure 1.5

在 Feature viewer 显示中展开 PTM、Structural features 和 Variants 部分，可以显示人类 heterogeneous nuclear ribosomal protein A1 中所有 post-translational modifications（PTMs）、alpha helices、beta strands 和 beta turns 的位置，以及推定具有临床相关性的点突变位置。点击任一变体会弹出包含更多信息的窗口；这里弹出的窗口提供了该序列 351 位 proline-to-leucine 变体的疾病关联数据。详见正文。

图像资产：

第 1 章 Biological Sequence Databases

Summary

基因组学和蛋白质组学领域的发现速度极快，这要求数据库的构建方式不仅要便于存储这些数据，还要便于对数据库中的信息进行高效处理和检索。几十年来，研究者在如何处理数据库设计和内容方面的关键问题上积累了许多经验，其中不少经验来之不易。因此，持续发展现有数据库，并构想和创建新类型数据库，将成为推动生物学发现进步的关键焦点。正如本章已经清楚展示的那样，保持数据库的及时更新和准确性，是一项需要生物学界积极参与的任务（Box 1.3）。因此，所有用户都有责任以积极方式确保这些数据的准确性，与人工审查人员保持持续对话，使这些被广泛使用的资源能够继续成为全球生物学家的宝贵资源。

Box 1.3 确保公共序列数据库中数据的持续质量

鉴于 DDBJ、EMBL 和 GenBank 承担着维护所有公开 DNA、RNA 和蛋白质序列档案的职责，这一资源能否持续发挥作用，在很大程度上取决于其中数据的质量。尽管一条记录在公开之前会经过高度的人工和自动检查，错误仍然会进入数据库。这些错误可能很轻微，并不产生生物学后果（例如邮政编码错误）；也可能具有误导性（例如某个生物体的属名正确，但种名错误）；甚至可能完全错误（例如一条全长 mRNA 没有标注 CDS）。有时，记录中的参考文献区块也可能不正确，使研究者无法链接到描述该序列的正确出版物。长期以来，许多人已经积极报告这些错误；但更多时候，这些错误仍未得到纠正。

虽然 INSDC 的各个成员负责托管和传播其数据库中的数据，但请记住，数据的所有权属于最初提交者，而只有这些最初提交者（或其指定人员）才能更新自己的数据库记录。为了尽可能保持这些社区资源的准确和及时更新，用户在工作中使用数据库时，如果发现任何错误，都被积极鼓励报告出来，以便数据库管理员能够在适当情况下与最初提交者跟进。

下面列出的是目前向三大序列数据库提交错误信息的电子邮件地址。由于所有数据库每晚都会相互共享信息，因此只需要向联盟中的任意一个成员报告错误即可。作者也被积极鼓励定期检查自己的记录，以确保他们此前提交的信息仍然准确。虽然这里是在三大序列数据库的背景下讨论这一社区责任，但所有数据库都提供类似机制，使错误信息能够被提交给数据库管理员。

DDBJ

ddbjupdt@ddbj.nig.ac.jp

EMBL

datasubs@ebi.ac.uk

GenBank

gb-admin@ncbi.nlm.nih.gov

如上所述，公开可用数据的范围显然远远超出人类数据，也并不限于序列类数据。由于主要公共序列数据库需要以相当通用的方式存储数据，这些数据库往往并不包含某些生物学群体所感兴趣的更专门类型的信息。为了解决这一问题，许多较小的专业数据库应运而生，并由身处“一线”的生物学家开发和人工审查，以满足特定需求。这些数据库包含的信息从品系杂交到基因表达数据不等，是对那些更广为人知的公共序列数据库的重要补充；也鼓励用户明智地同时使用这两类数据库。此类数据库的带注释清单可见于 Nucleic Acids Research 每年出版的 Database 专刊（Rigden and Fernández 2018）。

本章之所以放在本书开头，是因为本书认为，理解生物学数据库，是能够开展稳健、准确的生物信息学分析的第一步。强烈建议读者花时间理解这些数据库中数据的结构，因为这是寻找感兴趣序列数据，并开展后续章节所述更高级分析的基础。

第 1 章 Biological Sequence Databases

Acknowledgments

作者感谢 Rolf Apweiler 允许使用本书第三版中的材料。

Internet Resources

DDBJ 数据库分部

www.ddbj.nig.ac.jp/ddbj/data-categories-e.html

日本 DNA 数据库（DDBJ）

www.ddbj.nig.ac.jp

EMBL 核苷酸序列数据库

www.embl.org

ENA 数据格式

www.ebi.ac.uk/ena/submit/data-formats

欧洲生物信息学研究所

www.ebi.ac.uk

GenBank

www.ncbi.nlm.nih.gov

GenBank 数据库分部

www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/htgs/divisions

Genome Ontology Consortium

geneontology.org

INSDC Feature Table 定义

insdc.org/documents/feature_table.html

International Society for Biocuration

biocuration.org

NCBI 数据模型

www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/ToolBox/SDKDOCS/DATAMODL.HTML

NCBI Protein Database

www.ncbi.nlm.nih.gov/protein

Nucleic Acids Research Database 专刊

academic.oup.com/nar

Protein Data Bank（PDB）

www.rcsb.org

Protein Identification Resource（PIR）

pir.georgetown.edu

Protein Research Foundation

www.proteinresearch.net

RefSeq

www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq

Swiss-Prot（EBI）

www.ebi.ac.uk/uniprot

Swiss-Prot（ExPASy）

web.expasy.org/docs/swiss-prot_guideline.html

UniProt Consortium

www.uniprot.org

第 1 章 Biological Sequence Databases

Further Reading

Bairoch, A. (2000). Serendipity in bioinformatics: the tribulations of a Swiss bioinformatician through exciting times! Bioinformatics. 16: 48-64.

这是一篇个人叙事，讲述序列数据库及相关软件工具发展的早期历史；这些事件为现代生物信息学格局奠定了基础。

Green, E.D., Rubin, E.M., and Olson, M.V. (2017). The future of DNA sequencing. Nature. 550: 179-181.

这是一篇富有洞见的观点文章，讨论未来几十年 DNA 测序方法将在新语境中的应用，以及这些应用对数据存储和数据共享问题的影响。

Rigden, D.J. and Fernández, X.M. (2018). The 2018 Nucleic Acids Research database issue and the online molecular biology database collection. Nucleic Acids Res. 46: D1-D7.

这是 Nucleic Acids Research 每年出版的 Database 专刊的第 25 篇概览，呈现了面向研究社群公开可用的各类生物信息学数据库。该概览每年更新，描述这些数据库资源的各篇论文可通过 Nucleic Acids Research 网站免费获取。

第1章 生物序列数据库

参考文献

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Bairoch, A. (2000). 生物信息学中的意外发现：一位瑞士生物信息学家在激动人心时代的艰辛历程！Bioinformatics. 16:48-64.

Baxevanis, A.D. and Bateman, A. (2015). 生物数据库在生物学发现中的重要性。Curr. Protoc. Bioinf. 50:1.1.1-1.1.8.

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Dayhoff, M.O., Eck, R.V., Chang, M.A., and Sochard, M.R. (1965). 蛋白质序列与结构图谱。Silver Spring, MD: National Biomedical Research Foundation.

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本章由 Andreas D. Baxevanis 博士以私人身份撰写。美国国立卫生研究院或美国卫生与公众服务部不为此提供任何官方支持或认可，也不应据此推断。

2 信息检索：从生物数据库中获取信息

引言

2003 年 4 月 14 日，生物学界庆祝人类基因组计划主要目标的达成：以完整、准确且高质量的方式完成人类基因组测序（International Human Genome Sequencing Consortium 2001; Schmutz et al. 2004）。许多人将这一成就与人类登月相提并论；它深刻改变了生物医学研究的开展方式，并且无疑仍将在未来持续影响这一领域的发展方向。人类基因组数据、人类序列变异数据、模式生物序列数据，以及关于基因结构和功能的信息，共同为生物学家更好地设计和解释实验室实验提供了丰厚基础，也兑现了生物信息学促进并加速生物学发现的承诺。

对生物学家而言，最重要的数据库之一是 GenBank——一个带有注释、收录所有公开可用 DNA 和蛋白质序列的集合（Benson et al. 2017；见第 1 章）。该数据库由美国国立卫生研究院（NIH）下属的美国国立生物技术信息中心（NCBI）维护，是 NCBI、欧洲分子生物学实验室（EMBL）和日本 DNA 数据库（DDBJ）协作的成果。本书撰写时，GenBank 已包含超过 2 亿条序列和超过 300 万亿个核苷酸碱基。人类基因组测序的完成、不断扩大的模式生物基因组测序，以及总体上急剧增长的序列数据，为生物科学家提供了非凡机会，因为这些数据本身具有巨大的内在价值。但与此同时，对缺乏经验的用户来说，如此庞大的数据体量也构成了难题——不仅因为“序列信息空间”规模巨大，也因为即便人类基因组测序早已“完成”，这个信息空间仍在以飞快且持续加速的速度扩张。

GenBank 的增长情况（图 2.1）清楚显示了人类基因组计划和其他系统性测序项目对序列数据持续积累的影响；图中所示的指数增长预计在未来一段时间内仍将持续。“序列空间”在不断扩张，由此产生的海量生物数据也同样迅速增长。这一事实凸显出所有生物学家都需要学习如何有效导航这些信息：既要在自己的工作中高效利用这些数据，也要在可能的情况下，基于这些虚拟宝库中已有的数据避免开展昂贵而重复的实验。

如果 GenBank（或任何其他生物数据库）中的数据不能被方便地检索，条目也不能以有用而有意义的格式获取，那么它几乎没有实际价值。否则，上述测序工作就无法真正发挥作用：没有有效的搜索和检索工具，整个生物学界既无法利用隐藏在数十亿碱基和氨基酸中的信息，也无法利用这些分子形成的结构或其中携带的突变信息。为使这些数据能被生物学家实际访问和使用，研究界已经投入了大量努力；本章关注的正是这些努力所产生的程序和界面。本章讨论将以 NCBI 维护的数据库查询为中心，因为这些较为“通用”的数据存储库是生物学家最常访问的资源；同时，本章也会介绍一些专门数据库，它们提供的信息未必能通过 Entrez——NCBI 的综合信息检索系统——获得。

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图 2.1 GenBank 的指数增长（以核苷酸数量——方块，单位为十亿，和提交的序列数量——圆圈，单位为千计）。图的数据来源获取自美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站。请注意，1997 年后加速增长的时期恰逢人类基因组计划的遗传和物理作图目标的完成，为高准确性、高通量测序以及新技术开发奠定了基础（Collins et al. 1998, 2003; Green et al. 2011）。

集成信息检索：Entrez 系统

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概述

Entrez 是 NCBI 维护的集成信息检索系统，它充分利用了多个公共数据库条目之间既有的逻辑关系。例如，PubMed 中的一篇论文可能描述了某个基因的测序，而该基因的序列则收录在 GenBank 中；这段核苷酸序列进一步编码一种蛋白质产物，而其序列存储在 NCBI 的蛋白质数据库中；该蛋白质的三维结构可能已经解析，其坐标可能出现在 NCBI 的 Structure 数据库中；最后，该基因还可能存在等位基因或结构变异记录，分别编目于 dbSNP 或 dbVar 等数据库。正是这些具有生物学基础的自然联系，促使人们开发出一种方法，使用户不必逐个访问和查询各个数据库，也能找到关于某一特定生物实体的全部相关信息。

Entrez 本身并不是一个数据库，而是一个接口；通过这个接口，用户可以访问并遍历其组成数据库，因此它是一个集成信息检索系统。Entrez 信息空间包括 PubMed 记录、核苷酸和蛋白质序列数据、保守蛋白质域信息、三维结构信息，以及具有潜在临床意义的基因组变异数据；本章将讨论其中相当一部分。Entrez 的优势在于，用户只需提交一个——也就是仅仅一个——查询，就可以跨大量组成数据库访问这些信息。这种非常强大的集成方法，是通过两类数据库条目连接实现的：邻近关系（neighboring）和硬链接（hard links）。

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数据库条目之间的关系：邻近关系

邻近关系这一概念，使同一数据库内部的条目能够彼此关联。如果用户正在查看某个 PubMed 条目，就可以让 Entrez “查找” PubMed 中与原始论文主题相似的所有其他论文。同样，如果用户正在查看一个序列条目，Entrez 也可以返回与原始序列相似的其他序列。数据库内邻近关系的建立基于统计相似性度量，其中一些度量将在下文更详细地说明。虽然“邻近”一词传统上用于描述这些连接，但在 NCBI 网站的当前术语中，邻近条目被称为“相关数据”。

BLAST 生物序列相似性通过 Basic Local Alignment Search Tool（即 BLAST；Altschul 等，1990）检测和比较。该算法试图找出高评分片段对（high-scoring segment pairs）——可相互比对且比对后符合特定评分和统计学标准的序列对。第 3 章将详细讨论 BLAST 算法家族及其应用。

VAST 分子结构相似性通过一种基于向量的方法来检测，该方法称为 VAST（Vector Alignment Search Tool，向量比对搜索工具；Gibrat 等，1996）。VAST 使用几何标准评估三维结构域之间的相似性，其比较过程包括三个主要步骤：

• 首先，基于已知的三维坐标数据，识别构成每个蛋白质结构核心的 α 螺旋和 β 折叠。然后，根据这些二级结构元素的位置计算直线向量。VAST 追踪每个向量如何连接到下一个向量（即一个向量的 C 端如何连接到下一个向量的 N 端），以及每个向量代表 α 螺旋还是 β 折叠。后续比较步骤仅使用这些向量来评估与其他蛋白质的结构相似性——因此，实际上大部分费力推导出的原子坐标数据在这一步被丢弃。这种明显简化的原因仅仅是问题规模：截至本文撰写时，分子建模数据库（MMDB；Madej 等，2014）中已有约 15 万个结构，如果要将每个结构与 MMDB 中的所有其他结构进行深入比较，所需时间将使计算变得既不切实际也不可行。

• 其次，算法尝试最佳对齐这些向量组，寻找类型和相对方向相同且各元素间连接性一致的二级结构对。其目标是识别高度相似的"核心亚结构"——代表统计显著匹配的对，其匹配程度高于随机选择的两蛋白进行比较所能获得的匹配程度。

• 最后，使用蒙特卡罗（随机搜索）方法在每个残基位置进行细化，以优化结构对齐。最终对齐无需全局对齐，因为匹配可能涉及被比较蛋白质的各个结构域。

2014 年，VAST 引入了一项重大改进。这种新方法称为 VAST+（Madej 等，2014），不再局限于通过比较各个三维域来评估结构相似性；相反，它考虑大分子复合物内的整套三维域。这种方法实质上将比较从三级结构层面提升到四级结构层面，能够识别相似的功能多亚基组装体。在 VAST+ 的术语中，大分子复合物被称为"生物单元"（biological unit），不仅包括构成该复合物的蛋白质，还包括有结构信息可用的核苷酸和化学物质。VAST+ 比较从 VAST 描述的步骤开始，然后经过多个步骤：识别可叠加的生物单元、计算叠加结构的均方根偏差（RMSD）作为叠加的定量度量，最后执行细化步骤以改善叠加的 RMSD 值。该过程的结果是获得全局结构对齐，可以识别被比较分子的相似和差异部分；从生物学角度，可以促进形状相似蛋白质之间的比较；也可用于研究单个复合物在不同条件下的构象变化。虽然 VAST+ 现在是 Entrez 系统中识别结构邻近的默认方法，但需注意该算法依赖于 PDB 坐标数据记录中明确标识的生物单元——这些记录是 MMDB 记录的基础；如果没有定义此类生物单元，则使用原始 VAST 算法进行比较。

通过使用 VAST 和 VAST+ 等方法，可以发现在仅查看序列相似性时可能无法提示关联的蛋白质之间的关系——这些信息可与额外数据和见解结合，用于帮助推断功能相似性。关于基于 X 射线或核磁共振（NMR）坐标数据的其他结构预测方法的更多信息，请参见第 12 章。

加权关键词项 与比较 PubMed 条目相比，比较序列或结构数据反而显得相对直接；PubMed 条目由自由文本组成，其语法规则并不总是固定。由于不同作者的写作风格不可能完全相同，如何比较表面上差异很大的文本块，是一个相当棘手的问题。Entrez 采用一种称为相关对检索模型的方法来进行此类比较，该模型基于加权关键词项（Wilbur and Coffee 1994；Wilbur and Yang 1996）。这一概念最好通过例子来说明。考虑两篇手稿，其标题如下：

• BRCA1 as a Genetic Marker for Breast Cancer
• Genetic Factors in the Familial Transmission of the Breast Cancer BRCA1 Gene

两个标题都包含 BRCA1、Breast 和 Cancer 这三个词，这些共同词的存在可能表明这两份手稿的主题相似。还考虑词之间的接近程度，因此两个记录中共同的、彼此接近的词比彼此距离较远的共同词得分更高。在上述例子中，Breast 和 Cancer 两个词总是相邻出现，因此根据接近度得分会高于其中任一词与 BRCA1 的得分。标题中发现的常用词比摘要正文中发现的常用词得分更高，因为标题词被认为比摘要正文中的词"更重要"。总体而言，加权取决于某个词在 PubMed 所有条目中出现频率的倒数，数据库中不常出现的词被赋予较高权重，而常用词则被降低权重。

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硬链接

硬链接的概念比上述邻近方法简单直接得多。硬链接用于连接不同数据库中的条目；只要条目之间存在逻辑关联，就可以建立硬链接。例如，如果一个 PubMed 条目描述了包含感兴趣基因的染色体区域的测序，则在 PubMed 条目和该基因对应的核苷酸条目之间建立硬链接。如果该基因中的开放阅读框编码已知蛋白质，则在核苷酸条目和蛋白质条目之间建立硬链接。如果蛋白质条目具有实验推导的结构，则在蛋白质条目和结构条目之间放置硬链接。

在 Entrez 生态系统中，搜索可以从任何地方开始——对用户进入该信息空间没有限制。然而，根据用作起点的数据库不同，可用于搜索的数据库字段也不同。这不难理解，因为不同数据库中的条目必然以不同方式组织，反映了每个数据库试图编目的生物实体的本质。

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Entrez 发现路径

说明 Entrez 系统集成特性，并突出邻近关系强大之处的最佳方式，是借助一些具体的生物学实例。查询 Entrez 最简单的方法是使用单独的搜索词，并通过 AND、OR 或 NOT 等布尔运算符连接。考虑一个需要检索关于名为 DCC（deleted in colorectal carcinoma，结肠直肠癌缺失基因）的基因的所有可用信息，并将返回的信息限制在作者中有 Guy A. Rouleau 的发表文献的情况。NCBI 主页顶部有一个非常简单的查询界面，允许用户从下拉菜单中选择要搜索的数据库，并在右侧的文本框中输入查询词。在这种情况下，要搜索已发表的论文，应从下拉菜单中选择 PubMed，在右侧的文本框中输入 DCC AND "Rouleau GA" [AU]。[AU] 限定符表示这是作者词，因此 Entrez 仅在评估搜索语句的该部分时考虑条目中的作者字段。查询结果如图 2.2 所示。

表 2.1 Entrez 布尔搜索语句

通用语法：

search term [tag] Boolean operator search term [tag] ...

其中 [tag] =

布尔运算符 = AND、OR 或 NOT

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图 2.2 说明（见原书）

图 2.2 使用布尔运算符和字段限定符对 PubMed 执行基于文本的 Entrez 查询的结果。查询（DCC AND "Rouleau GA" [AU]）显示在窗口顶部的搜索框中，其下方显示使用此查询确定的三个文献。每个条目给出稿件标题、作者姓名和引用信息。点击稿件名称可检索实际记录。

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图 2.2 中显示的查询找到了 PubMed 中匹配该查询的三个条目。用户可以通过添加额外搜索词进一步缩小查询范围——如果用户对该基因的特定方面感兴趣，或者如果初始查询返回的条目实在太多的话。可用字段限定符列表见表 2.1。

对于图 2.2 Summary 视图中显示的每个找到的文献，用户可以看到论文标题、作者和引用。要查看搜索结果中的任何论文，用户只需点击任何超链接标题即可。以第三个参考文献（Srour 等，2010）为例。点击标题会将用户带到图 2.3 所示的 Abstract 视图。该视图提供论文名称、作者列表、机构隶属关系和摘要本身。摘要下方是一条标有"MeSH terms, Substances"的灰色条；点击灰色条末端的加号会显示与稿件相关的编目信息（MeSH terms，医学主题词）和索引物质。可以使用窗口左上角 Format 下拉菜单选择多种显示格式。将显示切换为 MEDLINE 格式会产生 MEDLINE 布局，左侧是每个字段内容对应的双字母代码（例如，作者字段再次用代码 AU 表示）。这种格式的条目列表可以保存到桌面，并轻松导入第三方文献管理程序。

图 2.3 说明（见原书）

图 2.3 通过 Entrez 返回的 PubMed 记录 Abstract 格式示例。该 Abstract 视图对应图 2.2 中显示的第三个参考文献（Srour 等，2010）。该视图通过右侧运行的 Discovery Column 提供相关文章、序列信息和期刊全文的链接。详见正文。

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该窗口右侧的栏目被恰当地命名为 Discovery Column。它不仅提供论文全文版本的访问入口，更重要的是，还包含许多指向该稿件相关附加信息的有用链接。Similar articles 部分提供了用户可以利用前面描述的邻近和硬链接关系的入口点之一，在下面的示例中，我们将多次返回此页面以说明可用信息类型的精选内容。首先，要开始这段旅程，如果用户点击该部分底部的 See all 链接，Entrez 将返回与原始 Rouleau 论文相关的 104 篇参考文献（截至本文撰写时）；其中前六篇如图 2.4 所示。列表中的第一篇论文就是同一个 Rouleau 论文，因为根据定义，它与自身最相关（"父"条目）。后续论文的排列顺序基于统计相似性。因此，与父条目最近的条目被认为在主题上与父条目最接近。通过浏览标题，用户可以轻松找到其他相关研究的信息，也可以快速收集相关参考文献。当撰写基金申请书或论文时，这是一个特别有用且节省时间的功能，因为可以轻松浏览摘要并快速识别真正感兴趣的论文。

图 2.4 说明（见原书）

图 2.4 在 PubMed 中找到的条目的邻近条目。图 2.3 中的原始条目（Srour 等，2010）位于列表顶部，表示这是父条目。通过点击每个条目下方的 Similar articles 链接，可以找到这些论文各自的邻近条目。详见正文。

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回到图 2.3 所示的 Abstract 视图，可以看到 Discovery Column 底部有一系列通往 Entrez 系统内其他数据库的硬链接。这些链接能够把用户直接带到与目标出版物广泛相关的信息页面。在这里，选择 Gene 链接会将用户带到 Entrez Gene，这是 Entrez 的一个功能，提供关于相关基因的大量信息（图 2.5）。数据从多种来源收集，包括 RefSeq。这里我们看到 DCC 是人类 netrin-1 受体的官方符号的蛋白质编码基因。Genomic context 部分表明 DCC 是位于 18q21.2 的蛋白质编码基因。

图 2.5 说明（见原书）

图 2.5 人类 DCC（deleted in colorectal carcinoma）netrin-1 受体的 Entrez Gene 页面。条目表明这是位于 18q21.2 的蛋白质编码基因，并提供了 DCC 的基因组背景信息、替代基因名和编码蛋白信息。此外还提供了指向其他 National Center for Biotechnology Information（NCBI）和外部数据库的广泛链接。详见正文。

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紧接着下方，提供了 DCC 基因的基因组区域、转录本和产物摘要信息，以图形方式呈现并提供基因组坐标。用户可以通过向下滚动 Gene 页面找到图上未显示的其他内容，在那里会找到相关功能信息（如基因表达数据）、相关表型、蛋白质-蛋白质相互作用信息、通路信息、Gene Ontology 注释以及与选定生物体中相似序列的同源信息。Discovery Column 顶部的 Table of Contents 提供这些部分的快捷链接。Discovery Column 进一步下方是指向 NCBI 和其他来源提供的附加资源的广泛链接列表。值得注意的是 SNP:GeneView 链接，将用户带到来自 dbSNP 的数据（图 2.6）。dbSNP 中发现的信息远不止单核苷酸多态性（SNP），还包括短插入和缺失、短串联重复和微卫星等短遗传变异信息。这里，我们将重点放在图 2.6 所示的表格上，这是一种查看单个 SNP 信息的直接方式。每个 SNP 条目占用表格的两行或多行，一行显示 contig 参考序列（较常见的等位基因），另一行或多行显示 SNP（不太常见的等位基因）。

图 2.6 说明（见原书）

图 2.6 单核苷酸多态性数据库（dbSNP）GeneView 页面的部分内容，提供人类 DCC 基因中鉴定出的每个 SNP 的信息。详见正文。

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考虑表格的前三行，显示 contig 参考序列 G，有两个已记录的 SNP，将该位置的 G 变为 A 或 C。在蛋白质水平上，这会将 DCC 蛋白第 2 位的氨基酸从谷氨酸变为赖氨酸（对于 G 到 A 的替换）或变为谷氨酰胺（对于 G 到 C 的替换）。这些行标为红色，因为这些是"非同义 SNP"——即该 SNP 在氨基酸水平上产生离散变化。相反，考虑表格中第一组绿色行，绿色表示这是"同义 SNP"，其中 contig 参考序列（G）和 SNP 等位基因（A）的密码子最终产生相同的氨基酸（Glu）；这并不完全令人惊讶，因为 SNP 位于密码子的摇摆位，遗传密码在那里经常有冗余。关于人类 SNP 的更多信息，请参见第 15 章。

再次从图 2.3 所示的 Abstract 视图开始，可以通过点击右侧 Related information 部分中的 Protein (RefSeq) 链接找到链接到该摘要的 RefSeq 蛋白质序列，产生如图 2.7 所示的视图。请注意，除一个条目外，所有条目都标记为"预测的"；列表中最后一个条目的 accession 编号以 NP 开头，表示包含实验确定或验证的序列（见 Box 1.2）。点击该条目第一行（编号 6）会将用户带到图 2.8 所示的视图，即 netrin 受体——DCC 基因蛋白质产物的 RefSeq 条目。特征表——GenBank 条目中列出该蛋白质序列中每个已记录生物学特征的位置和特征的部分，如翻译后修饰、可识别的重复单元、二级结构区域和临床相关变异——在这种情况下特别长。这使得难以确定各特征之间的相对方向，可能导致用户错过生物学特征之间的重要相互作用或关系。幸运的是，可以通过点击条目顶部的 Graphics 链接访问提供特征表中元素鸟瞰图的查看器，产生如图 2.9 所示的更容易理解的显示。提供了缩放控制，将光标悬停在显示中的任何元素上会产生包含 GenBank 条目中该特征的具体信息的弹出框。

图 2.7 说明（见原书）

图 2.7 RefSeq 蛋白质数据库中对应图 2.3 中原始 Srour 等（2010）条目的条目。可以点击任何 accession 编号访问和检查条目。详见正文。

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图 2.8 说明（见原书）

图 2.8 人类 DCC 基因蛋白质产物 netrin 受体的 RefSeq 条目。条目顶部的 FASTA 链接提供以 FASTA 格式快速访问蛋白质序列，而 Graphics 链接提供图形视图，显示该条目特征表中捕获的所有单个元素（见 图 2.9）。详见正文。

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图 2.9 说明（见原书）

图 2.9 图 2.8 中所示的人类 netrin 受体 RefSeq 条目，现以图形格式呈现。用户只需将光标悬停在显示中的任何元素上，即可了解该视图中的各个元素；右下角的弹出框就是这样一个例子，显示序列第 1267 位磷酸化位点的信息。视图窗口顶部有缩放和导航控制，使用户能够在更广泛的基因组背景下理解该基因。

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从这里，用户还可以通过检查 Discovery Column 中提供的蛋白质结构进入结构领域。点击 See all 9 structures 链接会将用户带到图 2.10 所示的视图，列出与 netrin 受体相关的结构条目。第二个条目是 netrin-1 与 DCC 受体复合物片段的晶体结构（PDB:4URT；Finci 等，2014），点击该条目标题会将用户带到图 2.11 所示的结构摘要页面。从右侧开始，Interactions 窗口显示该生物单元中各元素之间的关系，这里由 netrin-1 蛋白（圆形 A）、DCC 受体（圆形 B）和五个不同的化学实体（菱形 1-5）组成。三维结构显示在左侧面板中，可以通过点击该面板左下角带对角箭头的方块进一步查询结构。此操作将启动 iCn3D（意为"I see in 3-D"），这是一个基于网络的查看器，允许旋转结构、提供颜色和渲染选项以增强可视化，并提供各种附加选项；读者可参考 iCn3D 在线文档了解具体信息。在 4URT 结构摘要页面右上角有一个指向相似结构的链接，由 VAST+ 判定。点击 VAST+ 链接会产生图 2.12 所示的输出，这里显示被认为与查询（4URT）具有相似生物单元的前 10 个（共 256 个）结构；此处显示的表格按所有比对残基的 RMSD（单位为 Å）排序，从最小到最大。

图 2.10 说明（见原书）

图 2.10 与图 2.8 和 2.9 所示的人类 netrin 受体 RefSeq 条目相关的蛋白质结构。每个结构的描述都是超链接的，允许用户访问该条目的结构摘要页面（见 图 2.11）。每个条目下方的单个链接允许快速访问相关结构和蛋白质、保守域信息以及 iCn3D 查看器。

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图 2.11 说明（见原书）

图 2.11 pdb:4URT 的结构摘要页面，即 netrin-1 与 DCC 受体复合物片段的晶体结构（Finci 等，2014）。条目显示相应分子建模数据库（MMDB）条目的头部信息、指向报告该结构的论文的链接以及用于确定该结构的方法（此处为 X 射线衍射，分辨率为 3.1 Å）。

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图 2.12 说明（见原书）

图 2.12 通过 VAST+ 识别与 4URT 相似的结构。前 10 个（共 256 个）具有与查询相似的生物单元的结构。表格按所有比对残基的 RMSD（单位为 Å）排序。

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医学数据库

虽然许多研究人员把注意力集中在基于序列的数据上，但经过编目和组织的序列库并不是唯一对生物医学研究界有用的数据库类型。此类数据库中一个非常重要的例子是在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）。OMIM 是 Victor McKusick 最初于 1966 年创立的人类基因与遗传疾病权威目录的电子版本（McKusick 1966, 1998；Amberger 等，2014）。该数据库由约翰斯·霍普金斯大学医学院编写和维护，基于已发表文献提供简明的文字信息，覆盖大多数具有遗传基础的人类疾病；在适当情况下，它还提供用于说明相关疾病或障碍的图片、完整引用信息，以及大量有用的外部资源链接（其中部分将在下文介绍）。正如下例所示，对 OMIM 的基本了解，应当成为关注遗传疾病临床方面的医师科学家的必备知识储备。

OMIM 采用明确的编号系统，每个条目都有一个唯一编号，即 “MIM 编号”。它类似于 accession 编号，而且编号中的某些位置还携带关于遗传疾病本身的信息。第一个数字表示该疾病的遗传模式：1、2 和 6 表示常染色体基因座或表型，3 表示 X 连锁基因座或表型，4 表示 Y 连锁基因座或表型，5 表示线粒体基因座或表型。MIM 编号前的星号（*）表示基因，井号（#）表示描述表型的条目，加号（+）表示该条目描述的是同时具有已知序列和表型的基因，百分号（%）表示已确认的孟德尔表型或基因座，但其潜在分子基础尚不清楚。如果某一条目尚未明确建立孟德尔遗传基础，则其 MIM 编号前不加任何符号。

这里继续沿用前一小节中的 Entrez 示例：从图 2.3 的 Discovery Column 中点击 OMIM（引用）链接。系统首先显示一个中间登录页，列出两个条目：一个是 DCC 基因，另一个是描述镜像运动（mirror movements）表型的条目（图 2.13）。点击第二个条目后，用户会进入 DCC 基因的 OMIM 页面（图 2.14）。该条目的 Text 部分对这一基因的鉴定、结构、相关生化特征、定位信息、基因功能、分子遗传学概况以及动物模型研究进行了权威的综合概述。对于刚开始研究某个新基因或遗传疾病的人来说，OMIM 条目中这一由专家人工审查的部分应视为“必读内容”，因为它概括了给定基因最重要的方面，并在正文中嵌入了原始研究文献引用。

图 2.13 与 DCC 基因相关的在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）条目。第一个条目前的井号（#）表示该条目描述的是一种表型，即镜像运动；第二个条目前的星号（*）表示该条目是基因条目，即 DCC 基因。

图 2.14 DCC 基因的在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）条目。OMIM 中的每个条目都包含基因符号、疾病的替代名称、疾病描述、临床概要以及参考文献等信息。详见正文。

等位基因变异列表（list of allelic variants）是该条目中特别有用的功能（图 2.15）。每个等位基因变异后都附有简要说明，用来描述该特定突变导致的临床或生化结果。本文撰写时，已有超过 5200 个 OMIM 条目包含至少一个导致或关联于人类离散表型的等位基因变异。需要注意的是，图 2.15 所示的等位基因变异会产生截然不同的临床结果——两种不同类型的癌症，以及本示例中讨论的运动障碍。这是一个很有启发性的案例，说明同一基因中的不同突变可以导致截然不同的遗传疾病。

图 2.15 可通过在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）获得的等位基因变异列表示例。该图显示 DCC 基因四个等位基因变异中的三个。其中两个已记录变异会导致消化道癌症，另有两个与运动障碍相关。每个等位基因变异下方的描述提供了该特定突变的相关信息。

这些典型条目中描述的观察结果以及由此衍生的类似研究，通常会为临床试验奠定基础；这些试验的目标，是把相关知识转化为新的预防和治疗策略。NIH 的核心临床试验信息来源 ClinicalTrials.gov 收录了由公共机构和私人机构资助的临床试验数据。全球正在进行的临床试验数量非常庞大。图 2.16 显示了本文撰写时正在积极招募结直肠肿瘤患者的 4600 余项临床试验中的前八项。点击某个方案名称后，用户会进入相应研究的信息页面，其中包括首席研究员姓名和联系信息。点击页面顶部的 On Map 标签，则会生成一张可点击的世界地图，显示各地区或国家正在进行的临床试验数量（图 2.17）；这种视图有助于识别距离潜在研究受试者住所较近的试验。

作为科学家，我们往往倾向于关注本章其余部分讨论的那些数据库和信息类型。然而，临床试验网站无疑是本章所介绍资源中最重要的网站之一，因为它为患有特定遗传或代谢疾病的患者提供了一条途径，使他们有机会获得最新的前沿治疗，而这种治疗可能实质性改善其生活质量。

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术语表

NCBI 以外的物种序列数据库

> 来源：Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, 4th ed.

> 范围：PDF pages 58–61（印刷页码 38–41）。

> 用途：

图 2.16 ClinicalTrials.gov 页面，显示所有正在招募结直肠肿瘤患者的临床试验。点击试验名称，即可查看每项试验的信息，包括试验负责人以及参与试验的资格标准。

图 2.17 一张可交互地图，显示正在进行的结直肠肿瘤相关临床试验的地理分布。这种基于地图的信息呈现方式有助于识别距离潜在研究参与者住所较近的试验。

尽管从上述讨论来看，NCBI 似乎是序列世界的中心，但事实上，世界各地还存在大量专业基因组数据库，分别服务于科学界中的特定研究群体。这些数据库通常提供在其他地方难以获得的信息，例如表型（phenotypes）、实验条件（experimental conditions）、品系杂交（strain crosses）以及图谱特征（map features）。这些数据对相关研究群体至关重要：一方面，它们会影响实验设计和实验结果解释；另一方面，它们包含的数据类型并不总能很好地纳入 NCBI 数据模型（NCBI data model）的框架。正因如此，专业数据库应运而生，并且仍在持续发展。这些数据库的定位，是作为 GenBank 以及类似全球数据库的重要补充。我们不可能在此穷尽讨论所有此类增值数据库（value-added databases），但仅从《Nucleic Acids Research》每年第一期都会专门刊登描述这些数据库的论文这一事实（Galperin et al., 2017），就足以看出这类数据库数量之庞大。

一个极具代表性的专业物种数据库是小鼠基因组数据库（Mouse Genome Database，MGD；Bult et al., 2016）。MGD 位于缅因州巴尔港（Bar Harbor, ME）的杰克逊实验室（Jackson Laboratory），提供关于实验小鼠的综合知识库（knowledgebase），也是其整体小鼠基因组信息学（Mouse Genome Informatics，MGI）资源的重要组成部分。MGD 提供基因、遗传标记、突变等位基因与表型、以及与其他物种的直系同源关系等信息，同时还包含丰富的连锁图谱、细胞遗传学图谱、遗传图谱和物理图谱数据。图 2.18 展示了其中一部分数据，提供了小鼠 Dcc 基因的相关信息；该基因是本章前述示例中人类 DCC 基因的直系同源物。用户可以直接搜索基因名称进入该页面；在本例中，也可以通过 OMIM 中 DCC 条目 Animal Model 部分提供的链接进入。这些链接指向利用小鼠模型完成的开创性研究，这些研究加深了我们对人类 DCC 突变影响的理解。

图 2.18 小鼠基因组信息学（MGI）中 Dcc 基因的页面。该条目提供小鼠 Dcc 基因（人类 DCC 基因的直系同源物）的相关信息，包括突变等位基因与表型数据、图谱数据、单核苷酸多态性（SNP）数据以及表达数据。在“突变、等位基因与表型”部分，表型概览用蓝色方块标注哪些表型由 Dcc 基因突变引起；在“表达”部分，蓝色方块表示该基因在野生型小鼠特定组织、器官或系统中的表达情况。

另一个长期专注于特定物种的资源是斑马鱼模式生物数据库（Zebrafish Model Organism Database），也称为斑马鱼信息网络（Zebrafish Information Network，ZFIN；Howe et al., 2012）。鉴于斑马鱼在多类研究问题中具有良好的实验可操作性，它已经成为一种特别有吸引力的动物模型，应用领域包括脊椎动物发育、再生、炎症、感染性疾病和药物发现等。ZFIN 提供了一个非常简洁的搜索界面，支持使用任意术语进行自由文本搜索。再次以 DCC 作为搜索词进行演示，用户会进入斑马鱼 dcc 基因的摘要页面。

图 2.19 斑马鱼信息网络（ZFIN）中斑马鱼 dcc 基因的页面。该条目提供斑马鱼 dcc 基因（人类 DCC 基因的直系同源物）的相关信息。详见正文。

如图 2.19 所示，ZFIN 提供斑马鱼突变体、序列靶向试剂、转基因构建、与其他物种的直系同源关系、Dcc 蛋白产物中的蛋白质结构域信息，以及基因表达和表型数据；这些数据既来自已发表文献，也来自斑马鱼研究群体的直接提交。在这里，点击“基因表达”部分中的 19 张图片链接，即可查看 dcc 在各种实验条件下表达模式的原尺寸图像（图 2.20）。

虽然 MGD 和 ZFIN 是模式生物数据库的出色范例，但每个主要模式生物研究群体都维护着类似资源。这些群体还开展合作，通过基因组资源联盟（Alliance of Genome Resources）开发中央门户，以简化跨多个此类资源的信息检索。

小结、网络资源、延伸阅读与参考文献

> 来源：Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, 4th ed.

> 范围：PDF pages 62–64；印刷页码 45–47。

> 实际 PDF 小节名：Summary / Internet Resources / Further Reading / References。

> 用途：

跨页图注（承接上一小节，图 2.20）

图 2.20 斑马鱼信息网络（Zebrafish Information Network，ZFIN）中可获得的基因表达数据示例。这里展示了斑马鱼 dcc 基因在不同实验条件下的表达模式。插图显示 Gao 等（2012）数据的一张完整尺寸图像，其中包括 dcc 的表达模式（A 图），以及 dcc 与 Lim homeobox 5 基因（lhx5）共表达的情况（B 图）。

小结

正如本章引言所指出的，研究人员能够利用的信息空间将继续以极快速度扩展；仅 GenBank 的规模就以大约每年翻一番的速度增长。如此庞大的数据量可能会使缺乏经验的用户感到困惑，但掌握本章介绍的技术之后，所有生物学领域的研究人员都可以更充分地利用这些数据。现代科学正在转向“大数据”（big data）方法，这进一步强调了一个重要观点：要开展前沿研究，实验台研究策略和计算策略都将不可或缺。正如研究人员需要接受基础生物化学、分子生物学等方法学训练一样，对生物信息学技术的基本理解，也会成为生物学家工具箱中不可或缺的一部分。到这里，读者应该已经很清楚：要学会有效检索和使用基因组序列数据，没有什么能够替代亲自坐到计算机前动手实践。我们强烈鼓励读者充分利用本章介绍的资源，通过实际使用这些工具来提升信心与能力，并开始把生物信息学方法和策略应用到自己的研究工作中。

网络资源

• Alliance of Genome Resources — www.alliancegenome.org
• Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) — ncbi.nlm.nih.gov/BLAST
• ClinicalTrials.gov — clinicaltrials.gov
• DNA Data Bank of Japan (DDBJ) — www.ddbj.nig.ac.jp
• European Molecular Biology Laboratory–European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI) — www.ebi.ac.uk
• GenBank — www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank

-%20iCn3D%20%E2%80%94%20www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/icn3d/docs/icn3d_about.html

• Mouse Genome Database (MGD) — informatics.jax.org
• Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) — omim.org
• Protein Data Bank (PDB) — www.rcsb.org/pdb
• RefSeq — ncbi.nlm.nih.gov/refseq
• Single Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP) — www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP
• Vector Alignment Search Tool (VAST) — www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST
• Zebrafish Information Network (ZFIN) — zfin.org

延伸阅读

Baxevanis, A. D. (2012). Searching Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) for information on genetic loci involved in human disease. Curr. Protoc. Hum. Genet. Chapter 9, Unit 9.13.1–10.

这是一篇以 protocol 为导向的说明，介绍如何制定 OMIM 检索的基本方法，并讨论可通过 OMIM 获得的信息类型，包括由遗传异常导致的临床表现描述。

Galperin, M. Y., Fernández-Suárez, X. M., and Rigden, D. J. (2017). The 24th annual Nucleic Acids Research database issue: a look back and upcoming changes. Nucleic Acids Res. 45:D1–D11.

这是一篇经过人工审查的年度综述，回顾并介绍生物医学研究群体感兴趣且具有重要意义的专业数据库。

参考文献

Altschul, S., Gish, W., Miller, W. et al. (1990). Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403–410.

Amberger, J. S., Bocchini, C. A., Schiettecatte, F. et al. (2014). OMIM.org: Online Mendelian Inheritance in Man, an online catalog of human genes and genetic disorders. Nucleic Acids Res. 43:D789–D798.

Benson, D. A., Cavanaugh, M., Clark, K. et al. (2017). GenBank. Nucleic Acids Res. 45:D37–D42.

Bult, C. J., Eppig, J. T., Blake, J. A. et al. (2016). Mouse genome database 2016. Nucleic Acids Res. 44:D840–D847.

Collins, F. S., Patrinos, A., Jordan, E. et al., and Members of the DOE and NIH Planning Groups (1998). New goals for the U.S. Human Genome Project: 1998–2003. Science. 282:682–689.

Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., and Guyer, M. S., on behalf of the U.S. National Human Genome Research Institute (2003). A vision for the future of genomics research. Nature. 422:835–847.

Finci, L. I., Krüger, N., Sun, X. et al. (2014). The crystal structure of netrin-1 in complex with DCC reveals the bifunctionality of netrin-1 as a guidance cue. Neuron. 83:839–849.

Galperin, M. Y., Fernández-Suárez, X. M., and Rigden, D. J. (2017). The 24th annual Nucleic Acids Research database issue: a look back and upcoming changes. Nucleic Acids Res. 45:D1–D11.

Gao, J., Zhang, C., Yang, B. et al. (2012). Dcc regulates asymmetric outgrowth of forebrain neurons in zebrafish. PLoS One. 7:e36516.

Gibrat, J.-F., Madej, T., and Bryant, S. (1996). Surprising similarities in structure comparison. Curr. Opin. Struct. Biol. 6:377–385.

Green, E. D. and Guyer, M. S., and The National Human Genome Research Institute (2011). Charting a course for genomic medicine from base pairs to bedside. Nature. 470:204–213.

Howe, D. G., Bradford, Y. M., Conlin, T. et al. (2012). ZFIN, the Zebrafish Model Organism Database: increased support for mutants and transgenics. Nucleic Acids Res. 41:D854–D860.

International Human Genome Sequencing Consortium (2001). Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409:860–921.

Madej, T., Lanczycki, C. J., Zhang, D. et al. (2014). MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes. Nucleic Acids Res. 42:D297–D303.

McKusick, V. A. (1966). Mendelian Inheritance in Man: Catalogs of Autosomal Dominant, Autosomal Recessive, and X-Linked Phenotypes. Baltimore, MD: The Johns Hopkins University Press.

McKusick, V. A. (1998). Online Mendelian Inheritance in Man: Catalogs of Human Genes and Genetic Disorders, 12e. Baltimore, MD: The Johns Hopkins University Press.

Schmutz, J., Wheeler, J., Grimwood, J. et al. (2004). Quality assessment of the human genome sequence. Nature. 429:365–368.

Srour, M., Rivière, J. B., Pham, J. M. T. et al. (2010). Mutations in DCC cause congenital mirror movements. Science. 328:592.

Wilbur, W. J. and Coffee, L. (1994). The effectiveness of document neighboring in search enhancement. Inf. Process. Manag. 30:253–266.

Wilbur, W. J. and Yang, Y. (1996). An analysis of statistical term strength and its use in the indexing and retrieval of molecular biology texts. Comput. Biol. Med. 26:209–222.

章节署名说明

本章由 Andreas D. Baxevanis 博士以个人身份撰写。不应将其解释为美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）或美国卫生与公众服务部（United States Department of Health and Human Services）的正式支持或认可。

评估双序列相似性：BLAST 和 FASTA

> 来源：Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, 4th ed.

> 作者：Andreas D. Baxevanis

> 范围：PDF page 65 - PDF page 66 顶部；印刷页码 45-46。

> 用途：

引言

生物信息学的基石之一，是比较核苷酸序列或蛋白质序列，并据此推断这些序列之间的关系。通过这种比较分析，研究者可以推断两个蛋白质是否具有相似功能、是否包含相似的结构基序，或者是否存在可识别的进化关系。本章关注双序列比对（pairwise alignments）：即直接将两条序列逐位比较，以推断这些关系。另一种方法是多序列比对（multiple sequence alignment），用于识别三条或更多序列之间共有的重要特征；这种方法常用于预测二级结构和功能基序，并识别对结构和功能都很重要的保守位置与保守残基，第 8 章将对此进行讨论。

在讨论如何评估核苷酸序列或蛋白质序列之间的相关性之前，需要先定义两个重要术语：相似性（similarity）和同源性（homology）。这两个术语常被混用，但事实上，它们含义明显不同，所隐含的生物学关系也非常不同。

相似性是衡量两条序列彼此相关程度的定量指标。相似性始终基于可观察的结果，通常就是两条序列的双序列比对。当两条序列完成比对后，可以直接统计有多少残基彼此对齐；这个原始计数随后可以转换为最常用的相似性度量，即序列一致性百分比（percent identity）。相似性指标可用于量化两条序列在进化时间中逐渐分化时发生的变化，包括替换、插入和缺失的影响。它们也可用于识别那些对维持蛋白质结构或功能至关重要的残基。简言之，较高的序列相似性百分比可能提示共同的进化历史，或者提示生物学功能上可能存在共性。

相比之下，同源性意味着一种进化关系；它是在考察两条序列之间的最优比对并评估其相似性之后，提出的一种推断性结论。基因（及其蛋白质产物）要么同源，要么不同源——同源性不能用程度或百分比来衡量。同源性这一概念以及 homolog 这一术语，可适用于两类不同关系：

• 如果基因是由物种分化事件分隔开的，则称为直系同源（orthologous）。直系同源基因是共同祖先中某一序列的直接后代，可能具有相似的结构域组成、三维结构和生物学功能。简单来说，直系同源基因可以理解为不同物种中的同一个基因（或蛋白质）。
• 如果同一物种内的基因是由基因复制事件分隔开的，则称为旁系同源（paralogous）。研究旁系同源基因，有助于理解既有基因如何被适应性改造或被共同利用，从而在某一物种内提供新的或经过修饰的功能。

关于同源性、直系同源和旁系同源的概念，以及判断序列之间进化关系的方法，第 9 章将进行更详细的讨论。

全局序列比对与局部序列比对

> 来源：Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, 4th ed.

> 范围：PDF page 66；印刷页码 46。

> 用途：

用于评估相似性，并进一步推断同源性的序列比对方法，可以分为两类：全局序列比对（global sequence alignment）和局部序列比对（local sequence alignment）。全局序列比对方法会取两条序列，并尝试在两条序列的全长范围内给出最佳比对。一般来说，全局序列比对方法最适用于长度大致相同、且相似性很高的序列。虽然这类方法可以应用于任意两条序列，但随着序列相似性降低，它们往往会漏掉一些重要的生物学关系；这些关系在把序列作为整体来考察时，可能并不明显。

相比之下，大多数生物学家更依赖第二类比对算法，即局部序列比对。在这类方法中，序列比较的目标是在被比对的两条序列中找到最相似的区域，而不是在两条序列的全长范围内寻找（或强行建立）一个比对。因此，局部比对聚焦于更容易比对的高相似性子序列，使得判断两条序列之间可能存在的生物学关系变得容易得多。这也使局部比对方法成为生物学发现中常用的首选方法之一。

很多时候，这类方法会为被比较的两条序列返回不止一个结果，因为所分析的序列之间可能存在不止一个共同结构域或共同子序列。局部序列比对方法最适合用于具有一定相似性的序列，或长度不同的序列；接下来的讨论也将主要围绕这类方法展开。

评分矩阵

> 来源：Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, 4th ed.

> 范围：PDF page 66 - PDF page 71 上半；印刷页码 46-51。

> 用途：

无论使用全局比对方法还是局部比对方法，一旦两条待比较序列完成比对，接下来的问题就是：怎样实际衡量“序列 A”和“序列 B”之间的比对有多好？回答这个问题的第一步，是使用数值方法。这些方法不仅考虑两条序列逐位重叠的情况，还考虑被比对的残基或核苷酸本身的性质与特征。

为此，研究者投入了大量精力来开发一类称为评分矩阵（scoring matrices）的工具。评分矩阵是经验性的加权方案，出现在所有涉及两条或多条序列比较的分析中。因此，理解这些矩阵是如何构建的，以及如何在不同矩阵之间做出选择，非常重要。矩阵的选择能够——而且确实会——显著影响大多数序列比较方法得到的结果。

最常用的蛋白质评分矩阵会考虑以下三个主要生物学因素。

1. 保守性（conservation）。矩阵需要考虑蛋白质序列之间的绝对保守性，也需要提供一种方法来评估保守性氨基酸替换。评分矩阵中的数值，用来表示哪些氨基酸残基可以替换其他残基，同时不对天然蛋白质的功能造成不利影响。从物理化学角度看，残基的电荷、大小和疏水性等特征需要相似。

图 3.1 BLOSUM62 评分矩阵（Henikoff and Henikoff 1992）。BLOSUM62 是蛋白质分析中使用最广泛的评分矩阵，并且在通用场景中具有最佳覆盖度。矩阵每一行左侧和每一列顶部的标准单字母代码表示 20 种氨基酸。图中还包括歧义代码 B（表示天冬酰胺或天冬氨酸；Asx）、Z（表示谷氨酰胺或谷氨酸；Glx），以及 X（表示任意氨基酸）。注意，该矩阵相对于对角线呈镜像对称。详见正文。

1. 频率（frequency）。正如氨基酸残基不能任意相互替换一样，矩阵也需要反映特定残基在整个蛋白质集合中出现的频率。稀有残基会比常见残基获得更高权重。

1. 进化（evolution）。从设计上看，评分矩阵隐含地代表了进化模式；矩阵也可以被调整，以偏向检测亲缘关系较近或较远的蛋白质。针对不同进化距离选择何种矩阵，将在下文讨论。

构建评分矩阵还涉及一些细微问题，Henikoff 和 Henikoff（2000）的一篇优秀综述对此有详细说明。

这些因素在评分矩阵中究竟如何体现，最好的说明方式是拆解最常用的评分矩阵 BLOSUM62（图 3.1）。20 种氨基酸以及标准歧义代码分别列在矩阵顶部和侧边。矩阵中的分数实际上表示一个优势比（odds ratio）的对数（Box 3.1），该优势比考虑的是：在自然界中，某一残基被观察到替换另一残基的频率。这个优势比还会考虑：如果替换以随机方式发生（纯粹出于偶然），某一残基被另一残基替换的频率应当是多少。因此，正分表示两种残基彼此替换的观察频率高于随机预期；负分则表示两种残基彼此替换的观察频率低于随机预期。更简单地说，常见替换得到正分，不常见替换得到负分。

Box 3.1 评分矩阵与对数优势比

蛋白质评分矩阵来源于氨基酸彼此替换的观察频率。基于这些概率，可以使用下式生成评分矩阵：

S_i,j = log[(q_i,j) / (p_i p_j)]

其中，p_i 表示残基 i 在所有蛋白质中出现的概率，p_j 表示残基 j 在所有蛋白质中出现的概率。q_i,j 表示在蛋白质家族的多序列比对中，或在已知具有生物学关系的序列中，氨基酸 i 和 j 被观察到彼此对齐的频率。因此，对数优势比 S_i,j（或称 “lod score”，即 lod 分数）表示残基 i 被残基 j 替换时，观察频率与随机频率之间的比值。对于常见替换，S_i,j 大于 0；对于发生频率低于随机预期的替换，S_i,j 小于 0；如果观察频率与随机频率相同，则 S_i,j 等于 0。

为了更充分地说明矩阵中数字的含义，可以设想两条序列已经完成比对，现在需要评估在比对的某一给定位置上，序列 A 中的一个残基与序列 B 中的一个残基匹配得有多好。以图 3.1 中的评分矩阵为例：

• 对角线上的数值表示某一位置发生精确匹配时得到的分数，这些数值总是正数。例如，如果序列 A 中的色氨酸残基（W）与序列 B 中的色氨酸残基对齐，那么这一匹配会得到 11 分，即 W 行与 W 列交叉处的数值。还应注意，11 是对角线上的最高值。因此，W:W 比对获得如此高的分数，不仅反映了这是一次精确匹配，也反映了色氨酸是蛋白质中最稀有的氨基酸。换句话说，W:W 比对总体上更不容易偶然发生，因此也更可能是正确的。
• 离开对角线后，可以考虑一个保守性替换的例子：用酪氨酸（Y）替换色氨酸。Y 行与 W 列的交叉处数值为 2。这个正值意味着，这种替换在比对中出现的观察频率高于随机预期；但它不如保留色氨酸残基好（2 < 11），也不如保留酪氨酸残基好（2 < 7）。
• 最后，考虑一个非保守性替换的例子：用缬氨酸（V）替换色氨酸。V 行与 W 列交叉处的数值为 −3。这个负值意味着，这种替换并不常被观察到，其出现更多可能是偶然结果。

尽管评分矩阵中数字及其相互关系的含义看起来相当直接，但在实际构建矩阵时，仍必须对什么才算保守性替换或非保守性替换，以及如何评估这些事件在自然界中的频率，做出一些判断。这正是不同评分矩阵彼此区分的主要因素。为了帮助读者做出明智选择，有必要讨论目前可用矩阵的构建思路、优点和缺点。

PAM 矩阵

最早可用于蛋白质序列分析的实用矩阵由 Dayhoff 等人（1978）开发。这些矩阵的基础，是考察一组序列一致性超过 85% 的蛋白质中的替换模式。该分析在 71 组亲缘关系较近的蛋白质中识别出 1572 个变化。研究者据此构建表格，用来表示在某一给定位置上，一个特定氨基酸替换另一个氨基酸的频率。

由于被考察的序列具有如此高的相似性，所得频率代表的是较短进化距离上预期会出现的情况。此外，由于这些蛋白质之间进化关系接近，可以预期观察到的突变不会显著改变蛋白质功能。这称为接受（acceptance）：即那些能够通过自然选择被容纳，并产生与原始蛋白质具有相同或相似功能蛋白质的变化。由于该分析考察的是单个点突变，因此由此得到的计量单位称为可接受点突变（point accepted mutation），即 PAM 单位。1 个 PAM 单位对应每 100 个残基中发生 1 个氨基酸变化，约等于 1% 分化。

PAM 矩阵的构建包含若干假设。其中最重要的假设之一是：某一位置上的氨基酸替换独立于该位置此前发生过的突变。基于这一假设，原始矩阵被外推，用来预测更长进化距离上的替换频率。例如，PAM1 矩阵可以与自身相乘 100 次，得到 PAM100 矩阵；PAM100 代表的是每 100 个残基发生 100 次氨基酸变化时的预期情况。（这并不意味着 100 个残基中的每一个都发生了变化，而只是说总共发生了 100 次变化；某些位置可能先发生变化，随后又变回原来的残基。）由于代表较长进化距离的矩阵是从上述 1572 个观察变化所构建的原始矩阵外推而来，因此必须记住，这些矩阵确实是预测结果，并非基于直接观察。原始矩阵中的任何误差都会在外推矩阵中被放大，因为单纯的矩阵相乘会显著放大这些误差。

读者还应了解 PAM 矩阵构建中的其他假设。所有位点都被假定为同等可变；替换被假定为独立于周围残基；同时，PAM 矩阵不考虑保守区块或基序。这里比较的序列具有平均组成特征，而这一“平均”是基于 1978 年可获得的少量蛋白质序列得出的，因此偏向小型球状蛋白；尽管后来已有努力将更多序列数据纳入其中（Gonnet et al. 1992; Jones et al. 1992）。最后，这里还隐含了一个假设：负责较短时间尺度上序列进化的力量，与较长进化时间尺度上的力量相同。虽然 PAM 矩阵存在显著缺点，但也应记住，在 1978 年可获得的信息条件下，这些矩阵的开发标志着人们量化序列关系能力的一项重要进展。由于许多生物信息学工具仍可使用这些矩阵，读者应牢记这些潜在缺陷，并审慎使用。

BLOSUM 矩阵

1992 年，Steve 和 Jorja Henikoff 采用了一种与上述方法略有不同的思路，并解决了 PAM 矩阵的许多缺点。新矩阵开发的基础，是一项旨在识别蛋白质家族中保守基序的研究（Henikoff and Henikoff 1991, 1992）。该研究促成了 BLOCKS 数据库的建立；这一数据库使用 block 的概念来识别蛋白质家族。block 的概念源自更熟悉的 motif 概念，后者通常指一段保守的氨基酸序列，并为蛋白质赋予特定功能或结构。当同一家族蛋白质中的这些单个基序可以在不引入缺口的情况下完成比对时，得到的结果就是一个 block；这里的 block 指的是比对本身，而不是单条序列。显然，任意一个给定蛋白质都可以包含一个或多个 block，分别对应其结构基序或功能基序。有了这些蛋白质 block，就可以只在蛋白质中最保守、也就是推测最不容易发生变化的区域中寻找替换模式。研究者考察了代表 500 多组相关蛋白质的 2000 个 block，并基于这些保守 block 中的替换模式，生成了区块替换矩阵（blocks substitution matrices），简称 BLOSUM。

鉴于科学发现的速度，到 1992 年，可用蛋白质序列数量远多于 1978 年，因此这些新矩阵可以从更稳健的基础数据集中推导出来。然而，BLOSUM 矩阵与 PAM 矩阵之间最重要的区别在于：BLOSUM 矩阵是在不同进化距离上直接计算得到的，而不是外推得到的，因此能够更准确地反映这些距离上的替换模式，并进一步反映相应的进化力量。BLOSUM 矩阵仅基于保守区域直接计算，这一事实使其对结构性或功能性替换的检测更加敏感；因此，在局部相似性搜索中，BLOSUM 矩阵的表现明显优于 PAM 矩阵（Henikoff and Henikoff 1993）。

回到直接推导各类矩阵这一点，每个 BLOSUM 矩阵都会被赋予一个编号（BLOSUMn），该编号表示用于推导该矩阵的序列的保守水平。例如，BLOSUM62 矩阵是由序列一致性不超过 62% 的序列计算得到的；序列一致性超过 62% 的序列会被聚类，并且它们的贡献被加权为 1。聚类会降低亲缘关系很近的序列的贡献，也就是说，来自同一家族中最接近成员的替换不会被过度代表，从而减少偏倚。降低 n 的值，会得到用于更远亲缘关系序列的矩阵。

应在何时使用哪种矩阵？

虽然大多数生物信息学软件都会为用户提供默认评分矩阵，但默认矩阵未必一定最适合当前提出的生物学问题。表 3.1 旨在根据已有研究提供一些指导，帮助选择合适的评分矩阵；这些研究考察了不同矩阵检测已知生物学关系的有效性（Altschul 1991; Henikoff and Henikoff 1993; Wheeler 2003）。需要注意的是，这两个矩阵家族的编号方向相反：分化程度更高的序列，需要使用编号较高的 PAM 矩阵和编号较低的 BLOSUM 矩阵来识别。以下等价关系有助于将 PAM 矩阵与 BLOSUM 矩阵对应起来（Wheeler 2003）：

• PAM250 约等于 BLOSUM45
• PAM160 约等于 BLOSUM62
• PAM120 约等于 BLOSUM80

除这里讨论的蛋白质矩阵外，还有许多专门矩阵：有些特异于某一物种，有些关注特定蛋白质类别（如跨膜蛋白），有些关注结构性替换，还有一些尝试利用疏水性指标来评估相似性（见 Wheeler 2003）。面对这样的选择格局，读者最需要记住的是：没有任何单一矩阵能够回答所有序列比较问题。要正确开展基于序列的分析，必须充分理解每一种矩阵究竟代表什么。

表 3.1 选择合适的评分矩阵

“相似性”列给出的是该矩阵最适合检测的相似性范围（Wheeler 2003）。

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<!-- ABSORBED_FRAGMENT:04_Nucleotide_Scoring_Matrices -->

核苷酸评分矩阵

> 范围：PDF page 71；印刷页码 51。

在核苷酸层面，评分问题要简单得多。这里使用的矩阵通常只是简单统计匹配和错配。这类矩阵还假设四种可能的核苷酸碱基出现频率相同，即各占 25%。在某些情况下，矩阵也会考虑碱基之间的歧义或化学相似性；图 3.2 展示了这类矩阵的一个例子。

核苷酸评分矩阵与蛋白质评分矩阵在构建方式上的基本差异，应当清楚表明：在判定相似性和推断同源性时，对于编码 DNA 序列，基于蛋白质的搜索总是比基于核苷酸的搜索更有力。这是因为 20 个字母组成的氨基酸字母表，相比 4 个字母组成的核苷酸字母表，天然包含更高的信息量。

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<!-- ABSORBED_FRAGMENT:05_Gaps_and_Gap_Penalties -->

缺口与缺口罚分

> 范围：PDF page 71 - PDF page 72 上半；印刷页码 51-52。

在比较两条核苷酸序列或蛋白质序列时，常常需要引入缺口（gaps），以改善两条序列之间的比对。这些缺口用于补偿所研究序列之间发生的插入和缺失。因此，从本质上说，这些缺口代表了生物学事件。也正因为如此，在双序列比对中引入的缺口数量必须控制在合理范围内，避免得到生物学上不可信的情形。

在双序列比对中，对缺口进行评分的方法不同于前面讨论过的评分方式，因为这里无法比较两个字符：一条序列在某个位置有残基，而另一条序列在该位置没有任何字符。最常用的缺口评分方法涉及一个称为仿射缺口罚分（affine gap penalty）的量。在这种方法中，引入缺口会产生一个固定扣分；此外，还会根据缺口长度产生一个成比例的额外扣分。仿射缺口罚分的公式为：

G + L n

其中，G 是缺口开启罚分（gap-opening penalty，即产生缺口的代价），L 是缺口延伸罚分（gap-extension penalty），n 是缺口长度，并且 G > L。最后这一条件很重要：由于缺口开启罚分大于缺口延伸罚分，延长已有缺口会比创建新缺口更受偏好。在大多数程序中，G 和 L 的值可以手动调整，使缺口插入更宽松或更严格；不过，多数方法会根据所使用的评分矩阵，自动将 G 和 L 调整到最合适的值。

图 3.2 核苷酸评分表。图左上角显示四种核苷酸碱基的评分，其余单字母代码表示 IUPAC/UBMB 关于歧义或化学相似性的代码。注意，该矩阵相对于对角线呈镜像对称。

另一种常用的主要缺口罚分类型是非仿射（或线性）缺口罚分（non-affine or linear gap penalty）。在这种方法中，开启缺口本身没有代价；对于缺口中的每一个位置，只施加一个简单、固定的错配罚分。通常认为，仿射罚分更能代表序列比对背后的生物学原因，因为仿射缺口罚分考虑到这样一个事实：大多数保守区域没有缺口，而且单个突变事件可能插入或删除的不止一个残基。在实践中，使用仿射缺口罚分更有助于检测亲缘关系更远的同源序列。

BLAST

> 来源：Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, 4th ed.

> 范围：PDF page 72；印刷页码 52。

> 用途：

到目前为止，用于检测目标序列之间相似性的最常用技术，是基本局部比对搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool），即 BLAST（Altschul 等，1991）。BLAST 能够成为序列分析中的基石技术，主要原因在于它可以准确而快速地检测核苷酸序列和蛋白质序列之间的相似性，同时不牺牲敏感性。原始的标准 BLAST 程序家族见表 3.2；不过，自 BLAST 问世以来，已经发展出许多原始程序的变体，用于满足双序列比较领域中的特定需求。本章后面将讨论其中若干变体。

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<!-- ABSORBED_FRAGMENT:07_The_Algorithm -->

算法

> 范围：PDF page 72 - PDF page 74；印刷页码 52-54。

BLAST 是一种局部比对方法。它不仅能够检测查询序列与目标序列之间最佳的局部比对区域，还能够判断查询序列和目标序列之间是否存在其他可能的比对。为了以计算上高效的方式找到这些局部比对区域，该方法首先用查询序列中的一小段字母作为种子来启动搜索，这段字母称为查询词（query word）。以图 3.3 所示示例为例，设默认长度为 3 的查询词为 RDQ。（实际运行时，会考虑所有长度为 3 的词；因此，使用图 3.3 中的序列时，第一个查询词是 TLS，随后是 LSH，依此沿序列继续。）

BLAST 此时不仅需要在目标数据库的所有序列中寻找 RDQ 这个词，还需要寻找引入了保守替换的相关词，因为这些匹配也可能具有生物学信息和生物学相关性。为了判断哪些词与 RDQ 相关，算法会使用评分矩阵来构建所谓的邻域（neighborhood）。图 3.3 中间面板显示了与原始查询词相关的一组词，并按得分从高到低排列；这些得分使用 BLOSUM62 评分矩阵（图 3.1）计算。显然，必须设置某种截断值，使后续分析只考虑确实与原始查询词密切相关的词。控制这一截断值的参数称为邻域得分阈值（neighborhood score threshold，T）。T 的值由 BLAST 程序自动确定，但用户也可以调整。增大 T 会使搜索更偏向精确匹配，并加快搜索速度，但也可能遗漏有趣的生物学关系。降低 T 则允许检测序列之间更远的关系。在这里，只有 T ≥ 11 的词会进入下一步。

表 3.2 BLAST 算法。

图 3.3 BLAST 搜索的启动。搜索从给定长度的查询词开始（此处为三个氨基酸），将其与评分矩阵进行比较，以确定处在原始查询词“邻域”中的其他三字母词。随后，会检查目标数据库序列中是否出现这些邻域词。详见正文。

现在看图 3.3 的下方面板，原始查询词 RDQ 已经与邻域中的另一个词 REQ 对齐，而后者的得分超过了 T ≥ 11 的得分阈值。接下来，BLAST 算法会尝试向两个方向延伸这个比对，并累计由匹配、错配和缺口产生的得分，直到构建出最大长度的局部比对。要解释这个最大长度究竟如何确定，最清楚的方式是观察图 3.4 中的图。这里，已经比对的残基数量被绘制在横轴上，而由该比对产生的累计得分被绘制在纵轴上。图中最左侧的点表示原始查询词与邻域中的某个词之间的比对，该词同样具有 T = 11 或更高的值。随着延伸继续进行，只要精确匹配和保守替换所带来的得分超过错配和缺口带来的扣分，累计得分就会升高。一旦累计得分超过得分阈值 S，该比对就会被报告在 BLAST 输出中。需要特别注意，单纯超过 S 并不自动意味着该比对具有生物学显著性；这是一个非常重要的问题，后文还会讨论。

图 3.4 BLAST 搜索延伸。延伸长度表示在双序列比较中已经对齐的字符数。累计得分表示逐位置得分的总和，这些逐位置得分由搜索所使用的评分矩阵决定。T 表示邻域得分阈值，S 是在 BLAST 输出中返回一个命中所需的最低得分，X 是显著性衰减阈值。详见正文。

随着延伸继续进行，在某个时刻，错配和缺口将开始超过精确匹配和保守替换，并从评分矩阵中累积负分。一旦曲线开始向下，BLAST 就会判断得分下降是否超过一个称为 X 的阈值。如果曲线衰减超过了 X 值所允许的范围，延伸就会终止，并且比对会被修剪回曲线先前达到最大值时对应的长度。所得比对称为高得分片段对（high-scoring segment pair，HSP）。由于 BLAST 算法会使用所有可能的查询词系统地沿查询序列推进，因此对于任意给定的一对序列，可能会发现不止一个 HSP。

识别出 HSP 之后，重要的是判断所得比对是否真正显著。利用该比对的累计得分以及若干其他参数，可以计算出一个称为 E 的新值，其中 E 表示 “expect”（见 Box 3.2）。对于每一个命中，E 给出 BLAST 纯粹由随机机会发现得分为 S 或更高的 HSP 的预期数量。换句话说，E 值提供了一个衡量指标，用于判断所报告的 HSP 是否为假阳性（见 Box 5.4）。较低的 E 值意味着更高的生物学显著性。

Box 3.2 Karlin–Altschul 方程

可以想见，仅仅根据原始得分来评估任意给定 BLAST 命中的推定生物学显著性是困难的，因为得分依赖于查询序列和目标序列的组成、序列长度、用于计算原始得分的评分矩阵，以及许多其他因素。在关于局部序列比对统计理论的最重要论文之一中，Karlin 和 Altschul（1990）提出了一个直接处理这一问题的公式。该公式后来被称为 Karlin–Altschul 方程，它使用与搜索相关的参数来计算一个期望值（expectation value，E）。该值表示纯粹由随机机会预期出现的 HSP 数量。用于计算 E 的方程及其参数如下：

E = k m N e^(-λS)

其中，k 是一个较小的常数，m 是查询序列中的字母数，N 是目标数据库中的字母总数，λ 是用于标准化高得分片段对原始得分的常数，且 λ 的取值会随所用评分矩阵而变化；S 是高得分片段对的得分。

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<!-- ABSORBED_FRAGMENT:08_Performing_a_BLAST_Search -->

执行 BLAST 搜索

> 范围：PDF page 74 下半 - PDF page 81 顶部；印刷页码 54-61。

> 实际 PDF 小节名：Performing a BLAST Search / Understanding the BLAST Output。

尽管世界各地都有许多 BLAST 服务器可供使用，但进行这类搜索最常用的入口，是美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的 BLAST 主页（图 3.5）。页面上半部分提供最常用 BLAST 搜索类型的入口，这些类型概括于表 3.2；页面下半部分则用于进入各种专门类型的 BLAST 搜索。为了说明执行 BLAST 搜索相对容易，本节以使用 BLASTP 进行蛋白质搜索为例。点击 Protein BLAST 方框后，用户会进入 BLASTP 搜索页面，其部分界面如图 3.6 所示。显然，必须提供一条作为比较基础的查询序列。回到第 2 章对 Entrez 的讨论，本例将来自 Homo sapiens 的 netrin 受体序列（NP_005206.2）粘贴到查询序列框中。紧邻其右侧，用户可以使用 query subrange 框指定是否只使用该序列的一部分；如果要使用整条序列，则应将这些字段留空。

图 3.5 美国国立生物技术信息中心（NCBI）的 BLAST 起始页面。正文讨论了可通过 BLAST 界面执行的若干最常用查询示例。

进入页面的 Choose Search Set 部分后，可以通过 Database 下拉菜单选择要搜索的数据库；点击 Database 下拉菜单旁边的问号，可以查看每个可用目标数据库的简短说明。这里，搜索将在 RefSeq 数据库中执行（见 Box 1.2）。其下方的 Organism 框可用于将搜索结果限定为来自某个具体生物体或分类单元的序列。虽然这不是本例演示的一部分，但如果用户想把返回结果限制为只来自小鼠和大鼠，可以使用与 Entrez 搜索相同的语法（见表 2.1），在该字段中输入 Mus musculus [ORGN] AND Rattus norvegicus [ORGN]；如果用户想要除小鼠和大鼠之外的所有结果，还需要勾选 Exclude 框。由于本搜索将在 RefSeq 中执行，可以点击 “Models (XM/XP)” 复选框，从搜索结果中排除预测蛋白。最后，在 Program Selection 部分，BLASTP 默认处于选中状态。

图 3.6 BLASTP 查询页面的上半部分。窗口中的第一部分用于指定感兴趣序列、是否只使用该序列的一部分执行搜索（query subrange）、要搜索哪个数据库，以及使用哪一种基于蛋白质的 BLAST 算法执行查询。详见正文。

如果用户希望所有算法参数都使用默认设置，只需点击蓝色 BLAST 按钮即可提交搜索。不过，用户也可以通过修改 Algorithm parameters 部分中的选项，对搜索执行方式进行更精细的控制。要访问这些设置，用户必须先点击 “Algorithm parameters” 字样旁边的加号，展开网页中的这一部分，得到图 3.7 所示的界面。查询页面的这一部分，正是本章前文讨论的 BLAST 搜索理论开始发挥作用的地方。在 General Parameters 部分，expect threshold 会把返回结果限制为 E 值低于指定值的条目；数值越小，截断标准越严格。word size 设置会改变用于启动 BLAST 搜索的查询词长度；较长的 word size 会以较长的无缺口比对启动搜索。对于蛋白质搜索，推荐 word size 为 3，因为较短的词会提高灵敏度；不过，如果要搜索近乎完全相同的匹配，也可以使用较长的 word size，这样还能获得更快的搜索速度。

图 3.7 BLASTP 查询页面的下半部分，显示用户可调整以微调搜索的算法参数。正文所讨论搜索中发生改变的参数值以黄色高亮显示，并用菱形标出。详见正文。

在 Scoring Parameters 部分，用户可以选择合适的打分矩阵（默认矩阵为 BLOSUM62）。更换矩阵会自动把 gap penalties 改为适合该打分矩阵的数值。正如前文关于 affine gap penalties 的讨论所述，用户也可以手动修改这些数值；提高缺口代价会使成对比对包含更少缺口，而降低这些数值则会使插入缺口更加宽容。

在 Filters and Masking 部分，应当进行过滤以去除低复杂度区域。低复杂度区域可以简单定义为组成偏倚的区域（Wootton and Federhen 1993）。这类区域可能包括同聚物连续片段、短周期重复，或序列中若干残基的轻微过度表示。低复杂度区域的生物学作用尚不清楚；一般认为，它们可能代表 DNA 复制错误或不等交换事件的结果。判断感兴趣序列是否包含低复杂度区域非常重要；这些区域在执行序列比对时往往会造成问题，并可能导致假阳性结果，因为它们通常会在彼此无关的蛋白质之间表现出相似性。最后，在提交查询之前，务必勾选 “Show results in a new window” 框。这样可以保留原始查询窗口（或标签页），便于根据需要返回并调整或改变搜索参数。

理解 BLAST 输出

上述查询所得 BLASTP 结果的第一部分如图 3.8 所示。图的上半部分显示了通过将查询序列与 NCBI Conserved Domain Database（CDD）中的数据进行比较而找到的保守蛋白结构域位置。随后是 BLASTP 结果的图形概览，使用户能够大致了解有多少序列与查询序列具有相似性，以及这些序列相对于查询序列的得分情况。图形显示中各项特征的细节见图 3.8 图注。由这次特定 BLASTP 搜索找到的实际序列列表，即 “hit list”，部分显示于图 3.9。每个命中项包含的信息包括来自该命中来源数据库条目的定义行、用于计算最佳 HSP 比对 E 值的 score 值、该最佳 HSP 比对的 percent identity，以及带有超链接的 accession number；通过该 accession number，用户可以直接访问该命中的来源数据库记录。表格默认按 E 值从低到高排序；请记住，E 值越低，表示比对越好。在 E value 列中可以看到，许多条目的 E value 为 0.0。这表示一个极低的 E 值被向下舍入为零，并意味着统计学显著性。还要注意，hit list 中每个条目前都有一个复选框；勾选其中一个或多个复选框后，图 3.9 中灰显的选项会被激活，允许用户下载所选序列、以图形方式查看所选命中、生成树状图，或即时构建多序列比对。

图 3.8 BLASTP 结果的图形显示。查询序列用标有 “Query” 的粗青色条表示，其刻度线标示查询序列中的残基位置。查询序列下方较细的条代表 BLAST 算法检测到的每个匹配（“hits”）。颜色表示每个命中的相对得分，得分颜色键显示在框的顶部。每条线的长度及其位置表示与查询序列相似的区域。由细线连接的命中表示同一序列中存在多个高评分片段对（HSP）；类似地，穿过某个命中的细垂直条表示整体比对中存在断裂。将鼠标移到任一线条上，会弹出显示该命中身份的信息框。点击任一线条，可直接跳转到该命中的详细信息（见图 3.10）。

图 3.9 BLASTP 的 “hit list”。对于找到的每条序列，用户会看到该命中来源数据库条目的定义行、最佳高评分片段对（HSP）比对的 score 值、所有 HSP 比对得分的总和、HSP 覆盖查询序列的百分比，以及最佳 HSP 比对的 E 值和 percent identity。带超链接的 accession number 允许直接访问该命中的来源数据库记录。在 E value 列中，极低的 E 值会被向下舍入为零。对于非零 E 值，使用指数记数法；以图中第一个非零值为例，2e-159 应读作 2 × 10^-159。

点击 hit list 中任一蛋白名称后，用户会移动到页面下方，来到显示该命中的成对比对结果的输出部分（图 3.10）。标题行提供该特定命中的完整定义行，随后在标题行下方显示每个已识别的 HSP。在多数情况下，用户只会看到一个比对；但在图 3.10 所示的案例中有两个比对，其中得分和 E 值更好的命中显示在前。每个命中给出的统计量包括 E 值、identities（完全匹配）的数量、“positives”（完全匹配加保守替换）的数量，以及落入缺口区域的残基数量。在比对内部，缺口用短横线表示，而低复杂度区域用灰色小写字母表示。

图 3.10 一个代表性 BLASTP 命中的详细信息。标题行给出该命中的身份，以及 score 和 E value。percent identity 表示完全匹配，而 percent “positives” 同时考虑完全匹配和保守替换。gap 数值显示由于引入缺口而未能比对的残基数量。缺口用短横线表示，低复杂度区域用灰色小写字母表示。请注意，第二个比对前没有标题行；这表示它是同一数据库条目中的第二个高评分片段对（HSP）。

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<!-- ABSORBED_FRAGMENT:09_Suggested_BLAST_Cut_Offs -->

建议的 BLAST 截断标准

> 范围：PDF page 81 中部；印刷页码 61。

> 实际 PDF 小节名：Suggested BLAST Cut-Offs。

如前文所指出的，某个命中出现在 BLAST 报告中，并不自动意味着该命中具有生物学显著性。随着时间推移，基于许多研究者的系统测试和个人经验，已有多种指南被提出，用于建立一条边界，以区分有意义的命中和其余结果。对于基于核苷酸的搜索，应寻找 E 值不高于 10^-6、且序列一致性不低于 70% 的结果。对于基于蛋白质的搜索，应寻找 E 值不高于 10^-3、且序列一致性不低于 25% 的命中。使用更宽松的截断标准，会使分析有进入所谓 “twilight zone”（暮光区）的风险；这是一个低一致性区域，在该区域中，关于两条序列之间关系的任何结论，充其量都可能是可疑的（Doolittle 1981, 1989; Vogt et al. 1995; Rost 1999）。

需要提醒读者，不要盲目使用这些截断标准，或任何其他建议截断标准，尤其是在接近分界线的区域。用户应始终考虑所使用的打分矩阵是否正确。同样，用户也应手动检查成对比对结果，并通过阅读文献考察任何推定同源关系背后的生物学依据，从而说服自己：无论某个命中位于建议截断标准的哪一侧，它是否真正具有合理的生物学意义。

BLAST 2 Sequences

> 来源：Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Sequences and Genomes, 4th ed.

> 范围：PDF page 81 下半 - PDF page 83 顶部跨页图注；印刷页码 61-63。

> 实际 PDF 小节名：BLAST 2 Sequences。

> 用途：

BLAST 的一个变体称为 BLAST 2 Sequences，可用于在任意两条感兴趣的蛋白质序列或核苷酸序列之间寻找局部比对（Tatusova and Madden 1999）。虽然该方法使用 BLAST 引擎来寻找两条序列之间的最佳局部比对，但它并不执行数据库搜索。相反，待比较的两条序列由用户预先指定。该方法特别适合用于比较已经通过实验方法确定为同源的序列，或用于比较来自不同物种的序列。

回到图 3.6 所示的 Protein BLAST（BLASTP）搜索页面，勾选标为 “Align two or more sequences” 的复选框后，页面结构会发生变化，用户现在可以同时输入将要相互比较的 query sequence 和 subject sequence（图 3.11）。与任何 BLAST 搜索一样，用户可以调整一组标准的 BLAST 相关选项，包括选择打分矩阵和 gap penalties。

图 3.12 显示了 BLAST 2 Sequences 方法产生的一组结果示例，其中比较的是来自 H. sapiens 的转录因子 SOX-1 和来自栉水母 Mnemiopsis leidyi 的 SOX-1；栉水母是至少可追溯到 5 亿年前演化时间的最早分支动物物种（Ryan et al. 2013; Schnitzler et al. 2014）。这种输出与典型 BLAST 输出的主要差异在于，它包含比对的 dot matrix view，即 “dotplot”。Dotplot 旨在以图形方式表示两条被比较序列之间的相似程度，使用户能够快速识别局部比对区域、正向或反向重复、插入、缺失和低复杂度区域。图 3.12 中的 dotplot 指示出两个比对区域；图底部 Alignments 部分则提供了关于这两个比对区域的更多信息。与所有 BLAST 搜索一样，Alignments 部分向用户提供常规的一组分数、E 值，以及 identities、positives 和任何引入缺口的百分比。

图 3.11 执行 BLAST 2 Sequences 比对。点击 Enter Query Sequence 部分底部的复选框，会展开搜索页面，并生成新的 Enter Subject Sequence 部分。这里分别使用来自人类和栉水母 Mnemiopsis leidyi 的转录因子 SOX-1 序列作为 query 和 subject（Schnitzler et al. 2014）。由于已经指定一对一比对，因此 Program Selection 部分中只有 BLASTP 算法可用。常规的一组算法参数仍然可用，使用户能够根据需要微调比对。

图 3.12 BLAST 2 Sequences 比对的典型输出，基于图 3.11 中提交的查询。图上方显示标准图形视图；这里显示在人类和栉水母 Mnemiopsis leidyi 转录因子 SOX-1 序列比对中存在两个高评分片段对（HSP）。Dot matrix view 是比对的另一种视图，其中 query sequence 表示在横轴上，subject sequence 表示在纵轴上；对角线表示两个 HSP 中捕获的比对区域。详细比对结果显示在图底部，并列出每个 HSP 的 E 值和比对统计量。

MegaBLAST

> 来源：Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Sequences and Genomes, 4th ed.

> 范围：PDF page 82 下半 - PDF page 84 上部；印刷页码 62-64。

> 实际 PDF 小节名：MegaBLAST。

> 用途：

MegaBLAST 是 BLASTN 算法的一个变体，经过专门优化，用于比对较长的核苷酸序列，或高度相似（>95%）的核苷酸序列；在核苷酸数据库中寻找精确匹配时，它是一种首选方法。由于使用 greedy gapped alignment routine（贪婪式带缺口比对流程）（Zhang et al. 2000），MegaBLAST 处理较长核苷酸序列的速度大约可达到 BLASTN 的 10 倍。MegaBLAST 特别适合判断某条序列是否属于较大 contig 的一部分、检测潜在测序错误，以及在大型相似数据集之间进行比较。

MegaBLAST 之所以能够达到这样的运行速度，来自对传统 BLASTN 流程中两个方面的改变。第一，它使用更长的默认 word length；在 BLASTN 中，默认 word length 为 11，而 MegaBLAST 使用的默认 word length 为 28。第二，MegaBLAST 使用 non-affine gap penalty scheme，这意味着打开 gap 不会受到罚分；只有延长 gap 时才会受到罚分，并且 gap 中每个位置的罚分是恒定的。MegaBLAST 能够接受批量查询：用户只需将 FASTA 格式的多条序列，或一组 accession numbers，粘贴到 query window 中即可。

MegaBLAST 还有一个变体，称为 discontiguous MegaBLAST。该版本被设计用于比较来自不同生物体的差异较大的序列，也就是那些预期 sequence identity 较低的序列。该方法使用 discontiguous word approach，这与 BLAST suite 中其他程序采用的方法有很大不同。在这里，程序并不是寻找某一长度的连续 query words 来作为搜索种子，而是在较长的序列片段上检查非连续位置（Ma et al. 2002）。已有研究表明，即使序列之间的相似程度很低，这种方法也能够找到具有统计显著性的比对。

PSI-BLAST

> 来源：Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Sequences and Genomes, 4th ed.

> 范围：PDF page 84 中部 - PDF page 89 跨页图注；印刷页码 64-69。

> 实际 PDF 小节名：PSI-BLAST。

> 用途：

PSI-BLAST 是 BLAST 算法的一个变体，全称为 position-specific iterated BLAST。它特别适合识别远缘相关蛋白，也就是那些可能无法用传统 BLASTP 方法找到的蛋白（Altschul et al. 1997; Altschul and Koonin 1998）。PSI-BLAST 依赖 position-specific scoring matrices（PSSMs，位置特异性打分矩阵），这类矩阵也常被称为 hidden Markov models 或 profiles（Schneider et al. 1986; Gribskov et al. 1987; Staden 1988; Tatusov et al. 1994; Bücher et al. 1996）。简单地说，PSSM 是 multiple sequence alignment 的数值化表示；multiple sequence alignment 将在第 8 章讨论。Multiple sequence alignment 内嵌有序列信息，这些信息代表该组序列的共同特征，而这组序列通常对应一个蛋白家族。通过使用 PSSM，可以利用这些内嵌的共同特征，在几乎没有或完全没有绝对 sequence identity 的序列之间寻找相似性，从而识别和分析远缘相关蛋白。

PSSM 的构建方式是：取一个代表某个蛋白家族的 multiple sequence alignment，然后提出以下一系列问题。

• 在比对的每一个位置上可以看到哪些残基？
• 某一种特定残基在比对的每一个位置上出现的频率是多少？
• 是否存在显示绝对保守性的位置？
• 是否可以在比对中的任何位置引入 gaps？

一旦这些问题得到回答，PSSM 就被构建出来；表中的数字此时就代表该 multiple sequence alignment（图 3.13）。PSSM 中的数字反映任意给定氨基酸出现在每一个位置上的概率。PSSM 的数字还反映在比对中每一个位置发生保守替换或非保守替换的影响，这与 PAM 或 BLOSUM 矩阵的作用很相似。随后，这个 PSSM 可以用于与单条序列比较；也可以用于迭代方法，在该方法中新发现的序列可被并入原始 PSSM，以寻找更多可能感兴趣的序列。

The Method

以一条感兴趣的 query sequence 为起点，PSI-BLAST 的流程首先取一条 query protein sequence，并按前文所述执行一次标准 BLASTP 搜索。该搜索会产生一批 E values 优于某个设定阈值的 hits。这些 hits 连同最初的单条 query sequence 一起，被自动用于构建一个 PSSM。PSSM 构建完成后，它随即作为 query，对目标数据库执行新的搜索；这一次搜索利用已识别序列的集合特征来寻找新的相关序列。该过程逐轮继续，直到搜索收敛，或达到迭代次数上限为止。这里的收敛是指上一轮中没有发现新的序列。

Performing a PSI-BLAST Search

PSI-BLAST 搜索可以从 BLAST landing page（图 3.5）上的 Protein BLAST 链接启动。图 3.14 所示的搜索页面与本章前面 BLASTP 示例中展示的页面相同。这里将使用 UniProtKB/Swiss-Prot 中的人类 sex-determining protein SRY（Q05066）作为 query，使用 UniProtKB/Swiss-Prot 作为目标数据库，并将返回结果限制为人类序列。在 Program Selection 部分选择 PSI-BLAST，并且像前面一样，对默认参数作若干选择性修改（图 3.15）。Maximum number of target sequences 已从 500 提高到 1000，这是为了防止 UniProtKB/Swiss-Prot 中有大量序列与 query 匹配。同时，E value threshold 和 PSI-BLAST threshold 都被改为 0.001，并启用了对低复杂度区域的过滤。此时，用户可以像前面一样，点击页面底部的蓝色 “BLAST” 按钮提交 query。

第一轮搜索结果如图 3.16 所示；在写作本书时，第一轮找到了 31 条序列。Hit list table 的结构与前面完全相同，但现在包含两个 PSI-BLAST 特有的附加列。第一列显示一列复选框，并且这些复选框全部被选中；这会指示算法使用所有这些序列，为本次特定搜索构建第一个 PSSM。需要记住，任何 PSI-BLAST 搜索的第一轮本质上都只是一次 BLASTP 搜索，而且此时还没有构建 PSSM；因此，第二个附加列为空。若要运行 PSI-BLAST 的下一轮迭代，只需点击该部分底部的 “Go” 按钮。此时，第一个 PSSM 会根据被选中纳入的序列所形成的 multiple sequence alignment 构建出来，并且该矩阵现在被用作 query 来搜索 Swiss-Prot。第二轮结果如图 3.17 所示；最后两列显示哪些序列将用于构建下一轮搜索的新 PSSM，以及哪些序列曾用于构建当前这一轮的 PSSM。还应注意，许多序列以黄色高亮显示；这里有 26 条在第一轮中低于 PSI-BLAST threshold 的新增序列已经被纳入搜索结果。这很好地展示了 PSSM 如何在 PSI-BLAST 的每次迭代中发现新的关系，从而使研究者能够识别出使用标准 BLASTP 方法可能无法找到的其他同源物。当然，在把所有返回结果传递到下一轮之前，用户应始终检查这些结果的 E values 和 percent identities，并根据需要取消勾选 inclusion boxes。也可能存在这样的情况：根据已有生物学知识，某些已找到序列应当因其 descriptors 而被移除。与所有计算方法一样，在审查结果时始终把生物学放在心里是非常重要的。

图 3.13 构建 position-specific scoring matrix（PSSM）。图的上半部分是一段长度为 10 的 multiple sequence alignment。按照正文中描述的标准，与该 multiple sequence alignment 对应的 PSSM 显示在图的下半部分。PSSM 的每一行对应 multiple sequence alignment 中的一列。注意，比对的第 8 位始终含有一个 threonine residue（T），而第 10 位始终含有一个 glycine（G）。查看矩阵中的对应分数可见，在第 8 行中 threonine 得 150 分；在第 10 行中 glycine 也得 150 分。这些是所在行中的最高值，对应于 multiple sequence alignment 在这些位置显示绝对保守性这一事实。现在再看第 9 位，该位置上多数序列为 proline（P）。在 PSSM 第 9 行中，proline 得 89 分，仍然是该行中的最高值，但低于如果所有序列中 proline residue 都绝对保守时所会得到的分数。PSSM 的第一列给出推断出的 consensus sequence。

图 3.14 执行 PSI-BLAST 搜索。详见正文说明。

图 3.15 选择 PSI-BLAST 搜索的算法参数。详见正文说明。

图 3.16 PSI-BLAST 搜索第一轮的结果。对于每一条找到的序列，用户会看到来自相应 UniProtKB/Swiss-Prot 条目的 definition line、最佳 high-scoring segment pair（HSP）比对的 score value、所有 HSP 比对分数的总和、HSP 覆盖 query 的百分比，以及最佳 HSP 比对的 E value 和 percent identity。带超链接的 accession number 允许用户直接访问该 hit 在源数据库中的记录。那些 “Select for PSI blast” 框被勾选的序列，将用于计算 position-specific scoring matrix（PSSM）；随后该 PSSM 会作为下一轮的新 “query”，其结果见图 3.17。

图 3.17 PSI-BLAST 搜索第二轮的结果。通过使用基于图 3.16 所示结果计算出的 position-specific scoring matrix（PSSM）而识别出的新序列，以黄色高亮显示。最右侧列中的勾号表示哪些序列被用于构建产生这些结果的 PSSM。

BLAT

> 来源：Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Sequences and Genomes, 4th ed.

> 范围：PDF page 86 下部 - PDF page 91 顶部跨页图注；印刷页码 66-71。

> 实际 PDF 小节名：BLAT。

> 用途：

BLAT 是为满足 Human Genome Project 的组装需求而引入的一种新的核苷酸序列比对程序（BLAST-Like Alignment Tool）（Kent 2002）。BLAT 与 BLAST 的 MegaBLAST 版本最为相似，因为它的设计目标是快速比对长度更长、相似度超过 95% 的核苷酸序列。不过，BLAT 算法采用了一种与 BLAST 略有不同的策略来实现更快的速度。在执行任何搜索之前，目标数据库都会先完成预索引，记录所有互不重叠的 11-mers；随后利用这个索引来寻找与 query sequence 相似的区域。BLAT 常用于确定某条感兴趣序列在基因组中的位置，或进行跨物种分析。

例如，假设某研究者希望将来自 Cancer Genome Anatomy Project（CGAP）的一个 cDNA clone 映射到大鼠基因组。图 3.18 显示了 BLAT query page，感兴趣的 clone 序列已粘贴到 sequence box 中。在 sequence box 上方，有若干 pull-down menus，可用于指定要搜索的是哪个基因组（organism）、使用哪个 assembly（通常是最新版本），以及 query type（DNA、protein、translated DNA 或 translated RNA）。完成相应选择后，点击 “Submit” 按钮即可开始搜索。查询结果显示在图 3.19 的上方面板中；这里，得分最高的 hit 排在列表顶部，是一个与 query sequence 具有 98.1% identity 的匹配。若要获取该 hit 的更多信息，可以点击该条目左侧的 “details” hyperlink。随后会返回一个较长的网页，其中提供原始 query、基因组序列，以及 query 与所找到的基因组序列之间的 alignment。

图 3.18 提交 BLAT 查询。这里的 query 是来自 Cancer Genome Anatomy Project Tumor Gene Index 的一个大鼠克隆（CB312815）。页面顶部的 pull-down menus 可用于指定要搜索的基因组（organism）、使用的 assembly（通常是最新版本），以及 query type（DNA、protein、translated DNA 或 translated RNA）。“I’m feeling lucky” 按钮只返回得分最高的 alignment，并直接进入 UCSC Genome Browser。

图 3.19 BLAT 查询的结果。根据图 3.18 中提交的 query，最高分的 hit 是大鼠基因组染色体 5 上的一段序列，其 sequence identity 为 98.1%。点击 “details” hyperlink 后，用户会看到关于该序列的更多信息，如下方面板所示。cDNA 与基因组序列中的匹配碱基以深蓝色显示，并以大写字母表示；较浅的蓝色大写字母标记了比对区域的边界，并且常常表示 splice sites。缺口用小写黑字表示。在 side-by-side alignment 中，精确匹配由两条序列之间的竖线表示。

FASTA

> 来源：Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Sequences and Genomes, 4th ed.

> 范围：PDF page 90 下部 - PDF page 95；印刷页码 70-75。

> 实际 PDF 小节名：FASTA。

> 用途：

虽然检测序列相似性最常用的技术是 BLAST，但它并不是唯一能够快速且准确地比较序列的 heuristic method。事实上，第一个被广泛用于数据库相似性搜索的程序是 FASTA（Lipman and Pearson 1985; Pearson and Lipman 1988; Pearson 2000）。与 BLAST 一样，FASTA 使用户能够快速地将一条 query sequence 与大型数据库进行比较，并且该程序有多个版本可用（表 3.3）。除主要实现之外，还有多种专门化的 FASTA 版本，详见 Pearson（2016）。一个有趣的历史细节是，用于表示核苷酸和蛋白质序列的 FASTA format，正是随着 FASTA 算法的发展而产生的。

表 3.3 主要 FASTA 算法。

The Method

FASTA 算法可以分为四个主要步骤。在第一步中，FASTA 会在 query sequence 和目标数据库中的每一条序列中，确定某一长度的所有 overlapping words，并在此过程中创建两个列表。这里的 word length 参数称为 ktup，相当于 BLAST 中的 W。随后，这些 overlapping words 列表会相互比较，以识别两个列表中共有的 words。接着，该方法寻找彼此距离很近的 word matches，并将它们相互连接起来，中间序列也包括在内，但不引入任何 gaps。这可以用 dotplot format 表示（图 3.20a）。完成这一轮初始连接后，会为每一个相似区域计算一个初始分数（init1）。

在第二步中，对于给定的一次 pairwise alignment，只有 10 个最佳区域会被纳入进一步分析（图 3.20b）。此时，FASTA 会尝试把 dotplot 中彼此接近、但不位于同一条对角线上的相似区域连接在一起，目的是延长 alignment 的整体长度（图 3.20c）。这意味着现在允许插入和缺失，但每连接一条对角线都要付出 joining penalty。任意两条已连接对角线的净分数，是原始对角线分数之和减去 joining penalty。这个新分数称为 initn。

在第三步中，FASTA 对所有得到的对角线进行排序，然后只进一步考虑列表中“最佳”的对角线。对于每一条最佳对角线，FASTA 使用 Smith-Waterman algorithm（1981）的一种改良形式，在正在考虑的两条序列之间得到最优 pairwise alignment。随后在这个 pairwise alignment 上计算最终的最优分数（opt）。

在第四步，也是最后一步中，FASTA 通过估计随机生成序列的预期分数分布来评估 alignment 的显著性；这些随机序列具有相同的总体组成，即相同的序列长度以及氨基酸或核苷酸分布。基于这一随机化过程和原始 query 的结果，FASTA 计算 expectation value E（类似于 BLAST E value）；与前文一样，它表示某个报告的 hit 纯粹由偶然产生的概率。

图 3.20 FASTA 搜索策略。（a）一旦 FASTA 确定了 query sequence 和 target sequence 中共有的长度为 ktup 的 words，它就会连接彼此接近的 words，这些连接由对角线表示。（b）经过一轮初始评分后，选择排名前 10 的对角线进行进一步分析。（c）应用 Smith-Waterman algorithm，在正在考虑的两条序列之间得到最优 pairwise alignment。详见正文说明。

Running a FASTA Search

University of Virginia 提供了一个用于提交 FASTA queries 的 web front-end。该页面提供多种蛋白质和核苷酸数据库，并且一次运行最多可以选择两个数据库。在这个页面上，用户还可以指定要使用的 scoring matrix、gap and extension penalties，以及 ktup 的取值。对于基于蛋白质的搜索，ktup 的默认值为 2；对于基于核苷酸的搜索，默认值为 6。降低 ktup 的取值会提高运行的 sensitivity，但代价是速度下降。用户还可以将返回结果限制在特定的 E values 范围内。

FASTA query 返回的结果格式与 BLAST 返回的格式明显不同。以高度再生的刺胞动物 Hydractinia 中 histone H2B.3 的序列为例，这是一种用于替代 protamines 来压缩精子 DNA 的四种新型 H2B variants 之一（KX622131.1; Török et al. 2016）。将该序列作为 query，使用 BLOSUM62 作为 scoring matrix，并以 Swiss-Prot 作为目标数据库，得到的 FASTA 输出第一部分如图 3.21 所示，它以 histogram 的形式汇总结果。该 histogram 旨在表示本次特定搜索过程中计算出的所有 similarity scores 的分布。第一列表示 similarity scores 的 bins，分数随着页面向下而增加。第二列给出实际观察到落入每个 bin 的序列数量。这个计数也由 histogram 中每一行的长度表示，其中每个等号表示一定数量的序列；在该图中，每个等号对应 UniProtKB/Swiss-Prot 中的 130 条序列。第三列数字表示预期会落入每个 bin 的序列数量；在 histogram 中，这由星号表示。Hit list 会紧随其后；图 3.22 显示了本次搜索 hit list 的一部分。这里给出了每个 hit 的 accession number 和 partial definition line，同时还给出了 optimal similarity score（opt）、normalized score（bit）、expectation value（E）、percent identity 和 percent similarity 数值，以及 aligned length。这里没有显示每个 hit 与原始 query sequence 的 individual alignments；这些内容需要在输出中继续向下滚动才能看到。在 pairwise alignments 中，精确匹配由冒号表示，而 conservative substitutions 由点表示。

图 3.21 一次 protein-protein FASTA 搜索的 search summary，该搜索使用来自 Hydractinia echinata 的 histone H2B.3 序列（KX622131.1; Török et al. 2016）作为 query，并使用 BLOSUM62 作为 scoring matrix。Header 表明 query 是针对 Swiss-Prot database 执行的。Histogram 显示本次搜索计算出的所有 similarity scores 的分布。最左侧一列给出 normalized similarity score，标记为 opt 的列给出具有该分数的序列数量。标记为 E() 的列给出预期会达到第一列中该分数的序列数量。在本例中，histogram 中每个等号表示 Swiss-Prot 中的 130 条序列。每一行中的星号表示预期的随机 hits 分布。插图是该区域 histogram 的放大版本。

图 3.22 图 3.21 所述 protein-protein FASTA 搜索的 hit list。这里只显示前 18 个 hits。对于每个 hit，图中提供其 accession number 和 partial definition line。标记为 opt 的列给出 raw similarity score；标记为 bits 的列给出 normalized bit score，即两条序列之间相似性的一种度量；标记为 E 的列给出 expectation value。百分比列分别表示 percent identity 和 percent similarity。alen 列给出每个 hit 的 total aligned length。某些行开头显示的 +- 字符表示 query 和 subject 之间发现了不止一个 alignment；在第一个 hit（Q7Z5P9）的情况下，返回了四个 alignments。每行末尾的 align link 会把用户带到该 hit 的 alignment（图中未显示）。

Statistical Significance of Results

与前文一样，FASTA 搜索中的 E values 表示某个 hit 纯粹由偶然产生的概率。Pearson（2016）提出了以下从基于蛋白质的搜索中推断 homology 的指导原则，这些原则与前面为 BLAST 描述的原则略有不同：E value < 10^-6 几乎必然意味着 homology。当 E < 10^-3 时，query 与找到的 sequences 几乎总是 homologous，但用户应确保得分最高的非相关序列的 E value 接近 1。

Comparing FASTA and BLAST

由于 FASTA 和 BLAST 都采用严谨的算法来寻找在统计上，并且希望在生物学上，相关的序列，因此很自然会问哪一种方法是更好的选择。实际上，这个问题并没有一个很好的答案，因为两种方法都各有重要优势。下面总结了一些区分两种方法的细节。

• FASTA 在搜索开始时寻找 words 的 exact matches，而 BLAST 在第一步中允许 conservative substitutions。
• BLAST 允许自动 masking sequences，而 FASTA 不允许。
• 对 hit list 中的一条序列，FASTA 只会返回一个且仅一个 alignment；而 BLAST 可以为同一条序列返回多个结果，每个结果代表一个不同的 HSP。
• 由于 FASTA 使用了更严格的 Smith-Waterman alignment method 的一个版本，它通常会产生更好的最终 alignments，并且比 BLAST 更容易找到远缘相关序列。对于高度相似的序列，二者的性能相当接近。
• 当比较 translated DNA sequences 与 protein sequences，或反向比较时，FASTA 允许 frameshifts；具体而言，FASTX/FASTY 用于 translated DNA -> protein，TFASTX/TFASTY 用于 protein -> translated DNA。
• BLAST 运行速度快于 FASTA，因为 FASTA 的计算量更大。

已有多项研究试图通过使用测试数据集进行系统分析，回答“哪种方法更好”这个问题（Pearson 1995; Agarawal and States 1998; Chen 2003）。在其中一项研究中，Brenner et al.（1998）使用一个来自 Structural Classification of Proteins database（SCOP；第 12 章）的数据集进行测试，该数据集基于其中记录的已知 homologies。他们发现，在寻找 sequence identity >30% 的蛋白质之间关系时，FASTA 的表现优于 BLAST，而所有方法在低于 30% 时性能都会下降。重要的是，虽然在寻找已知关系时，BLAST 报告的统计值略微低估了真实错误程度，但他们发现 BLAST 和 FASTA（ktup = 2）都能够检测到大多数已知关系，并称二者都“适合快速初始搜索”。

Summary

> 来源：Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Sequences and Genomes, 4th ed.

> 范围：PDF page 96；印刷页码 76。

> 实际 PDF 小节名：Summary。

> 用途：

执行 pairwise sequence alignments 并解释这类分析结果的能力，已经成为几乎所有生物学家的常规技能，不再只是 bioinformaticians 才会使用的技术。随着时间推移，这些方法一直在持续演化，以跟上数据类型和数据规模的变化；这些数据既来自单个实验室，也来自系统性的生物体测序项目。

与所有计算技术一样，读者应当牢固掌握其底层 algorithm，并始终牢记该 algorithm 的能力和局限。合理使用本章介绍的工具，可以带来有力而有趣的生物学发现；但也已有许多案例表明，不当使用这些工具会导致错误的生物学结论。理解这些方法后，用户就能够以最佳方式使用它们，并获得比把这些方法简单视为 “black box” 时更好的结果。

随着生物学越来越多地以 sequence-based 的方式开展，即使用序列数据来支撑实验设计和实验结果解释，对计算结果进行交叉检查也变得越来越重要。例如，由 BLAST 和 FASTA 生成的结果，应当在实验室中、依据文献，并结合额外的计算分析来核查，以确保由此得出的任何结论不仅在生物学上合理，而且实际上也是正确的。

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Internet Resources

> 范围：PDF page 96；印刷页码 76。

> 实际 PDF 小节名：Internet Resources。

BLAST

European Bioinformatics Institute（EBI）

www.ebi.ac.uk/blastall

National Center for Biotechnology Information（NCBI）

blast.ncbi.nlm.nih.gov

BLAST-Like Alignment Tool（BLAT）

genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat

NCBI Conserved Domain Database（CDD）

ncbi.nlm.nih.gov/cdd

Cancer Genome Anatomy Project（CGAP）

ocg.cancer.gov/programs/cgap

FASTA

EBI

www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta

University of Virginia

fasta.bioch.virginia.edu

RefSeq

ncbi.nlm.nih.gov/refseq

Structural Classification of Proteins（SCOP）

scop.berkeley.edu

Swiss-Prot

www.uniprot.org

译文：Further Reading and References

章节：Ch3 Assessing Pairwise Sequence Similarity: BLAST and FASTA

小节：Further Reading & References

PDF 页码：96-98 | 印刷页码：76-78

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延伸阅读

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作者声明

本章由 Andreas D. Baxevanis 博士以个人身份撰写。不应暗示或推断其获得了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）或美国卫生与公众服务部（United States Department of Health and Human Services）的官方支持或认可。

第4章 基因组浏览器

作者：Tyra G. Wolfsberg

引言

第一个真核生物基因组完整序列——酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）基因组——发表于 1996 年（Goffeau et al. 1996）。该生物的染色体大小范围为 270–1500 kb，这立刻带来了数据管理上的挑战，因为当时 GenBank 单条数据库记录的上限只有 350 kb。为了更好地管理酵母基因组序列，以及当时陆续提交到 GenBank 的其他染色体级和基因组级序列，美国国立卫生研究院（NIH）下属的美国国家生物技术信息中心（NCBI）建立了 Entrez 的 Genomes 分部（Benson et al. 1997）。这一分部中的记录围绕参考序列（reference sequence）组织，并将该物种的其他序列比对到该参考序列上。由于这些参考序列没有长度上限，因此可以把较短的 GenBank 序列拼装成大型基因组或整条染色体的“虚拟”参考序列。对于仅完成部分测序的染色体，NCBI 还开发了将遗传图谱、物理图谱和细胞遗传学图谱整合到整条染色体框架中的方法。由此，Entrez Genomes 成为了最早能够提供大尺度基因组序列数据图形化视图的系统之一。

2001 年 2 月完成的人类基因组工作草图（Lander et al. 2001）为每条人类染色体生成了一个虚拟参考序列，其长度范围为 46–246 Mb。为了显示这些更长的序列，NCBI 很快建立了第一版人类 Map Viewer（Wheeler et al. 2001）。大约在同一时期，加州大学圣克鲁兹分校（UCSC）Genome Bioinformatics Group 也在开发自己的人类基因组浏览器，它最初基于一个用于展示更小的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）基因组的软件框架（Kent and Zahler 2000）。与此同时，欧洲分子生物学实验室欧洲生物信息学研究所（EMBL-EBI）的 Ensembl 项目，也在构建一个能够自动注释人类基因组序列、并对数据进行存储与可视化的系统（Hubbard et al. 2002）。这三个基因组浏览器几乎在同一时期上线，研究人员也开始利用它们来导航人类基因组（Wolfsberg et al. 2002）。如今，这些站点不仅免费提供人类序列数据，还提供大量其他已组装的基因组序列，从常用模式生物如小鼠，到较新发布的家养火鸡基因组装版本。虽然 NCBI 的 Map Viewer 已不再继续开发，并将由新的 Genome Data Viewer 取代（Sayers et al. 2019），但 UCSC 和 Ensembl Genome Browser 仍然是生物信息学与基因组学群体中最常使用、最受欢迎的资源。本章将主要聚焦于后两者。

参考人类基因组采用 clone-by-clone shotgun sequencing strategy（逐克隆鸟枪法测序策略）完成测序，并于 2003 年 4 月被宣布完成，尽管某些特定区域的测序工作至今仍在继续。这一策略包括：先为每条人类染色体构建细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC）铺瓦图（tiling map），然后再使用 shotgun sequencing approach（鸟枪法测序方法）对每个 BAC 进行测序（综述见 Green 2001）。

单个 BAC 的序列在获得后会被提交到 GenBank 的 High Throughput Genomic（HTG）分部。UCSC 自 2000 年 5 月起开始将这些 BAC 序列组装成更长的 contig（Kent and Haussler 2001），随后 NCBI 也开展了相应的组装工作（Kitts 2003）。这些 contig 含有缺口以及排列顺序尚不确定的区域，正是它们构成了基因组浏览器开发的基础。随着基因组测序逐步完成，人类基因组组装版本每隔几个月就会更新一次。UCSC 在 2001 年 8 月停止自行生成人类基因组组装版本后，NCBI 为生物信息学社区构建了 8 个参考人类基因组组装，最终以 2006 年 3 月的最后一个版本收尾。此后，Wellcome Trust Sanger Institute（WTSI）、华盛顿大学基因组研究所、EBI 和 NCBI 等机构组成了国际协作组织 Genome Reference Consortium（GRC），接管了后续人类基因组组装的维护工作。该联盟随后发布了两个主要的人类基因组组装版本：2009 年 2 月的 GRCh37 和 2013 年 12 月的 GRCh38。

正如人们所预期的那样，每一次新的基因组组装都会引起已注释特征（annotated features）序列坐标的变化。在主要组装版本发布之间，GRC 还会发布 patch（补丁），用于纠正组装错误或加入 alternate loci（替代位点）。所谓替代位点，是对那些变异过于丰富、无法由单一参考序列充分表示的区域给出的多种表示方式，例如 19 号染色体上的 killer cell immunoglobulin-like receptor（KIR）基因簇，以及 6 号染色体上的 major histocompatibility complex（MHC）位点。与新的基因组组装不同，patch 不会改变已注释特征的染色体坐标。GRCh38.p10 共包含 282 个替代位点或补丁。

虽然 GRC 也负责组装小鼠、斑马鱼和鸡的基因组，但其他物种的基因组通常由专门的测序联盟完成测序与组装。2009 年发表的大熊猫基因组，是第一个放弃人类和小鼠所用克隆式测序策略、完全依赖 next generation sequencing（下一代测序）方法完成的哺乳动物基因组（Li et al. 2010）。随着测序技术不断进步，完整基因组序列的数量也迅速增加。写作本章时，UCSC Genome Browser 和 Ensembl 主站都已收录超过 100 个物种的基因组组装。无论显示的是哪一种物种，这些基因组浏览器在整体界面风格和使用方式上基本一致；但由于不同物种可获得的数据不同，其注释内容和注释种类也会有所差异。

每个浏览器的骨架都是一个已经组装完成的基因组序列。尽管在极少数例外之外，两种浏览器所依托的基因组底层序列是相同的，但两支团队分别独立计算各自的注释结果。因此，针对不同类型的分析任务，用户可能会发现某一个浏览器提供的信息比另一个更相关。已知基因和预测基因的位置，都是两个浏览器共同关注的核心内容。就当前的人类基因组而言，这两个浏览器都整合了 GENCODE 基因预测结果，这是一项旨在提供稳健、基于证据的参考基因集的工作（Harrow et al. 2012）。此外，其他类型的基因组数据也会被映射到基因组组装上，包括 NCBI 参考序列、单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms, SNPs）及其他变异、基因调控区域、基因表达数据，以及来自其他物种的同源序列。用户既可以通过网页界面，以图形化方式浏览基因组；也可以在需要自行计算时，以文本格式提取序列和注释信息。每个浏览器还都提供序列搜索工具——BLAT（Kent 2002）或 BLAST（Camacho et al. 2009）——用于以核酸或蛋白质序列作为查询，对数据进行检索。（有关 BLAT 和 BLAST 的更多信息，见第 3 章。）

为了保持结果稳定，并确保旧分析可重复，两个基因组浏览器不仅提供当前版本的基因组组装，也保留旧版本。此外，诸如 GENCODE gene track 和 SNP track 之类的 annotation track（注释轨道），也可能基于不同版本的底层数据构建。因此，当用户在 UCSC 与 Ensembl Genome Browser 之间比较某一感兴趣区域时，应核对所有相关数据的版本，包括基因组组装版本和注释版本。

本章将给出使用 UCSC 和 Ensembl Genome Browser 访问基因组序列及注释信息的一般性指导。虽然许多类似的分析在两个浏览器中都可以完成，但本章刻意在两个站点分别选用不同示例，以展示研究者可能提出的不同类型问题。最后，本章还将简要介绍 JBrowse（Buels et al. 2016）——这是一种基于 Web 的基因组浏览器，用户可以部署在自己的服务器上，用于共享自定义基因组组装和注释。第 4 章所讨论的所有资源均可免费使用。

Ch4 Genome Browsers / The UCSC Genome Browser

UCSC 基因组浏览器

本章介绍使用 UCSC 与 Ensembl 基因组浏览器访问基因组序列和注释的一般指南。虽然两种浏览器都可以进行类似的分析，但我们在两个站点采用了不同的示例，以展示研究者可能提出的不同类型的问题。最后，我们简要介绍 JBrowse（Buels et al. 2016），这是一种基于 Web 的基因组浏览器，用户可在自己的服务器上部署，用于共享自定义的基因组组装和注释。本章讨论的所有资源均可免费获取。

UCSC 基因组浏览器

UCSC 基因组浏览器始于 2000 年，最初只显示人类基因组组装的早期草稿。如今，它已提供对 100 多个物种的组装和注释的访问（Haeussler et al. 2019）。大多数组属于哺乳动物基因组，但也包括其他脊椎动物、昆虫、线虫、后口动物以及埃博拉病毒。某些物种（包括人和小鼠）的组装有多个版本。新物种和新版本会定期添加。

UCSC 浏览器以轨道（track）的形式呈现基因组注释。每条轨道提供一种不同类型的特征，从基因到 SNP、预测的基因调控区域以及表达数据。每个物种都有自己的一组轨道，部分由 UCSC 基因组生物信息学团队创建，部分由生物信息学社区的成员提供。人类基因组 GRCh37 版本有 200 多条可用轨道。较新的人类基因组组装 GRCh38 轨道较少，因为并非所有数据都已从旧组装重新映射。其他基因组的注释程度不如人类；例如，海兔只有不到 20 条轨道。某些轨道（例如从 NCBI 转录本数据创建的轨道）可在多个物种中使用；其他轨道则仅适用于一个或少数几个物种。

本章首先介绍如何从 UCSC 主页（Figure 4.1）的 Gateway 链接访问 UCSC 基因组浏览器。默认组装为最新的人类组装（当前为 GRCh38）。也可以在主页上选择其他基因组和组装版本。

开始搜索基因的方式有两种。第一，在浏览器窗口顶部附近的搜索框中输入搜索词（Figure 4.1），浏览器默认会在当前基因组中搜索匹配的基因。第二，使用 BLAT 搜索功能（见下文）。我们将在示例中搜索人类低氧诱导因子 1α 亚基（HIF1A）基因（Figure 4.1），点击 go 后将显示 Figure 4.2 中的视图。

导航控件位于显示区域顶部。箭头用于在染色体上向左或向右移动。缩放控制用于放大或缩小显示区域。点击 zoom out 1.5× 或 zoom out 3× 将使视图从基因扩展到更大范围——不仅显示 HIF1A 本身，还显示其侧翼区域。点击 zoom in 1.5× 或 zoom in 3× 则放大到更小的区域，使单核苷酸级别的细节变得可见。chr position 字段显示当前在浏览器中查看的基因组坐标的范围。可以在该框中手动输入坐标或基因名称并按回车键，而非使用搜索功能。

Figure 4.1 UCSC 基因组浏览器主页，显示在人类 GRCh38 基因组组装上查询 HIF1A 基因。

Source: Reproduced with permission of UCSC Genome Browser, https://genome.ucsc.edu.

在 Figure 4.2 所示的浏览器窗口下方，可以看到一组轨道，按功能逻辑分组。默认情况下，许多轨道处于隐藏状态。要显示隐藏的轨道，可将轨道标签左侧的按钮从 hide 改为 dense、pack 或 full。dense 模式将所有特征压缩为单行显示；pack 模式以节省空间的方式显示轨道，通常使用多行；full 模式显示关于每个特征的最详细信息。

Figure 4.2 UCSC 基因组浏览器的默认视图，显示人类 HIF1A 基因的基因组上下文。

位于浏览器图形窗口（Figure 4.2）下方，是按功能分组的轨道列表。Genes and Gene Predictions 部分包含基因注释轨道。ENCODE Regulation 和 ENCODE Combined 部分包含添加了实验数据的轨道。Variation and Repeats 部分包含 dbSNP 常见 SNP 轨道，以及重复序列轨道。轨道的颜色、注释细节等设置也可以在 Track Settings 页面中配置。

每条轨道显示为水平条带，轨道上方有标题，轨道内部有标签。某些轨道还包含轨道项目的描述或显示控制（Figure 4.2）。轨道以 densen 模式显示为单行，例如默认显示在 UCSC 浏览器中的 RefSeq 和 GENCODE 轨道。

修改轨道显示

点击轨道标题行的任意位置或轨道最左侧的按钮（Figure 4.2），可进入 Track Settings 页面。这里，用户可以设置轨道可见性——dense、pack、full 或 hide。还可以配置特定于该轨道的设置，例如用于显示轨道项的颜色或数据子集。

当前视图以 full 模式显示参考基因和 GENCODE 注释 V41，以 dense 模式显示 RefSeq 注释。GENCODE 和 RefSeq 轨道在 pack 模式下显示为一个紧凑的概览，每行展开多个转录本。

点击 zoom out 3× 三次，视图将从单个基因扩展约 27 倍，显示 HIF1A 的上游和下游区域（Figure 4.3）。另一个 HIF1A 反义转录本（HIF1A-AS1）变得可见。请注意，在 dense 模式下，外显子显示为块状，而 full 模式则会显示带有内含子/外显子边界和外显子编号的整个转录本（Figure 4.2）。

Figure 4.3 点击 zoom out 3× 后人类 HIF1A 基因的基因组上下文。HIF1A 上游紧邻的基因（FLJ22447）和下游紧邻的基因（HIF1A-AS2 和 HIF1A-AS1）现在可见。

Source: Reproduced with permission of UCSC Genome Browser, https://genome.ucsc.edu.

在 Genes and Gene Predictions 部分中，将 UCSC Genes 轨道设置为 hide，将 RefSeq Curated 轨道的标签左侧按钮改为 full，点击 Track Settings 页面底部的 submit 按钮。产生的 Track Settings 页面（Figure 4.4）允许用户选择要显示哪种类型的 RefSeq，包括 curated RefSeq mRNAs（NM_ 前缀）、RefSeq predicted mRNAs（XM_ 前缀）等。选择 NM_ 后点击 submit，并将 RefSeq Curated 轨道的显示模式从 dense 改为 full，得到 Figure 4.5 的图形视图。

Figure 4.4 RefSeq Track Settings 页面。Track Settings 页面用于配置注释轨道的显示。默认情况下，所有 RefSeq curated mRNAs（NM_ 前缀）都会显示。

Figure 4.5 在 full 模式下显示 RefSeq Curated 基因后人类 HIF1A 基因的基因组上下文。每条 RefSeq 转录本都显示在一个独立的行上，带有外显子-内含子结构显示。这与 Figure 4.2 形成对比，后者所有 RefSeq 转录本都被压缩为单行。

Figure 4.6 Get Genomic Sequence 页面，为用户提供检索感兴趣特征序列的界面。点击某个转录本的外显子可访问此页面。

检索序列

向下滚动至 Figure 4.3 图形视图的底部，可以找到 Display 按钮附近的 DNA 链接。点击该链接会显示 Get Genomic Sequence 页面（Figure 4.6）。用户可以选择提取整个浏览器窗口对应的区域序列，也可以选择连接到单个转录本的序列。通过下拉菜单（Figure 4.6），用户可以选择外显子、编码区、5′ UTR 或 3′ UTR 的序列。输出的格式可以是以 FASTA 格式显示序列，选择小写字母表示重复序列，或字母中包含内含子——这有助于查看可变剪接模式。

添加注释轨道

在 Figure 4.3 所示的图形视图下方，可以看到来自 ENCODE（Encyclopedia of DNA Elements）项目的轨道。这些轨道提供了跨多种细胞类型的转录组和表观基因组数据。为了显示与 HIF1A 基因座相关的 H3K4Me3 组蛋白修饰数据，找到 ENCODE Regulation 超轨道，并通过下拉菜单将 H3K4Me3 标志的显示从 hide 改为 full。SNAPC1 等基因的 H3K4Me3 峰在 Figure 4.7 中可见。

添加 SNP 数据可以使研究者将基因组特征与已知变异联系起来。滚动至 Variation and Repeats 部分，将 Common SNPs(150) 轨道从 hide 改为 full。打开此轨道的 Track Settings 以修改其显示（Figure 4.8）。在 Coloring Options 部分，将所有选项设为黑色，except missense 设为黑色，except synonymous 设为黑色。将 5′ UTR 和 3′ UTR SNP 设置为蓝色。设置如图 Figure 4.8 所示。点击 submit 后，synonymous 和 untranslated SNP 将以蓝色清晰可见（Figure 4.9）。

Figure 4.7 将 H3K4Me3 峰从 hide 改为 full 显示后人类 HIF1A 基因的基因组上下文。H3K4Me3 轨道是 ENCODE Regulation 超轨道的一部分。

Figure 4.8 配置 Common SNPs(150) 轨道的 Track Settings。将 Coloring Options 设置为所有 SNP 均为黑色，除错义 SNP（也设为黑色）和同义 SNP（设为黑色）外，5′ 和 3′ UTR 区域的 SNP 设为蓝色。

Figure 4.9 按 Figure 4.8 所示更改 Common SNPs(150) 轨道的颜色和显示模式后的人类 HIF1A 基因基因组上下文。HIF1A GENCODE 转录本的 5′ 和 3′ UTR 中的 SNP 现在显示为蓝色，而非同义 SNP 仍然为黑色。

比较基因轨道

在 Genes and Gene Predictions 部分下方，将 GENCODE V41 轨道设置为 pack 模式。hide MANE Select 和 MANE Plus Clinical 轨道。Figure 4.10 以 pack 模式显示了 Gene 轨道，以及 Figure 4.2 中使用的 full 模式 RefSeq Curated 轨道的对比。在 pack 模式下，转录本被分组以减少重叠，全部显示在节省空间的视图中。该视图提供了一个很好的概览，显示哪些转录本是 GENCODE、RefSeq 或两者共有的。例如，HIF1A-204 同时属于 GENCODE V41 和 RefSeq Curated 轨道（Figure 4.10）。GTEx Transcript 轨道类似，但展示的是来自基因型-组织表达（GTEx）项目的表达数据（Figure 4.10 插图）。

Figure 4.10 以 pack 模式显示的 Gene 轨道与 full 模式显示的 RefSeq Curated 轨道的对比。两个轨道的共享转录本清晰可见（如 HIF1A-204）。

使用 BLAT

BLAST-Like Alignment Tool（BLAT）工具（Kent 2002）可用于将查询序列比对到基因组。BLAT 可以从 UCSC 基因组浏览器主页或 Tools 下拉菜单访问。BLAT 支持 DNA、RNA 或蛋白质序列的比对，可针对一个或多个基因组进行。Figure 4.11 显示了对人类 HIF1A 编码序列进行 BLAT 搜索的结果。结果以得分递减排序，与查询序列完美匹配的结果排在首位。点击 browser 链接可以直接跳转到基因在基因组上下文中的位置。

Figure 4.11 BLAT 搜索结果显示人类 HIF1A 编码序列的比对结果。得分最高的匹配排在最前面。

使用 UCSC Table Browser 进行数据检索

Table Browser（Karolchik et al. 2004）可以通过 UCSC 基因组浏览器主页的 Tools 下拉菜单访问。首先，点击 Table Browser 设置部分底部的 click here 链接可重置所有用户 cart 设置。然后在 GRCh38 基因组组装上选择 NCBI RefSeq 轨道（Figure 4.12a）。创建过滤器，将搜索范围限定为 NM_ 编号系列的 curated mRNA 参考序列（Box 1.2；Figure 4.12b）。接下来，将 RefSeq 轨道与来自 GWAS Catalog 的变异取交集（Figure 4.12c）。最后，在 Table Browser 表单中，将输出格式更改为 Genome Browser 的超链接，然后点击 get output。输出是一个包含 3,000 多个 RefSeq mRNA 的列表，这些 mRNA 与 GWAS Catalog 中的某个变异有重叠（Figure 4.12d）。可以通过点击结果列表中的第一个链接，查看来自 arginine–glutamic acid dipeptide (RE) repeats（RERE）基因的一个转录本以及与其重叠的六个 GWAS Catalog SNP 在基因组浏览器中的视图，如 Figure 4.12e 所示。

Figure 4.12 (a) 在 GRCh38 上选择 NCBI RefSeq 轨道。(b) 创建 NM_ 限定过滤器。(c) 与 GWAS Catalog 变异取交集。(d) 输出 3,000+ 匹配的 RefSeq mRNA。(e) 查看 RERE 基因位点与 GWAS Catalog SNP 的 Genome Browser 视图。

Ch4 Genome Browsers / UCSC Table Browser

UCSC Table Browser

Table Browser 工具为用户提供基于文本的界面，用于查询、取交集、过滤和下载基因组浏览器中以图形方式显示的数据。这些数据可以保存为电子表格以供进一步分析，或作为输入用于其他程序。通过基于 Web 的界面，用户选择基因组组装、轨道和位置，然后选择如何处理轨道数据以及返回哪些字段。

以下示例演示如何检索所有与全基因组关联研究（GWAS）Catalog 轨道中的 SNP 重叠的 NCBI mRNA 参考序列列表。GWAS Catalog 识别与常见疾病或性状相关的遗传位点，是已发表的全基因组关联研究（至少检测 100,000 个 SNP）的人工策划集合，其中所有 SNP-性状关联的 p 值均小于 1 × 10⁻⁵（Buniello et al. 2019）。

Table Browser 的起始页面可以从 UCSC 基因组浏览器主页或 Tools 下拉菜单访问。首先，点击 Table Browser 设置部分底部的 click here 链接，重置所有用户 cart 设置。

然后，在 GRCh38 基因组组装上选择 NCBI RefSeq 轨道（Figure 4.12a）。创建过滤器，将搜索范围限定为 NM_ 编号系列的 curated mRNA 参考序列（Box 1.2；Figure 4.12b）。接下来，将 RefSeq 轨道与来自 GWAS Catalog 的变异取交集（Figure 4.12c）。最后，在 Table Browser 表单中，将输出格式更改为 Genome Browser 的超链接，然后点击 get output。输出是一个包含 3,000 多个 RefSeq mRNA 的列表，这些 mRNA 与 GWAS Catalog 中的某个变异有重叠（Figure 4.12d）。点击结果列表中的第一个链接，可查看来自 arginine–glutamic acid dipeptide (RE) repeats（RERE）基因的一个转录本及其重叠的六个 GWAS Catalog SNP 在 Genome Browser 中的视图，如 Figure 4.12e 所示。

*Figure 4.12 配置 UCSC Table Browser。Table Browser 的链接在每个页面顶部的 Tools 菜单中。(a) 在 Table Browser 主页上，首先点击窗口底部的 reset 按钮重置所有之前的设置。接着，在人类 GRCh38 基因组组装上，从 Genes and Gene Predictions 组中选择名为 NCBI RefSeq 的轨道。区域应设置为 genome，输出格式设置为 hyperlinks to Genome Browser。(b) 创建过滤器，将搜索限定为 NM_ 编号系列的 curated mRNA 参考序列（见 Box 1.2）。点击 Figure 4.12a 中所示的 filter 按钮，在 name 字段中输入 NM_。——是匹配任意文本的通配符。因此，此设置将结果限定为名称中包含 NM_ 的 curated RefSeq。(c) 在 RefSeq 轨道与 GWAS Catalog 变异之间创建交集。点击 Figure 4.12a 中所示的 intersection 按钮，选择相应轨道。组为 Phenotype and Literature，轨道为 GWAS Catalog。其他选项保持默认。(d) 点击 Figure 4.12a 中所示的 get output 按钮。输出是一个包含 3,000 多个与 GWAS Catalog 变异重叠的 RefSeq mRNA 的列表。每个 RefSeq 都有指向 Genome Browser 的超链接。(e) 第一个链接指向 NM_001042682.1，即 arginine–glutamic acid dipeptide (RE) repeats（RERE）基因的一个转录本。RERE 的基因组上下文显示了与其重叠的八个 GWAS Catalog SNP。*

Data Integrator

UCSC 还提供了一个名为 Data Integrator 的相关工具。Data Integrator 的交集功能比 Table Browser 更为复杂，它可以对多达五个独立轨道的数据取交集，并输出选定轨道和相关表中的字段。例如，Data Integrator 的输出可以包括基因符号、RefSeq 轨道上每个转录本的登录号以及 GWAS Catalog 中变异的 dbSNP 标识符。但是，Data Integrator 不支持过滤功能，因此无法将输出限制为仅 RefSeq mRNA 基因。

Ch4 Genome Browsers / ENSEMBL Genome Browser

ENSEMBL 基因组浏览器

Ensembl 基因组浏览器（Cunningham et al. 2019）始于 1999 年（Hubbard et al. 2002），最初用于显示人类基因组组装。与 UCSC 基因组浏览器一样，它在多年来取得了巨大发展。Main Ensembl 站点专注于脊椎动物，涵盖近 90 个物种的组装。Ensembl 还为其他生物类群创建了专门的兄弟数据库，包括 EnsemblPlants（近 50 个物种）、EnsemblMetazoa（近 70 个物种）、EnsemblProtist（100 多个物种）和 EnsemblFungi（800 多个物种），以及非常庞大的 EnsemblBacteria（约 44,000 个物种）。可用基因组数据和注释的数量因物种而异，但浏览器的通用导航原则对所有物种均相同。另一个资源是 Pre!Ensembl，用于显示正在注释过程中的基因组。该站点的基因组具有组装和 BLAST 界面，但大多数情况下没有基因预测。

与 UCSC 基因组浏览器类似，Ensembl 浏览器提供多个版本的基因组组装。组装中可能整合了基因、基因组变异、基因调控和比较基因组学注释。注释被组织为轨道集合。Ensembl 整合了来自多种公共来源的数据，包括 NCBI、UCSC、模式生物数据库等，并通过正式的发布流程更新数据和软件，可通过版本号追踪。重要的是，之前的 Ensembl 版本会被归档并在网站上保留展示。因此，即使基因组组装或注释集已被更新，仍可使用 Ensembl 网站的所有常规功能查看旧数据。这一归档机制使 Ensembl 区别于 UCSC——后者的组装保持稳定，但注释可能每周都会变化。每个 Ensembl 页面底部都有一个名为 View in archive site 的链接，可提供指向该页面旧版本的链接，包括同一基因组组装上的旧注释集以及旧的基因组组装。

Ensembl 浏览器提供许多与 UCSC 基因组浏览器同类型的资源和工具。可以使用 BLAT 或 BLAST 将序列比对到已组装的基因组上。Ensembl 的 BLAST 服务特别适合在含有不易直接通过 BLAT 比对的远缘物种的数据库中进行搜索。对于基因、变异和基因组调控，Ensembl 都有相应的 Tab 来显示相关信息。

Location Tab

Location tab（位置选项卡）是 Ensembl 中最重要的页面。当在搜索框中搜索一个基因时，浏览器会自动重定向到该页面。Figure 4.13 显示了人类 EPAS1 基因的 Location tab。Configuration 面板使您可以选择在页面上显示哪些注释。页面由上至下包括：染色体概览、详细信息面板、基因分布、每个转录本的详细视图以及基因组变异。点击 Configure this page 按钮可以添加或删除轨道。

Figure 4.13 Ensembl Location tab，显示人类 EPAS1 基因。用户可以禁用某些功能以简化页面显示。

Gene Tab

Gene tab（基因选项卡）整合了基因的所有转录本信息（Figure 4.14）。页面顶部显示了与基因相关的表型、变异和文献的总结信息，下方列出了该基因的所有已知转录本。

点击某个转录本右侧的 Show transcript table 可显示更详细的信息，包括外显子坐标、编码区和翻译后修饰。点击 Export data 可下载序列或注释。Orthologues 部分列出了该基因在其他物种中的直系同源物，并带有连锁图标。每个 Ensembl 页面中都有一个 Share 按钮，用于生成指向当前视图的稳定链接。

Figure 4.14 Ensembl Gene tab，显示人类 EPAS1 基因及其多个转录本。

Variant Tab

Variant tab（变异选项卡）（Figure 4.15）用于显示特定变异，例如 dbSNP 中的 rsID、COSMIC 中的突变标识符，或一个 VCF 标识符。它也接受不使用 rs 或 COS 前缀的基因组坐标。该页面总结了已知的表型关联、变异的临床显著性、同义或非同义氨基酸替换、SIFT 和 PolyPhen 预测、等位基因频率以及来自 1000 Genomes Project 和 gnomAD 等源的基因型数据。页面还包括该变异的基因组上下文概览。

Figure 4.15 Ensembl Variant tab，显示 dbSNP rs148731451。页面包括表型关联、临床显著性、SIFT/PolyPhen 预测、等位基因频率等信息。

使用 BLAT 在 Ensembl 中比对序列

Ensembl BLAT（Figure 4.16）可用于将查询序列与一个选定的基因组进行比对。结果会返回匹配的基因组坐标、得分和 identity。Figure 4.16a 显示了人类 EPAS1 编码序列的 BLAT 搜索结果。结果按得分排序，与查询序列完美匹配的结果列于首位。要查看比对的详细信息，包括基因组上下文，点击结果中的 Location 链接（Figure 4.16b），即可打开 Location tab，显示查询序列在基因组中的对应位置，与 UCSC 中的操作类似。

Figure 4.16 (a) Ensembl BLAT 搜索结果，显示人类 EPAS1 编码序列的比对。(b) 点击 Location 链接可查看比对的基因组上下文。

查看共线性（Synteny）

Ensembl 可以计算并展示跨物种的高度保守共线性区域。例如，Figure 4.17 显示了人类 2 号染色体与小鼠 1 号染色体之间的共线性。共线性块使用不同颜色编码，并显示基因组坐标。比较基因组学注释还包括直系同源列表、基因树以及基于蛋白质家族的基因分类。

Figure 4.17 人类 2 号染色体与小鼠 1 号染色体之间的共线性。共线性块使用不同的颜色表示。

使用 BLAST 在 Ensembl 中比对序列

Ensembl 中的 BLAST 搜索同样可以从 Tools 菜单访问。Figure 4.18 显示了人类 ADAM18 蛋白质序列（NP_055035.1）在与斑马鱼翻译基因组数据库比对时的 BLAST 结果。注意，结果按 E-value 排序。点击结果条目可查看该蛋白质在斑马鱼基因组上下文中的视图。Figure 4.18a 显示了 ADAM18 与斑马鱼翻译基因组之间比对的详细视图，查询序列位于上方，斑马鱼翻译序列位于下方。两条序列仅共享约 46% 的序列 identity。

Figure 4.18 Ensembl BLAST 搜索结果，显示人类 ADAM18 蛋白质序列与斑马鱼基因组的比对。(a) 比对的详细视图。

另见：BLAST 与 BLAT 的对比

当被查询的数据库只包含一个目标物种时，BLAT 和 BLAST 能够很好地工作。但如果数据库包含许多物种，特别是包含进化距离很远的物种时，BLAST 明显更强大。Figure 4.19 显示了将相同的 ADAM18 蛋白质序列（NP_055035.1）与蜥蜴翻译基因组数据库进行 BLAST 比对的结果。在此搜索中，斑马鱼（先前 BLAST 搜索的目标）的结果也出现了，但匹配得分较高的结果是蜥蜴基因组。两条序列只有 32% 的 sequence identity，但比对覆盖了 650 个氨基酸，并且某些关键序列特征得以保留；注意几乎每个半胱氨酸残基都对齐了。因此，这条蜥蜴基因组序列确实是人类 ADAM18 的同源物。BLAST 算法虽然比 BLAT 慢约两个数量级，但能够找到人类蛋白质的蜥蜴直系同源物。

Figure 4.19 Ensembl BLAST 结果，显示将相同的人类 ADAM18 蛋白质序列与蜥蜴基因组数据库比对的结果。BLAST 能够识别出进化距离较远的直系同源物。

在 Ensembl 中使用 Variation 数据

Ensembl 的 Region in detail 页面包含来自 dbSNP 的变异数据，类似于 UCSC 浏览器。Figure 4.20 展示了 EPAS1 区域的一个典型视图，其中变异轨道被设置为显示状态。编码变异以不同颜色显示——例如，编码同义变异以绿色渲染。点击变异可显示一个包含相关信息（如等位基因频率和 SIFT/PolyPhen 预测）的弹出窗口。

Figure 4.20 Ensembl Region in detail 页面，显示人类 EPAS1 区域的变异轨道。编码变异以不同颜色显示——深绿色为同义变异，浅绿色为非编码转录本外显子变异。

在 Ensembl 中查看调控数据

Ensembl 也提供调控注释。Figure 4.21 展示了 EPAS1 基因区域的 H3K4Me3 标记峰。用户可以通过 Configure page 面板选择按细胞类型显示数据。在 Regulation 部分下选择相应的细胞类型，即可在页面上添加调控轨道。

Figure 4.21 Ensembl 调控注释显示 EPAS1 区域的 H3K4Me3 组蛋白标记峰。

Ch4 Genome Browsers / Ensembl Biomart

Ensembl Biomart

BioMart 是一个功能强大的数据检索工具，可用于获取 Ensembl 基因组注释中存储的各种信息。通过在菜单中选择选项，用户可以构建所需的输出——类似于在线购物车。尽管 BioMart 也可以从 Ensembl 主页上的 Tools 菜单访问，但 BioMart 本身是一个独立的网站（Smedley et al. 2015），并作为许多模型生物数据库的数据查询界面。

此示例将展示如何在 Ensembl Biomart 中检索人类 RefSeq 基因 ID（NM_ 编号）与对应小鼠直系同源基因 ID 的映射列表。首先，选择 Ensembl Genes 数据库，然后选择人类 GRCh38 基因组。在过滤器面板中，将 Gene type 过滤为 Protein coding。在 Attributes 面板中，选择 Stable ID 为输出。然后点击 Results 按钮，将结果表下载为 CSV 文件。

Figure 4.22 Ensembl BioMart 界面。(a) 概述：选择数据库和数据集。(b) 过滤器面板：将 Gene type 设为 Protein coding。(c) Attributes 面板：选择要输出的属性，包括外部参考序列 ID。(d) 结果表：列出人类 RefSeq 稳定 ID。

如果需要跨物种数据，点击 Attributes 面板中的 Orthologs，然后选择小鼠直系同源基因数据类型。再次点击 Results 按钮，将获得一个同时包含人类和小鼠基因的表格。此数据表可用作序列文件中的标识符映射表，或用于差异表达数据等其他目的的转换表。

Figure 4.23 Ensembl BioMart 结果表，显示人类 RefSeq 基因稳定 ID 映射列表。

BioMart 的一个强大功能是，在得到结果表后，用户可以点击右上角的齿轮图标，选择 Unique results only 和 Unique results。这可以快速过滤掉重复的结果行。

BioMart 也允许用户使用 Ensembl 的 Variant Effect Predictor（VEP）工具进行变体效应预测。VEP 可以注释变异的相关信息，如基因和转录本、蛋白质位置、SIFT 和 PolyPhen 评分等。Ensembl 网站上也提供了 VEP 的交互式界面。

Ch4 Genome Browsers / JBrowse

JBrowse

JBrowse 是一个现代化、高性能的基因组浏览器，可用于可视化任何已测序基因组的注释。它支持自定义数据集，尤其适合物种特异性数据。JBrowse 由 Grand Central Station（GCS）项目支持，该项目为多个物种提供预加载的 JBrowse 实例（Vincent et al. 2019）。

Figure 4.24 Grand Central Station (GCS) 主页，提供多个 JH Build 物种。

要开始使用 JBrowse，用户可以在 GCS 网站上选择一个物种，点击后浏览器将显示该物种的基因组范围的注释。在顶部搜索栏中输入基因名或坐标，即可导航到目标区域。

Figure 4.25 Grand Central Station (GCS) JBrowse 显示 250-Mb 全基因组范围的基因表达峰值。顶部是典型的查看器控件。

Figure 4.26 搜索 "GAPDH" 后，JBrowse 在向导下的视图。

JBrowse 的核心优势之一是其流畅的浏览体验，协以及轻量级结构。与 UCSC Genome Browser 相比，JBrowse 更适合物种特异性的基因组数据探索。用户可以在 GCS 网站上找到多个物种的 JBrowse 实例，并将其应用于 RNA-seq 或 ChIP-seq 数据的可视化。

Ch4 Genome Browsers / Summary + Internet Resources + Further Reading + References

Figure 4.24（续）JBrowse 显示 Mnemiopsis（栉水母）基因组项目门户（美国国家人类基因组研究所）预测的 Mnemiopsis 基因（ML05372a）的显示视图。此显示界面包含七个轨道：SCF（拼接后的基因组区域为黑色实线，间歇性 gap 为亮粉色）；2.2（共有 Mnemiopsis 基因模型）；PFAM2.2（由 Pfam 导出的非冗余 Mnemiopsis 蛋白结构域）；CL2（来自 Mnemiopsis胚胎的 RNA-seq 读段，使用 Cufflinks（Trapnell et al. 2010）组装为转录本）；MASK（经 VMatch 重复掩蔽的基因组区域，浅蓝色阴影）；EST（来自 GenBank 的 Mnemiopsis 表达序列标签）；GBNT（来自 GenBank 的 Mnemiopsis mRNA 和其他非 EST RNA）。

Summary（本章总结）

UCSC 和 Ensembl 基因组浏览器是成熟的工具，免费提供基于 Web 的基因组组装与注释访问。本章以人类基因组及其可用注释轨道的子集为例，展示了如何通过将轨道添加到默认视图来查看注释基因、序列变异、基因调控区域、基因表达数据等。这些显示高度可定制，用户可以选择显示哪些数据、显示风格，甚至更改注释特征的颜色。两种浏览器不仅支持基于文本的查询（如基因符号或染色体位置），还支持使用核苷酸或蛋白质序列进行搜索。UCSC Genome Browser 支持 BLAT 搜索引擎，而 Ensembl 根据分析类型同时支持 BLAT 和 BLAST。此外，UCSC Table Browser 和 Ensembl 的 BioMart 提供了进入底层数据的替代入口，用户可以利用基于 Web 的界面构建查询，数据以文本形式返回并可下载及进一步处理。

本章中的示例均来自人类基因组的 GRCh38 组装，但 UCSC 和 Ensembl 都托管了许多其他物种的基因组组装。这些基因组的组装可能是较短的支架而非染色体，注释类型也可能少得多，但基因组浏览器的基本外观和功能在不同物种间保持一致。

随着测序技术的发展，即使是较小的实验室现在也能生成全基因组测序数据，包括 ChIP-Seq、RNA-seq、外显子和基因组测序，甚至全新的基因组组装。自 2015 年起，基因组数据共享政策要求所有由 NIH 资助的大规模基因组数据研究必须及时提交至公共数据库。人类数据必须提交到 NIH 指定的数据存储库，而截至本书写作时，非人类数据可以通过任何广泛使用的数据存储库提供。将这些数据展示并与生物学界共享的最佳方式可能是使用基因组浏览器。UCSC 和 Ensembl 基因组浏览器都提供用户上传自定义注释的选项，并可在公共基因组数据的背景下查看。通过 Sessions 或 Track Hubs，用户可以与他人共享这些数据。UCSC 的 Assembly Hubs 功能允许用户利用 Genome Browser 框架共享新测序组装的基因组。此外，UCSC Genome Browser 的源代码是公开的，其他人可以自行搭建浏览器来托管自己的注释甚至自己的基因组。或者，希望托管自己基因组浏览器的研究人员应考虑使用 JBrowse。这款免费软件可以轻松安装到 Web 服务器上，用于托管自定义基因组和注释。

UCSC 和 Ensembl 的团队从相同的数据源（基因组组装，通常由 GRC 提供）入手，然后各自添加来自不同来源的注释，包括来自 GENCODE、RefSeq 及其他基因预测流程的基因位置，以及来自 NCBI dbSNP 的变异。两种浏览器还包括实验确定的表观遗传标记的位置，包括组蛋白修饰和 DNaseI 高敏位点，这些都可以为基因调控区域的预测提供依据。UCSC 的调控轨道来自 ENCODE 项目，而 Ensembl 则提供了 Regulatory Build，其中包含来自 ENCODE 及其他来源的数据。虽然个别研究人员可能对哪个界面更容易使用、哪个站点提供的更符合其研究问题的信息有个人的偏好，但大多数生物信息学从业者在其研究生涯中的某个阶段无疑都会使用基因组浏览器。

Internet Resources（网络资源）

UCSC Genome Browser

• 主页 — genome.ucsc.edu

-%20Genome%20Browser%20%E7%94%A8%E6%88%B7%E6%8C%87%E5%8D%97%20%E2%80%94%20genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html

-%20Table%20Browser%20%E7%94%A8%E6%88%B7%E6%8C%87%E5%8D%97%20%E2%80%94%20genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTablesHelp.html

-%20%E8%87%AA%E5%AE%9A%E4%B9%89%E6%B3%A8%E9%87%8A%E6%95%B0%E6%8D%AE%E6%98%BE%E7%A4%BA%20%E2%80%94%20genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html

-%20%E8%87%AA%E5%AE%9A%E4%B9%89%E6%B3%A8%E9%87%8A%E6%95%B0%E6%8D%AE%E6%96%87%E4%BB%B6%E6%A0%BC%E5%BC%8F%20%E2%80%94%20genome.ucsc.edu/FAQ/FAQformat.html

-%20Sessions%20%E7%94%A8%E6%88%B7%E6%8C%87%E5%8D%97%20%E2%80%94%20genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgSessionHelp.html

-%20UCSC%20Genome%20Browser%20Track%20Hubs%20%E4%BD%BF%E7%94%A8%20%E2%80%94%20genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTrackHubHelp.html

• Assembly Hubs 维基 — genomewiki.ucsc.edu/index.php/Assembly_Hubs

-%20%E8%81%94%E7%B3%BB%E6%96%B9%E5%BC%8F%20%E2%80%94%20genome.ucsc.edu/contacts.html

Ensembl Genome Browser

• 主页 — www.ensembl.org
• Ensembl 稳定 ID — www.ensembl.org/info/genome/stable_ids
• Ensembl Archives — www.ensembl.org/info/website/archives
• BioMart — www.ensembl.org/biomart/martview
• pre!Ensembl — pre.ensembl.org
• 帮助与文档 — www.ensembl.org/info
• BioMart 文档 — www.ensembl.org/info/data/biomart
• 自定义注释数据显示 — www.ensembl.org/info/website/upload
• 自定义注释数据文件格式 — www.ensembl.org/info/website/upload/index.html#formats
• 联系方式 — www.ensembl.org/info/about/contact

JBrowse

• JBrowse Genome Browser — jbrowse.org
• COSMIC Genome Browser — cancer.sanger.ac.uk/cosmic/browse/genome
• Mnemiopsis Genome Project Portal (MGAP) — research.nhgri.nih.gov/mnemiopsis
• Phytozome — phytozome.jgi.doe.gov
• Rat Genome Database — rgd.mcw.edu

其他基因组资源

• GENCODE — www.gencodegenes.org
• Genome Reference Consortium — www.ncbi.nlm.nih.gov/grc
• GWAS Catalog — www.ebi.ac.uk/gwas
• NCBI Genome Data Viewer — www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/gdv
• NIH 基因组数据共享政策 — osp.od.nih.gov/scientific-sharing/policies
• NIH GTEx Portal — www.gtexportal.org
• Track Hub Registry — www.trackhubregistry.org

Further Reading（延伸阅读）

了解 UCSC 和 Ensembl 基因组浏览器中可用数据和工具的最佳方式是阅读各浏览器在线文档的相应章节。两个站点的文档都内容详尽且持续更新，通常能够解答用户的问题。此外，专业问题可以通过联系网站开发团队解决。本章 Internet Resources 部分列出了相关 URL。

每年一月出版的《Nucleic Acids Research》Database 专刊通常包含对每个基因组浏览器的广泛综述以及新数据和资源的描述。2019 年的参考文献如下所列，更多信息可参见第 1 章。

References（参考文献）

> 参考文献部分以英文原文保留，按字母顺序排列。

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> 本章由 Tyra G. Wolfsberg 博士以个人身份撰写。文中内容不代表美国国立卫生研究院或美国卫生与公众服务部的官方支持或认可。

译文：Ch5 Genome Annotation / Introduction

章节：Ch5 Genome Annotation

Canonical 小节：Introduction

范围：PDF page 137 - PDF page 138 上部；印刷页码 117-118

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<!-- BEGIN LEGACY FRAGMENT: 01_Introduction_and_Gene_Prediction_Methods -->

5 基因组注释

David S. Wishart

引言

得益于 DNA 测序技术和 DNA 分析软件的快速进步，过去需要数年时间、耗费数百万美元才能完成的基因组项目，如今只需数周、花费几千美元即可完成。现代基因组测序项目的典型工作流程包括：使用新一代 DNA 测序仪对选定生物进行全基因组 DNA 测序；运行多种程序组装参考基因组；并利用软件在基因组序列中定位和识别所有编码蛋白质的基因、核糖体 RNA（ribosomal RNA, rRNA）基因和转运 RNA（transfer RNA, tRNA）基因。最后这一过程称为基因组注释（genome annotation），也是本章的主要主题。严格地说，基因组注释并不等同于基因组预测。基因预测或基因组预测是基因组注释的一个分支。具体而言，基因预测使用数学模型或概率模型分析 DNA 序列，并识别基因边界和基因结构。另一方面，基因组注释则利用基因（以及基因组）预测结果，并结合其他证据来源，例如基因表达数据、蛋白质表达数据、与其他已注释基因组的序列同源性，甚至文献评估，来生成一组基因组注释。这些注释不仅包括每条染色体上基因的位置，还包括基因名称（基于同源性）、计算得到的性质（例如序列长度、氨基酸组成和分子量）、表达水平（如果可获得），以及可能的功能。

基因组注释任务的难易程度取决于所测序生物的类型。原核生物（包括细菌和古菌）的基因组相对较小，通常不超过 500 万个碱基对，由一条或两条环状染色体以及可能存在的一两个小质粒组成。原核生物的基因结构非常简单，每个基因都是一个连续的开放阅读框（open reading frame, ORF）。此外，原核生物的编码密度很高，其 DNA 中至少有 85%–90% 编码蛋白质、tRNA 和 rRNA（Hou and Lin 2009）。这使得原核生物中的基因识别相对简单。相反，真核生物的基因识别往往相当困难。这是因为真核生物通常具有非常大的基因组（常常达到数十亿个碱基对），而编码密度却很低（通常低于 2%）（Hou and Lin 2009）。真核基因结构也比原核基因结构复杂得多。尤其是，真核基因被分割为外显子和内含子，而且大多数真核基因之间隔着很长的非编码 DNA 区段（称为基因间区）。

尽管真核细胞中的细胞机器能够以惊人的准确性和精确度识别并处理基因信号，但我们对真核序列信号如何被识别和处理的分子机制仍未完全理解。因此，目前可用的真核基因预测方法准确性并不很高。所以，在缺乏额外实验信息或外源性信息（例如基因表达数据）的情况下，应当认为真核基因预测只是近似结果。即使手头已有相当多的实验数据，要完整注释研究最充分的真核基因组仍然十分困难。例如，人类基因组的 DNA 序列自 2001 年以来已经为人所知，但我们自身基因组中实际编码的基因数量至今仍未完全确定（Pennisi 2003; Ezkurdia et al. 2014）。

本章将简要回顾支撑原核生物和真核生物计算基因预测的一些计算方法和算法。本章还将说明如何把实验证据和数据库比较整合进这些基因预测工具，以提升基因预测性能，并确保更完整的基因组注释。同时，本章还会介绍评估计算基因查找程序性能的方法。最后，本章将重点介绍若干基因组注释流水线，以及用于可视化所得注释结果的几种工具。

基因预测方法

由于原核生物和真核生物在整体基因组织方式上存在重要差异，针对二者的基因预测方法是分别发展起来的。无论用于原核生物还是真核生物，基因查找程序大体可分为两类：内源性（intrinsic，或 ab initio）基因预测器，以及外源性（extrinsic，或 evidence based）基因查找器（Borodovsky et al. 1994）。

Ab initio 基因预测方法试图仅以 DNA 序列数据作为输入来预测和注释基因，而不直接与其他序列或序列数据库进行比较。Ab initio 方法包括搜索可能参与基因界定的序列信号，和/或寻找表现出组成偏倚且这种偏倚与编码区相关的区域。这种基因查找的综合方法称为按信号搜索（searching by signal）和按内容搜索（searching by content）。GeneMark（Borodovsky and McIninch 1993）、GLIMMER（Delcher et al. 1999, 2007）、EasyGene（Larsen and Krogh 2003）和 GENSCAN（Burge and Karlin 1997）是内源性或 ab initio 基因查找程序的知名实例。相比之下，外源性基因查找方法包括基于同源性的策略和比较基因组学策略；在这些方法中，基因结构是通过与特征已知的其他序列进行比较来确定的。BLASTX 是一种外源性基因查找程序的例子，它常被用于原核基因组中的基因识别（Borodovsky et al. 1994）。外源性基因预测方法依赖实验证据（例如信使 RNA（messenger RNA, mRNA）或 RNA-seq 数据）和/或大量既有实验测序数据，以进行序列比较和基因识别。本章稍后将进一步讨论这些外源性方法及其在基因组注释中的作用。首先，我们将聚焦于内源性或 ab initio 基因预测方法。

<!-- END LEGACY FRAGMENT: 01_Introduction_and_Gene_Prediction_Methods -->

译文：Ch5 Genome Annotation / Gene Prediction Methods

章节：Ch5 Genome Annotation

Canonical 小节：Gene Prediction Methods

范围：PDF page 138 - PDF page 147 上部；印刷页码 118-127

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<!-- BEGIN LEGACY FRAGMENT: 02_Ab_Initio_Gene_Prediction_in_Prokaryotic_Genomes -->

原核基因组中的 Ab Initio 基因预测

原核基因通常以起始密码子（例如 ATG）开始，以三种终止密码子之一（例如 TAG、TAA 或 TGA）结束，并且通常至少有 100 个碱基长（图 5.1）。这些编码蛋白质的基因称为开放阅读框（open reading frame, ORF）。原核基因组中的大多数基因组织成操纵子（operon），即由多个 ORF 组成、并受一组共同调控序列控制的基因簇。这些调控序列可以包括增强子、沉默子、终止子、操纵基因或启动子。调控序列通常构成原核基因组中不编码蛋白质序列的 10%–15%。原核基因启动子是一小段 DNA，它启动某个特定基因的转录。启动子位于基因转录起始位点（transcription start site, TSS）附近，与基因或 ORF 位于同一条链上，并处于其上游。在原核生物中，启动子包含两个短序列元件，分别位于 TSS 上游约 10 个碱基和 35 个核苷酸处。位于上游 10 个碱基处的元件在古菌中称为 TATA box，在细菌中称为 Pribnow（TATAAT）box（Pribnow 1975）。这些缩写或字母实际上表示在这些区域中观察到的共有 DNA 序列。

ATGACAGATTACAGA......TGCAGTTACAGGATAG
TATA box
Start codon
Stop codon
ORF

图 5.1 原核基因或开放阅读框（ORF）的简化示意图，其中包括起始密码子（或翻译起始位点）、终止密码子（TAG），以及 TATA box 或 Pribnow box。

除 TSS 外，几乎所有原核基因都有一个核糖体结合位点（ribosome binding site, RBS），位于起始（ATG）密码子上游 8–10 个碱基处。起始密码子也称为翻译起始位点（translation initiation site, TIS）。RBS 呈现出一种特定的核苷酸模式（AGGAGG），称为 Shine–Dalgarno（SD）共有序列（Shine and Dalgarno 1975）。SD 序列使 mRNA 能够与细胞的翻译机器发生相互作用。在细菌和古菌中，通常认为翻译起始是通过 30S 核糖体亚基中 16S rRNA 的 3′ 末端，与携带 SD 共有序列的 mRNA 5′ 非翻译区（5′ untranslated region, UTR）中的位点发生碱基配对相互作用而完成的。

共有序列虽然可以作为有用的提示或记忆辅助，但在现代基因信号或基因位点（即 TIS、RBS、TSS 和终止子）识别中并不会真正直接使用。相反，大多数基因信号可以通过位置权重矩阵（positional weight matrix, PWM）或位置特异性评分矩阵（position-specific scoring matrix, PSSM；另见第 3 章）来识别。这些评分矩阵是通过仔细比对一组已知功能信号，并确定特定碱基在某些位置出现的校正频率而计算得到的。Box 5.1 给出了如何计算 PSSM 的示例。一旦针对某一给定信号完成计算，信号特异性的 PSSM 就可用于沿着目标序列快速计算所选基因信号的位置及其可能性。一个简化的原核生物基因预测流程包括以下步骤。

• 从某一条 DNA 链 5′ 端的基因组序列开头开始，寻找能够形成最长 ORF（最小 150 个碱基）的 ATG 起始密码子；然后移动到此前已识别 ORF 下游的下一个 ATG，并对基因组序列的其余部分重复这一过程。
• 对相反方向的 DNA 链重复上述过程。
• 对所有识别出的 ORF，使用位点特异性 PSSM 对 TSS 和 RBS 信号的质量进行评分，以细化 ORF 预测并生成最终基因列表。

Box 5.1 位置特异性评分矩阵

位置特异性评分矩阵（position-specific scoring matrix, PSSM）也称为位置权重矩阵（positional weight matrix, PWM）或位置特异性权重矩阵（positional specific weight matrix, PSWM），通常由一组被认为在功能上相关的比对序列推导而来。在本例中，将 5 条各由 10 个碱基组成、并被认为在功能上相关（作为启动子区域）的不同 DNA 序列进行比对。

A T T T A G T A T C
G T T C T G T A A C
A T T T T G T A G C
A A G C T G T A A C
C A T T T G T A C A

由这个比对可以生成一个简单的位置频率矩阵（positional frequency matrix, PFM）。在该矩阵中，A、C、G 和 T 的频率会根据上述比对，针对 10 个碱基位置中的每一个位置进行制表。因此，在第一个位置上有 3 个 A、1 个 C、1 个 G 和 0 个 T（见第 1 列）。上述比对对应的 PFM 如下：

A 3 2 0 0 1 0 0 5 2 1
C 1 0 0 2 0 0 0 0 1 4
G 1 0 1 0 0 5 0 0 1 0
T 0 3 4 3 4 0 5 0 1 0

PFM 现在可以转换为位置概率矩阵（positional probability matrix, PPM）。PPM 是由一组十进制数值构成的矩阵，这些数值基于序列比对中每个位置上各碱基出现的百分比或频率。换句话说，我们必须通过将每个位置上的核苷酸计数除以比对中的序列数量来归一化频率。因此，如果比对中有 5 条序列，并且第一个位置上有 3 个 A，那么第一个位置上 A 的位置概率就是 3/5 = 0.6。同样，如果第一个位置上有 1 个 C，则其位置概率为 1/5 = 0.2。1 个 G 对应的位置概率为 0.2，而没有 T 则对应位置概率为 0（见第 1 列）。对比对的全部 10 个位置执行同样计算后，完整的 PPM 如下：

A .6 .4 0 0 .2 0 0 1 .4 .2
C .2 0 0 .4 0 0 0 0 .2 .8
G .2 0 .2 0 0 1 0 0 .2 0
T 0 .6 .8 .6 .8 0 1 0 .2 0

可以将上述 PPM 中的概率相乘，以计算给定 DNA 序列与原始 5 条序列密切相关的概率。例如，如果我们想知道新序列 ATTTTGTATA 是否密切相关，就可以将每个序列位置对应的数值相乘来计算该序列的概率：

p = 0.6 × 0.6 × 0.8 × 0.6 × 0.8 × 1 × 1 × 1 × 0.2 × 0.2 = 0.0055

请注意，如果我们对一个几乎相同的序列（例如 ACTTTGTATA，仅相差一个碱基）执行相同计算，会得到 p = 0。之所以得到 0 概率，是因为在训练集中第二个位置没有观察到 C。仅用 5 条序列构建 PPM，意味着你很可能低估（或高估）每个碱基真实的分数频率，从而在计算概率时产生类似刚才看到的问题。为了解决多序列比对（multiple sequence alignment, MSA）规模较小的问题，我们应当引入伪计数（pseudocount）。伪计数用于避免矩阵项取值为 0 所导致的问题。使用伪计数等价于将 PPM 的每一列乘以一个 Dirichlet 分布，从而允许为“未观察到”或未使用过的序列计算概率。一种简单做法是把数据归一化，使其匹配所考虑基因组的总体碱基组成，并加入一个随 MSA 中序列数量平方根而变化的校正因子。因此，可以用以下公式对 PPM 中每个碱基位置重新评分：

score (Xi) = (Qx + Px)/(N + B)

其中，Qx 是位置 i 上 X 类型碱基的计数；Px 是 X 类型碱基的伪计数，等于 B × X 类型碱基的频率；N 是 MSA 中序列的总数；B 是伪计数的数量（假定为 √N）。对于目标基因组，A 的频率为 0.32，T 的频率为 0.32，C 的频率为 0.18，G 的频率为 0.18。利用这些信息，第一个位置上 A 的值为 (3 + (√5 × 0.32))/(5 + √5) = 0.51。第二个位置上 C 的值为 (1 + (√5 × 0.18))/(5 + √5) = 0.19，依此类推。经过伪计数校正后的 PPM 如下：

A .51 .38 .09 .09 .24 .09 .09 .79 .38 .24
C .19 .06 .06 .33 .06 .06 .06 .06 .19 .61
G .19 .06 .19 .06 .06 .75 .06 .06 .19 .06
T .09 .51 .65 .51 .65 .09 .79 .09 .24 .09

理想情况下，每一列的总和应为 1；但由于四舍五入，本例中的列和有时会略高于或略低于 1。使用这个重新评分后的矩阵，你会注意到现在已经没有零项。然而，通过乘法计算概率既繁琐（考虑到有效数字的数量），也较为困难。更简单的方法是通过取 PPM 中每个数值的负 log10，将 PPM 转换为另一种矩阵。这会把两位小数转换为一位小数，同时也允许通过加法而不是乘法来计算概率。如果对上述 PPM 取 −log10，可得到：

A 0.3 0.4 1.0 1.0 0.6 1.0 1.0 0.1 0.4 0.6
C 0.7 1.2 1.2 0.5 1.2 1.2 1.2 1.2 0.7 0.2
G 0.7 1.2 0.7 1.2 1.2 0.1 1.2 1.2 0.7 1.2
T 1.1 0.3 0.2 0.3 0.2 1.0 0.1 1.0 0.6 1.0

这个修改后的矩阵称为对数似然评分矩阵，或 PSSM。利用上述 PSSM，我们现在可以计算查询序列 ATTTTGTATA 的得分（或对数似然）：

0.3 + 0.3 + 0.2 + 0.3 + 0.2 + 0.1 + 0.1 + 0.1 + 0.6 + 0.6 = 2.8

序列得分提示该序列与随机序列有多大差异。得分越高，该序列越可能是启动子/功能位点，而不是随机序列。2.8 是一个很高的得分。序列得分也可以从该序列结合能的角度来解释。

然而，这样一个简化算法的正确率可能只有 75%–80%（Besemer et al. 2001）。这是因为原核基因并不总是那么容易识别。例如，并非所有细菌基因都使用 ATG 起始密码子。在大肠杆菌（Escherichia coli）中识别出的 4284 个基因里，83% 使用 ATG，14% 使用 GTG，3% 使用 TTG 起始密码子（Blattner et al. 1997）。同样，如果使用只识别长 ORF 的简单规则，可能会漏掉许多短 ORF，或错误识别具有异常密码子偏倚的 ORF（这提示它们不太可能编码基因）。事实上，已知编码蛋白质的 ORF 与偶然出现的 ORF 在长度分布上差异相当显著。更具体地说，编码 ORF 的长度分布类似 gamma 分布（见术语表），而非编码 ORF 的长度分布类似简单指数函数（Lukashin and Borodovsky 1998）。除这些复杂因素外，近来还发现某些原核基因由于一种称为无前导序列转录（leaderless transcription）的现象而具有非常异常的基因起始信号（Slupska et al. 2001）。在无前导序列转录中，RNA 转录本具有非常短的 5′ UTR，长度小于 6 个碱基。这些区域太短，无法容纳 RBS。这使 TSS 位于 TIS 处或非常接近 TIS。在这些情况下，必须使用启动子信号来更准确地识别 TIS。

鉴于许多原核基因信号在长度和特征上存在变化，PSSM 并不是最有效的信号识别工具。还有更高级的基因信号识别方法，例如 Markov 模型（Box 5.2）、隐 Markov 模型或 HMM（Box 5.3）、人工神经网络和支持向量机。这些机器学习方法在处理可变长度和条件性序列依赖关系方面表现好得多，而这些特征是简单 PSSM 无法捕捉的。

Box 5.2 Markov 模型

Markov 链、模型或过程指一系列观测，其中某一观测的概率取决于若干先前观测。观测数量定义了链的“阶数”。例如，在一阶 Markov 模型中，某一观测的概率只取决于前一个观测。在 5 阶 Markov 链中，某一观测的概率取决于前 5 个观测。DNA 序列可以被视为 Markov 模型的一个例子，因为在给定位置观察到某个特定碱基的可能性可能取决于它前面的碱基。特别是在编码区中，众所周知，某一给定碱基的概率取决于前 5 个碱基，这反映了观察到的密码子偏倚以及相邻密码子之间的依赖关系。在非编码区中，则观察不到这种依赖性。当扫描一个未知的基因组区域时，可以计算局部核苷酸序列在多大程度上符合编码区中观察到的 5 阶依赖关系，并赋予适当的编码可能性得分。

Box 5.3 基因预测中的隐 Markov 模型

隐 Markov 模型（hidden Markov model, HMM）用于为真实生物过程提供统计表示。它们已被广泛用于生物信息学的许多领域，包括多序列比对、蛋白质家族的表征和分类、蛋白质结构比较，以及基因结构预测。

在本章中，所描述的所有基因查找方法都有两个共同点：它们以原始核苷酸序列作为输入，并且对于序列中的每一个位置，尝试预测某个给定碱基最可能位于内含子、外显子还是基因间区。在进行这些预测时，所应用的算法（无论是否为 HMM）必须考虑基因结构的已知信息；图 5.2 以简化方式展示了这一结构。

从基因的 5′ 端到 3′ 端，该方法必须考虑启动子区域、转录起始位点、5′ UTR、起始密码子、外显子、剪接供体、内含子、剪接受体、终止密码子、3′ UTR 和 polyA 尾的独特特征。除每个区域可能具有的保守序列或组成偏倚外（Box 5.1），该方法还需要考虑这些元件均按受控语法出现；例如，启动子（及其 TATA box）必须出现在起始密码子之前，初始外显子必须跟在起始密码子之后，内含子必须跟在外显子之后，内含子之后只能是内部外显子或末端外显子，终止密码子不能打断编码区，而 polyA 信号必须出现在终止密码子之后。最后，在整个过程中必须维持一个 ORF，以便在一切完成后产生蛋白质。

这些元件——外显子、内含子等——称为状态（states）。上述序列特征和语法约束允许为其分配转移概率，用来表示沿着基因结构移动时发生状态变化的可能性。

Transcribed region
Exon 1    Exon 2    Exon 3
Intron 1  Intron 2
Start codon
5′ UTR
3′ UTR
Stop codon
Downstream intergenic region
Upstream intergenic region

图 5.2 真核基因的简化示意图，展示了多内含子/外显子结构、起始和终止密码子的位置、非翻译区（UTR），以及围绕转录基因的基因间区。

<!-- END LEGACY FRAGMENT: 02_Ab_Initio_Gene_Prediction_in_Prokaryotic_Genomes -->

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真核基因组中的 Ab Initio 基因预测

图 5.2 展示了真核基因的组织方式。从该图可以看出，真核基因比原核基因复杂一些。特别是，真核基因组（尤其是脊椎动物基因组）中编码蛋白质区域的密度比原核基因组低 90–100 倍。这些稀疏的蛋白质编码区域被很长的基因间 DNA 区段隔开，而它们的编码序列（即外显子）又被很大的非编码内含子打断。真核 RNA 聚合酶识别并转录基因，随后由多种小核核糖核蛋白（small ribonuclear proteins, snRNPs）切割产生的长 RNA 转录本，以去除内含子（Will and Lührmann 2011）。剩余的外显子随后被剪接在一起，形成小得多的蛋白质编码转录本。snRNPs 能够识别外显子/内含子连接处的特定切割位点，以确保剪接总是精确进行。

在人类基因组中，只有 1.1% 由外显子组成，24% 由内含子组成，而 75% 的基因组由基因间 DNA 构成。平均而言，每个基因有 5.48 个外显子，每个外显子编码 30–36 个氨基酸的肽段（Sakharkar et al. 2002）。人类基因组中最长的外显子有 11 555 个碱基，而最短的外显子只有 2 个碱基（Sakharkar et al. 2002）。外显子不仅“稀少”，其长度差异也极大。更重要的是，它们可以通过可变剪接产生非常不同的最终基因（转录本）产物。这使得真核生物中的基因预测明显比原核生物更加困难。

真核生物的计算基因预测，本质上是在模拟生物学中的转录和剪接过程。在生物学过程中，细胞内的多种蛋白质和蛋白质复合体扫描 DNA 序列，识别并结合特定 DNA 位点，转录基因，然后切割并剪接转录本，形成最终基因产物。在计算过程中，这些蛋白质被各种算法替代，这些算法会：

• 沿查询序列识别合适的剪接位点以及起始和终止信号，并对其评分；
• 通过检测这些信号推断候选外显子的位置；
• 根据用于检测外显子的信号，以及根据假定外显子序列本身计算出的编码统计量，对最佳外显子进行评分和识别；
• 将这些候选外显子的一个子集组装（或“剪接”）成预测的基因结构。该组装过程会以最大化某个特定评分函数的方式产生，而该评分函数依赖于每个候选外显子的得分。

这些任务的具体实现方式因程序而异。这里不逐一详细讨论每个程序，而是描述几乎所有 ab initio 真核基因预测程序共有的三大主要过程：预测外显子界定信号、预测并评分外显子，最后进行外显子组装。

预测外显子界定信号

正如原核基因具有 DNA 信号一样，真核基因也具有独特的 DNA 信号。其中一些元件与原核生物相似，另一些则差异很大（图 5.3）。例如，许多真核基因具有启动子元件，这些元件也与原核基因中的序列表现出一定相似性。真核生物中研究最充分的核心启动子元件称为 TATA box，或 Goldberg–Hogness box（Lifton et al. 1978），位于 TSS 上游 25–30 个碱基对处。TATA box 也存在于古菌和细菌中，似乎是一种非常古老的 DNA 信号。真核生物中的 TATA box 共有序列为 TATA(A/T)A(A/T)，并且常常与另一种称为 CCAAT box 的调控序列偶联；CCAAT box 的共有序列为 GGCCAATCT，位于 TATA box 上游约 150 个碱基对处。只有约 25%–35% 的哺乳动物基因含有 TATA box，其余基因则含有其他类型的核心启动子元件。真核基因还含有核心启动子之外的调控序列，包括增强子、沉默子和绝缘子。这些调控序列可以分布在很大的基因组距离范围内，常常距离核心启动子数百千碱基。除了具有多种启动子或增强子信号外，真核基因还具有非常特异的 DNA 信号，用于界定外显子和内含子的位置。

更具体地说，参与界定外显子的基本 DNA 信号有四类：TIS、5′（或供体）剪接位点、3′（或受体）剪接位点，以及翻译终止密码子。在真核生物中，TIS 由 Kozak 共有序列界定，常写作 ACCATGG（Kozak 1987），其中中央的 ATG 是起始密码子。5′ 供体剪接位点通常由 GG/GT 这一共有序列界定，而 3′ 受体剪接位点的共有序列为 CAG/G，其中斜线表示剪接切割位点（图 5.4）。翻译终止密码子包括通常的 TAG、TAA 或 TGA。

GC box        ~200 bp
CCAAT box     ~100 bp
TATA box      ~30 bp
Gene
Transcription start site
Exon
Exon
Intron

图 5.3 真核基因上游区域的示意图，其中 GC box 位于转录起始位点上游约 200 bp，CCAAT box 位于上游约 100 bp，TATA box 位于上游约 30 bp。

Exon 1
Exon 2
Intron 1
Intron 2
Branchpoint site
5′ site
3′ site
AG/GT
CAG/NT

图 5.4 外显子和内含子周围剪接位点区域的示意图，包括 5′ 和 3′ 剪接位点及其共有序列。

最早用于识别外显子界定信号的方法是简单的 PWM 或 PSSM。事实证明，这些方法在识别短 DNA 信号（如剪接位点）方面表现较差。因此，这些简单模型后来被更先进的模式识别技术所取代，例如 HMM（Box 5.3）。这些强大的模式识别方法能够从由已知或充分注释的外显子界定信号组成的大型数据集中“学习”非常复杂的序列模式。HMM 是一种统计 Markov 模型，在该模型中，被建模系统被假定为具有未观测（即隐藏）状态的 Markov 过程。HMM 广泛用于许多现实应用，例如语音识别、手写识别和手势识别。HMM 在生物信息学中的应用始于 20 世纪 90 年代初（Krogh et al. 1994），并显著提高了基因预测准确性。HMM 使定义长度可变的高度复杂模式成为可能，这些模式包括许多外显子界定信号，如蛋白质编码区（见下文）、供体位点、受体位点、套索位点，以及翻译起始和终止位点。

预测并评分外显子

除了识别外显子界定信号之外，准确预测外显子还依赖基于内容的特征。外显子可分为三种基本类型：

• 初始外显子：由起始位点和供体位点界定的 ORF；
• 内部外显子：由 5′（供体）位点和 3′（受体）位点界定的 ORF；
• 末端外显子：由 3′（受体）位点和终止密码子界定的 ORF。

大多数被转录的基因由一个初始外显子、多个内部外显子和一个末端外显子组成。Zhang（2002）对这些真核外显子类型作了更全面的讨论。

按定义，外显子是蛋白质编码区域。与非编码区域相比，已知蛋白质编码区域表现出特征性的组成偏倚。这些偏倚包括略高的 GC 含量，以及明显非随机的密码子（三联体）频率偏好。观察到的密码子偏倚源于蛋白质中氨基酸分布不均、同义密码子使用不均，以及编码区中针对翻译优化的自然选择。为了区分蛋白质编码区和非编码区，20 世纪 90 年代发展出了许多基于 DNA 内容的度量方法（Fickett and Tung 1992; Gelfand 1995; Guigó 1999）。这些内容度量也称为编码统计量，反映给定 DNA 序列编码某种蛋白质或蛋白质片段的可能性。多年来，已经发表了许多计算基于内容度量的方法。最早的一些方法测量密码子三联体频率中出现的模式。然而，人们发现三联体对（即六聚体）的频率中包含更多信息。因此，六聚体频率通常以依赖密码子位置的五阶 Markov 模型形式表示（Box 5.2；Borodovsky and McIninch 1993），似乎能为识别外显子中的蛋白质编码区提供最佳判别能力。目前，这些六聚体频率处于所有现代真核基因预测器的核心位置。

外显子组装

一旦外显子被预测出来（使用六聚体频率和 HMM 的组合来识别关键基因信号以及外显子/内含子边界），就需要将它们组装成某种多外显子基因结构。外显子组装的主要困难在于简单的组合数学：对于任何给定基因，可能的外显子组装数量会随着预测外显子数量呈指数增长。为了解决这个问题，人们发展出了多种动态规划技术。动态规划是一种优化技术，它允许把复杂问题拆解为一组较简单的子问题来求解。每个子问题只求解一次，并保存其解。下次遇到相同子问题时，不再重新计算解，而是直接查找此前计算过的解（Bellman 1957；详见附录 6.A）。

对于最优外显子组装问题，已有研究表明，动态规划能够相当高效地找到解，而不必枚举或考虑每一种可能的外显子组合（Gelfand and Roytberg 1993）。几乎所有现代真核基因预测工具现在都使用某种动态规划方法（Markov 模型研究者称之为 Viterbi 算法，而大多数从事序列比对的人则称之为 Needleman–Wunsch 算法）。通过将基于 HMM 的外显子信号识别、不同的 HMM 派生外显子得分以及用于组装外显子的动态规划结合起来，就可以生成稳健的真核基因预测结果。使用动态规划的早期 HMM 基因预测方法包括 GENIE（Kulp et al. 1996）和 HMMgene（Krogh 1997）。也许最流行的基于 HMM 的真核基因预测器是 GENSCAN（Burge and Karlin 1997），这是一种 ab initio 基因预测器，已被广泛用于注释数百个真核基因组。

鉴于 GENSCAN 的流行，较为详细地解释该程序的工作方式并提供一个使用示例是有价值的。对于任意给定查询序列，GENSCAN 会在底层 HMM 的基础上确定最可能的基因结构。为了建模供体剪接位点，GENSCAN 引入了一种称为最大依赖分解（maximal dependence decomposition）的方法。在这种方法中，使用一系列权重矩阵（而不是仅使用一个矩阵）来捕捉这些剪接位点中不同位置之间的依赖关系。此外，GENSCAN 还使用一些参数来解释基因组序列的许多高阶性质（例如典型基因密度、每个基因的典型外显子数量，以及不同类型外显子的大小分布）。可以使用不同的基因模型参数集来校正不同基因组之间在基因密度和 G + C 组成方面的差异。也已经开发出用于玉米和拟南芥序列的模型。这样会使与已知蛋白质相似的外显子获得更高得分，而使与已知蛋白质几乎没有或完全没有相似性的预测外显子得分降低。

图 5.5 展示了一个典型的 GENSCAN 输出，使用人尿卟啉原脱羧酶（uroporphyrinogen decarboxylase, URO-D）基因（U30787）作为查询。预测中的每个外显子各占一行。从左到右，各列分别表示基因和外显子编号（Gn.Ex）、预测类型（Type，即外显子类型或识别出的 polyA 信号）、作出预测的链（+ 或 –）、预测的起点和终点、预测外显子的长度、其阅读框、若干评分列，以及概率值（P）。如果 GENSCAN 外显子具有很高的概率值（p > 0.99），并且该预测与真实注释外显子相匹配，那么其准确率为 97.7%。这些高概率预测可用于聚合酶链式反应引物的合理设计，以扩增互补 DNA（complementary DNA, cDNA），也可用于其他需要极高置信度的目的。GENSCAN 中概率位于 0.50–0.99 范围内的外显子通常被认为在多数情况下是正确的。对于 p 值高于 0.90 的预测，其最佳情况下的准确率大约为 88%。任何 p < 0.50 的预测都应视为不可靠，这些数据不会出现在数据表中。预测的氨基酸序列列在基因预测结果下方。在此处所示示例中，GENSCAN 正确预测了 URO-D 中 10 个外显子中的 9 个；只有初始外显子被漏掉了。

图 5.5 对尿卟啉原脱羧酶基因进行 GENSCAN 分析的示例输出。关于该输出的更详细说明见正文。

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译文：Ch5 Genome Annotation / How Well Do Gene Predictors Work?

章节：Ch5 Genome Annotation

Canonical 小节：How Well Do Gene Predictors Work?

范围：PDF page 147 中部 - PDF page 153 顶部；印刷页码 127-133

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第5章 基因组注释

基因预测程序的效果如何？

基因预测程序的准确性通常用受控且界定清楚的数据集来测定；在这些数据集中，真实的基因结构已经通过实验确定。准确性可以在核苷酸、外显子或基因三个层面计算，每一种层面都能从不同角度反映预测方法的准确程度。在原核基因预测领域，结果几乎总是在基因层面报告，并以百分比表示，也就是用正确预测的基因数除以测试集中已知或经验证的基因总数。在某些情况下，也会报告过度预测基因（假阳性）的数量或百分比。

在真核基因预测领域，性能报告往往更复杂一些。这是因为评价问题本身更复杂，而且总体性能通常也差得多。一般来说，常用两个基本度量：敏感性（sensitivity，Sn），定义为被正确预测出来的编码核苷酸、外显子或基因所占比例；特异性（specificity，Sp），定义为被正确预测出来的编码与非编码核苷酸、外显子或基因所占比例（也就是预测结果中正确部分的总体比例）。Box 5.4 对敏感性、特异性以及基因预测（和蛋白质结构预测）中使用的若干其他评价指标作了更详细说明。该框还介绍了真阳性（true positives，TP）、真阴性（true negatives，TN）、假阳性（false positives，FP）和假阴性（false negatives，FN）这些概念。

图 5.6 给出了一个真核基因预测例子，其中展示了四种可能的预测结果。该图用示意方式说明了基因预测结果与已知（或观测到的）基因结构之间的差异。单独使用敏感性或特异性都不能完美衡量全局准确性，因为高敏感性可能以很低的特异性为代价获得，反之亦然。一个更容易理解、同时结合敏感性和特异性数值的度量称为 Matthews 相关系数（Matthews correlation coefficient，MCC，也简称 CC），Box 5.4 对它作了更正式的说明。MCC 的取值范围为 -1 到 1；其中 1 表示完美预测，-1 表示所有编码区都被预测为非编码区，反之亦然。有时也会使用其他准确性度量；不过，上述指标是在真核基因组预测大型评估项目中最常用的指标，例如人类 ENCODE 基因组注释评估项目（ENCODE Genome Annotation Assessment Project，EGASP；Guigó and Reese 2005）、RNA-seq 基因组注释评估项目（RNA-seq Genome Annotation Assessment Project，RGASP；Steijger et al. 2013）以及线虫基因组注释评估项目（Nematode Genome Annotation Assessment Project，nGASP；Coghlan et al. 2008）。

图 5.6

图 5.6 核苷酸层面基因预测准确性度量的示意图。上方给出真实基因结构，其中经确认的外显子用浅蓝色条表示，经确认的内含子用黑线表示。下方给出预测基因结构，其中预测外显子用红色条表示，预测内含子用黑线表示。图中展示了预测可能出现的四种结果：真阳性（TP）、真阴性（TN）、假阳性（FP）和假阴性（FN）。图中还用 TP、TN、FP 和 FN 的相应组合给出了敏感性和特异性的公式：

• Sn = TP / (TP + FN)
• Sp = TN / (TN + FP)

版面证据：../03_layout/page_148_render.png

Box 5.4 生物信息学中二分类或二项预测的评价

生物信息学中的许多预测本质上都涉及二分类或二项（即真/假）分类问题。例如，原核基因预测可以表述为一个二分类问题：尝试区分开放阅读框（open reading frames，ORFs）和非 ORF。类似地，真核基因预测也可以表述为预测外显子与非外显子（内含子），或预测基因与基因间区域的二分类问题。蛋白质膜螺旋预测（第7章讨论）同样可以放在类似的二分类框架中，即区分膜螺旋与非螺旋（或非膜区）。二分类问题也存在于医学中，例如预测或诊断患病者与健康者；也存在于高通量制造的质量控制任务中，例如合格与不合格（pass versus fail）。

二分类器或预测器的评价通常遵循一套非常标准的实践，并使用一组共同的指标和定义。遗憾的是，当生物信息学研究者评价自己的预测器或预测结果时，这套实践并不总是得到遵守。这就是本书加入这个非常重要的信息框的原因；本书后续会频繁引用它。

如下方示意表所示，一个二分类器或预测器可以产生四种结果组合：真阳性（TP，或正确的阳性判定）、真阴性（TN，或正确的阴性判定）、假阳性（FP，或错误的阳性判定）和假阴性（FN，或错误的阴性判定）。在统计学中，假阳性称为 I 型错误，假阴性称为 II 型错误（见第18章）。

当一个二分类器已经在一组数据上运行后，就可以用上述 2 × 2 列联表为这四类结果分别计算出具体数值。举例来说，如果某个基因预测器在一个实际只有 900 个基因的基因组中预测出了 1000 个基因，它可能得到 850 个 TP、200 个 TN、60 个 FP 和 40 个 FN。根据这四类结果，可以计算出 8 个比率。这些比率可以通过将 TP、TN、FP、FN 四个数中的每一个，除以其在 2 × 2 列联表中所在行或所在列的总和来获得。下面列出最重要的比率及其名称或缩写（并给出公式）。此外，还列出了一些在生物信息学或统计学某些子领域中使用的其他二分类器评价指标。

敏感性（Sn、召回率或 TPR）衡量实际阳性中被正确识别为阳性的比例，而特异性（Sp 或 TNR）衡量实际阴性中被正确识别为阴性的比例。精确率（PPV）是阳性结果中真正为阳性的比例，而 NPV 是阴性结果中真正为阴性的比例。FDR 在这里指二分类意义上的度量，即假阳性除以所有阳性预测；不是多重检验中的 FDR。准确率或 ACC（用于二分类）定义为正确预测数除以预测总数。ACC 是评价二分类测试或预测器准确性的最佳方式之一。F1 score 是另一种测试准确性度量，定义为精确率（PPV）和召回率（Sn）的调和平均数。MCC 是一种常用的测试或预测器准确性度量。它本质上是标准 2 × 2 列联表的卡方统计量。实际上，MCC 是观测二分类结果与预测二分类结果之间的相关系数。

由于不同传统或不同目标，不同科学领域会偏好不同指标。在医学和大多数生物学领域（包括生物信息学）中，敏感性和特异性最常用于评价二分类器；而在机器学习和信息检索中，精确率和召回率通常更受偏好。同样，生物信息学内部不同预测任务也倾向于用不同度量报告性能。基因预测器通常报告 Sn、Sp 和 ACC，而蛋白质结构预测器通常报告 ACC 和 MCC。蛋白质二级结构预测中的准确率（ACC）也称为 Qn，其中 n 是二级结构类别数（通常 n = 3）。在基因预测中，ACC 分数记作 Q2，因为只识别两个类别（外显子/内含子，或 ORF/非 ORF）。除 MCC 外，上述每一个比率的取值都可以从 0 到 1。对于完美预测，Sn = 1、Sp = 1、PPV = 1、NPV = 1、ACC = 1、F1 = 1、MCC = 1、FPR = 0 或 FDR = 0；而完全错误的预测会得到 Sn = 0、Sp = 0、PPV = 0、NPV = 0、ACC = 0、F1 = 0、MCC = -1、FPR = 1 或 FDR = 1。

任何二分类预测器的性能，都必须结合不同类别中已有的数量偏倚（即类别分布不均衡）来评价。例如，ACC 为 0.95 看起来可能很优秀；但如果数据集中 95% 都属于同一类别，那么只要把所有对象都预测为这个类别，也很容易得到同样的 ACC。这正是许多哺乳动物基因组中的情况，因为它们拥有大片基因间区域。因此，如果把每一个核苷酸都预测为“基因间”，很容易得到一个在核苷酸层面准确率 >95% 的基因预测器。当然，这样的预测器完全没有用。

评价基因预测方法的准确性，需要使用一组可靠注释的基因；这些基因要由来自互补信息来源的实验或计算证据加以验证。实验依据可以来自基于质谱的蛋白质组学，或来自核磁共振波谱、X 射线晶体学（第12章）等结构生物学方法；这些方法可以对蛋白质序列提供直接、可视化的确认。计算依据可以表现为：由预测基因推导出的蛋白质序列，与功能已被实验验证的蛋白质一级结构具有相似性。针对原核生物和真核生物的基因预测评估都已经开展了大量工作。

评估原核基因预测程序

多年来，原核基因预测程序的评价一直在持续进行；每一篇描述新程序（或已有程序新版本）的论文，通常都会提供详细的性能评估（Larsen and Krogh 2003；Delcher et al. 2007；Hyatt et al. 2010；Borodovsky and Lomsadze 2011）。最近且最全面的原核基因预测程序评估之一，是 Hyatt 等人在 2010 年完成的。在这篇论文中，作者在两个不同任务上比较了五个程序：Prodigal 1.20（Hyatt et al. 2010）、GeneMarkHMM 2.6（Borodovsky and Lomsadze 2011）、GLIMMER 3.02（Delcher et al. 2007）、EasyGene 1.2（Larsen and Krogh 2003）和 MED 2.0（Zhu et al. 2007）。

第一个任务涉及从 10 个不同细菌和古菌基因组中，预测具有实验验证翻译起始位点（translation initiation sites，TISs）的实验验证基因。在这种情况下，只有 2443 个基因（总可能数量超过 35 000 个）被认为是实验验证基因。Hyatt 等人发现，五个程序在这些经验证基因 3′ 端的预测上都能达到 98-99.8% 的准确率（基因层面）；对于完整基因（5′ 端和 3′ 端都被正确预测）的预测，准确率为 87-96.7%（基因层面）。

第二个任务涉及预测七个不同细菌基因组中 GenBank 注释的基因（大多为人工注释）。在这种情况下，共评估了 23 648 个基因。所有程序在这些基因 3′ 端的预测上都能达到 95-99% 的准确率（基因层面）。然而，它们在完整基因预测任务（5′ 端和 3′ 端都被正确预测）上的表现差异要大得多，准确率从 69% 到 91% 不等。五个程序在第二个任务所有基因上的总体预测平均值约为 80%。还值得注意的是，五个程序通常都会比 GenBank 注释多预测约 4-5% 的基因，其中一些程序（MED 2.0）的过度预测幅度高达 40%。

根据 Hyatt 等人（2010）提供的数据，表现最好的两个原核基因预测程序是 Prodigal 和 GeneMark，其他三个程序仅略差一些。他们的结果还表明，预测原核基因 3′ 端的任务基本上已经解决，而预测原核基因 5′ 端的挑战仍需进一步研究。显然，一些原核基因组比另一些更难预测：在大肠杆菌（E. coli）基因组上，完整基因预测性能常常徘徊在约 90%；而在研究较少的基因组（如 Halobacterium salinarum）上，性能通常约为 70%。这些结果反映了这样一个事实：ab initio 基因预测器（无论原核还是真核）都需要基于大量高质量基因模型进行非常充分的训练。一旦完成训练，这些工具可以有非常出色的表现，尤其是在研究充分、可获得充足训练数据的基因组中。不过，对于新组装的细菌基因组，要达到很高准确率所需的训练水平往往很难实现。

评估真核基因预测程序

真核基因预测程序的评估已经持续了 20 多年。在早期，大多数真核基因预测评价是在单个基因上进行的；这些基因的外显子/内含子结构已经得到充分表征。这反映出当时很少有（如果有的话）真核基因组被完整测序，而且只有少数真核基因的外显子/内含子结构得到完整确定。这也使基因预测任务简单得多，因为这些测试序列中的编码区（外显子）密度很高（25-50%），远高于整个基因组中的编码区密度（通常 <2%）。这也导致了过于乐观的性能评价。近年来，该领域已经发展到在整个基因组范围内评估基因预测性能。

Burset 和 Guigó（1996）发表了最早的真核基因预测程序系统评价之一。他们的研究使用 570 条脊椎动物单基因序列，对七个程序进行了评价。这些程序在核苷酸层面的平均 CC 从 0.65 到 0.80 不等。随后，Rogic 等人（2001）使用 195 条来自人类和啮齿类物种的单基因序列，对七个基因预测程序进行了类似分析。Rogic 等人研究中测试的程序，准确性显著高于 Burset 和 Guigó 研究报告的结果，其核苷酸层面的平均 CC 从 0.66 到 0.91 不等。该范围上端的提高说明，在相对较短的一段时间内，基因预测方法的发展取得了显著进步。

Burset 和 Guigó（1996）、Rogic 等人（2001）以及其他早期评价都有同样的局限：这些基因查找程序是在受控数据集上测试的，而这些数据集由短基因组序列组成，每条序列编码一个结构简单的单个基因。显然，这些数据集并不能代表整体基因组序列。完整基因组序列包含大片编码密度低的区域，包含编码多个基因或不完整基因（或二者兼有）的区域，也包含具有非常复杂或可变基因结构的区域。

因此，人们开展了两项大规模研究，以评估 ab initio 真核基因预测程序在真实世界哺乳动物基因组数据上的性能。第一项基于人类 22 号染色体的分析（Parra et al. 2003），第二项基于人类 ENCODE 区域的分析（Guigó et al. 2006），覆盖约 1% 的人类基因组。

在人类 22 号染色体完成测序时，许多专家对其进行了非常广泛的人工分析、实验确认和详细注释（Dunham et al. 1999）。这样做的目的是为评价基因组预测和基因组注释工具提供一个有用的“金标准”（在当时）。因此，Parra 等人使用 22 号染色体的人工注释数据，从核苷酸、外显子以及完整基因/转录本层面评估了 GENSCAN（Burge and Karlin 1997）、GenomeScan（Yeh et al. 2001）、TBLASTX（Gish and States 1993）、GeneID（Blanco et al. 2002）和 SGP-2（Parra et al. 2003）的性能。结果相当令人失望。在核苷酸层面，这些程序的平均敏感性/特异性（[Sp + Sn]/2）值为 0.62 到 0.75，CC 值为 0.54 到 0.73。在外显子层面，这些程序的平均敏感性/特异性值为 0.54 到 0.62；而在基因/转录本层面，平均敏感性/特异性值为 0.05 到 0.11。最后一组数值最值得关注，因为它们反映了基因预测性能的真实水平。有趣的是，GENSCAN 和 GenomeScan 的表现略差于 GeneID 和 SGP-2。事实上，SGP-2 的表现始终优于所有“纯”ab initio 预测器，因为它还利用了来自小鼠 22 号染色体的比较基因组数据。从技术上说，纳入实验序列数据使 SGP-2 成为一种外源性基因查找程序，而不是纯粹的 ab initio 基因预测程序。

2005-2006 年，DNA 元件百科全书（Encyclopedia of DNA Elements，ENCODE）项目第一阶段也实现了类似水平的高质量人工注释。ENCODE 是一个长期、多阶段项目，始于 2003 年，目标是识别人类基因组序列中的所有功能元件。在其试点阶段，研究者选择了人类基因组中的若干区域（约占 1%）进行详细研究。这个“金标准”数据集的可用性促成了第二项规模大得多的评价，该评价考察了纯 ab initio 预测器的预测性能，也考察了使用额外外源性数据（如序列同源性和实验测序数据）的基因查找程序的预测性能（Guigó et al. 2006）。在 Guigó 等人的研究中，测试了四个 ab initio 预测器：AUGUSTUS（Hoff and Stanke 2013）、GeneMark-A（Besemer and Borodovsky 2005）、GeneMark-B（Besemer and Borodovsky 2005）和 GeneZilla（Allen et al. 2006）。结果再次相当令人失望。在核苷酸层面，这些程序的 CC 值为 0.53 到 0.76。在外显子层面，这些程序的平均敏感性/特异性值为 0.40 到 0.57；在基因或转录本层面，平均敏感性/特异性值为 0.05 到 0.14。总体而言，AUGUSTUS 的表现显著优于其他 ab initio 程序，但仍未达到可以用它自动注释真核基因组的水平。然而，这项研究最重要的发现是：如果在预测过程中使用比较基因组数据或其他实验/外源性证据，真核基因注释质量可以显著提高（外显子层面最高可提高 2 倍，基因层面最高可提高 4 倍）。

正是因为这些研究，基因预测领域发生了重大变化。特别是，基因预测程序开发者从勉强使用实验或外源性数据，转变为积极拥抱实验数据。换言之，基因预测开始转变为基因查找，基因组预测也开始向基因组注释演化。在这一过程中，基因组分析成为一种更整体化、以证据为基础的过程，将 ab initio 基因预测与外源性基因查找方法结合起来。这些外源性基因查找方法整合了许多其他计算工具和其他证据线索，包括基因表达数据、蛋白质组数据、与其他已注释基因组的序列同源性，甚至来自文献的数据。

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译文：Ch5 Genome Annotation / Evidence Generation for Genome Annotation

章节：Ch5 Genome Annotation

Canonical 小节：Evidence Generation for Genome Annotation

范围：PDF page 153 中部 - PDF page 161 上部；印刷页码 133-141

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第5章 基因组注释

基因组注释的证据生成

基因组证据是指任何可用于识别或说明某一生物体中基因结构的信息，无论该生物体是原核生物还是真核生物。一些最有用的证据来自实验工作，例如转录数据（mRNA，或来自 RNA-seq 实验的 DNA 数据），或来自目标生物体及其近缘生物体的蛋白质序列数据。其他类型的证据可以通过运行各种生物信息学程序来获得；这些程序能够识别基因组特征，例如序列重复、tRNA 和 rRNA 基因、假基因、转录因子结合位点、逆转录病毒、前噬菌体，等等。在下面几节中，我们将简要回顾一些用于外源性基因查找和基因组注释的证据生成方法。

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<!-- BEGIN LEGACY FRAGMENT: 06_Gene_Annotation_and_Evidence_Generation_Using_RNA_seq_Data -->

第5章 基因组注释

使用 RNA-seq 数据进行基因注释和证据生成

RNA 测序（RNA sequencing，RNA-seq）是一种下一代 DNA 测序（next-generation DNA sequencing，NGS）技术。它先将 RNA（mRNA、tRNA 和 rRNA）转录本转化为双链 cDNA 片段，然后使用低成本 NGS 测序方法对其进行测序（Wang et al. 2009）。在过去十年中，RNA-seq 帮助革新了真核生物和原核生物的基因组注释方法（Trapnell et al. 2009；Sallet et al. 2014）。

一个典型的 RNA-seq 实验会生成成千上万条短 DNA 序列读段，这些读段对应于基因编码区域（也称为编码序列，coding sequence，CDS 片段）。随后，可以使用带缺口的短读段比对程序将这些序列比对到参考基因组序列上，以确定哪些基因组区域正在被转录。较常用的带缺口短读段比对程序包括 TopHat2（Kim et al. 2013）、Stampy（Lunter and Goodson 2011）和 GSNAP（Wu et al. 2016）。这些比对结果还可以使用 Cufflinks（Trapnell et al. 2012）、StringTie（Pertea et al. 2015）或 Trinity（Grabherr et al. 2011）等工具进一步处理为候选转录本。通过这种方式，RNA-seq 可以提供关于基因编码区域位置的实验依据（通过 DNA 测序获得）。

当使用 RNA-seq 数据时，基因查找性能和基因注释质量的提高相当显著。在 RGASP（Steijger et al. 2013）中，研究者比较了 14 种不同的基因组注释方法（包括内源性/ab initio 方法、外源性方法以及外源性/内源性混合方法）。用于比较的金标准是 GENCODE 项目提供的人类参考基因组注释，其中包含由计算、人工和实验方式确定的基因注释（Harrow et al. 2012）。结果表明，在识别蛋白质编码基因这一任务中，表现最好的程序是使用 RNA-seq 数据的基因注释工具。将 RNA-seq 数据纳入基因查找过程的基因注释程序包括 AUGUSTUS（Hoff and Stanke 2013）、mGENE（Schweikert et al. 2009）、Trembly 和 Transomics（Sperisen et al. 2004）。

如前所述，在为基因组注释处理 RNA-seq 数据时，可以将原始读段与基因组进行剪接比对；或者，也可以先从头组装转录本片段，再通过 BLASTN 将其比对到基因组上。RGASP 评估显示，这种“先比对”（mapping-first）方法可以产生更准确的注释，因此强烈推荐使用。剪接比对可以用 GSNAP（Wu et al. 2016）、Stampy（Lunter and Goodson 2011）、TopHat2（Kim et al. 2013）或 STAR（Dobin et al. 2013）等工具完成。将 RNA-seq 数据中的覆盖度信息整合到基因注释工具中，通常可以通过提高被 RNA-seq 覆盖的候选外显子的得分来实现；提高幅度取决于每个被覆盖外显子区域的局部覆盖度。对于 HMM 来说，奖励由 RNA-seq 证据支持的单个剪接位点相对容易。一些基因注释工具还会整合来自 RNA-seq 数据的完整内含子证据（即剪接位点对）。

与短读段（100-400 个碱基）相比，能够产生更长 RNA-seq 读段（10 000+ 个碱基）的新技术，极大提高了预测可变剪接转录本的能力；短读段主要有助于发现局部可变剪接变体。长读段往往接近完整转录本，每一次剪接比对都能给出一个转录本结构，尽管由于测序错误率相对较高，这种结构通常只是近似的。AUGUSTUS 等基因查找程序可以整合来自长读段比对的证据，从而进一步提高其性能。

虽然 RNA-seq 极大改善了许多真核基因查找程序的表现，但仍然还有很长的路要走。根据 RGASP 评估（Steijger et al. 2013），表现最好的方法从秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）基因组中识别出约 59% 的蛋白质编码转录本（AUGUSTUS、mGene 和 Transomics），从黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）基因组中识别出 43%（AUGUSTUS），而从人类（Homo sapiens）基因组中仅识别出 21%（Trembly）。因此，RNA-seq 数据还没有（至少目前还没有）成为“解决”真核基因组准确自动注释问题的关键。仍然存在一些重要问题，包括：相当一部分基因或剪接形式可能不会在任何 RNA-seq 样本中表达；被转录的序列可能并不编码蛋白质；即使它们编码蛋白质，正确的蛋白质编码 ORF 仍需识别；转录本组装以及将转录本映射回基因组的过程也出了名地容易出错。这些错误通常出现在外显子边界附近，组装结果常常会延伸进内含子，有时还会漏掉整个外显子。

已经开发出若干程序来帮助解决这些映射问题，包括 Exonerate（Slater and Birney 2005）和 GeneWise（Birney et al. 2004）。这两个程序都是“剪接感知”（splice-aware）工具，可用于修正 BLAST 比对。修正后的比对随后可用于改进对外显子、内含子、剪接位点以及 5′ 和 3′ UTR 的注释。

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<!-- BEGIN LEGACY FRAGMENT: 07_Gene_Annotation_and_Evidence_Generation_Using_Protein_Sequence_Databases -->

第5章 基因组注释

使用蛋白质序列数据库进行基因注释和证据生成

正如 RNA-seq 数据可以作为基因存在的证据一样，序列同源性也可以用于在新测序生物中定位或识别新基因。在基于同源性的基因查找中，新测序生物的 DNA 序列会被翻译成候选蛋白质序列，然后将这些候选序列与已知蛋白质数据库进行比较。蛋白质层面的同源匹配随后可用于在 DNA 层面对基因进行注释、识别和定位。与 ab initio 基因预测相比，基于同源性的基因查找有一个关键优势：同源性方法不仅能提供识别和定位信息（这一点 ab initio 方法也能做到），还可以根据新识别基因与蛋白质序列数据库中既有注释蛋白之间的序列相似性，推断出可能的基因名称和可能的基因功能。

翻译核苷酸搜索，例如 BLASTX 搜索（Gish and States 1993），是最简单的基于同源性的基因预测方法之一。在比较原核基因组中的 ORF 时，这些搜索尤其有用。然而，当处理真核基因的分裂结构时，类似 BLASTX 的搜索并不能很好地解析外显子剪接边界。一种有用的方法是同时使用翻译核苷酸搜索结果和 ab initio 方法产生的结果。这类混合方法的例子包括 GenomeScan（Yeh et al. 2001）、GeneID（Blanco et al. 2002）和 AUGUSTUS（Hoff and Stanke 2013）等程序。GenomeScan 是 GENSCAN 的扩展版本，它利用 BLASTX 纳入了与已知蛋白质的序列相似性。

通过序列同源性进行真核基因预测时，一种更复杂的方法是将基因组查询序列与一个蛋白质目标序列进行比对；该目标序列被认为与正在注释的基因组序列所编码的蛋白质同源。在这些通常称为剪接比对（spliced alignments）的比对中，查询序列中对应于内含子的大缺口只允许出现在“合法”的剪接连接处。使用这种方法的程序包括 PROCRUSTES（Gelfand et al. 1996）、GeneWise（Birney and Durbin 1997）、Exonerate（Slater and Birney 2005）、BLAT（Kent 2002）和 GenomeThreader（Gremme et al. 2005）。

剪接比对方法并没有利用基于同源性的基因预测中通常可获得的全部信息。事实上，对于任意给定蛋白质，往往可以获得一整个相关蛋白家族。这样一组序列所携带的信息多于单个蛋白质。例如，一个构建良好的多序列比对（multiple sequence alignment，MSA）可以显示哪些区域高度保守，哪些区域容易发生插入或缺失。利用 MSA，可以计算某个氨基酸出现在某个位点的概率。利用这些数据，可以计算 PWM 或 PSSM，并创建所谓的 MSA profile。虽然为原核基因组创建 MSA 的任务相对容易，但由于重复序列以及大规模基因组重排、重复和缺失的存在，为真核基因组创建 MSA 尤其具有挑战性。

因此，与其尝试用一组单独的蛋白质序列来查找基因或外显子，不如使用已比对蛋白质家族的 MSA 来完成这项工作。这些 MSA 可以在 OrthoDB 等直系同源数据库中找到（Waterhouse et al. 2013）。已经开发出若干优秀软件工具，可以在给定某个蛋白质家族的 MSA profile 表示后，搜索该家族成员的基因结构。这些工具包括 GeneWise（Birney and Durbin 1997）和 AUGUSTUS-PPX（Keller et al. 2011），其中 PPX 代表 Protein Profile eXtension。已有研究显示，与剪接比对方法相比，AUGUSTUS-PPX 可以提高基因预测准确性，尤其是在处理含有大量外显子的基因时。不过，MSA 方法受限于是否存在同源家族以及序列相似性的程度。因此，MSA 基因查找最适合用于中等到高度序列相似性的情况。

近来，随着 BUSCO（Simão et al. 2015）的开发，这一 MSA 概念被扩展到覆盖序列相似性更远的情况。BUSCO 是 Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs（通用单拷贝直系同源基准）的缩写。这些单拷贝直系同源物对应于一组数量相对较少、但高度保守的蛋白质；它们在生命树中许多不同门类里都以单拷贝基因形式存在。目前，BUSCO 数据集包括脊椎动物 3023 个基因、节肢动物 2675 个基因、后生动物 843 个基因、真菌 1438 个基因、真核生物 429 个基因，以及原核生物 40 个通用标记基因。使用 HMMER（Eddy 2009），可以将 BUSCO 基因集快速搜索到任何给定查询基因组中。某一生物中这些 BUSCO 基因的存在或缺失，可以很好地衡量基因组组装的完整性。它也可以很好地衡量给定基因组注释或给定基因组预测的完整性。

<!-- END LEGACY FRAGMENT: 07_Gene_Annotation_and_Evidence_Generation_Using_Protein_Sequence_Databases -->

<!-- BEGIN LEGACY FRAGMENT: 08_Gene_Annotation_and_Evidence_Generation_using_Comparative_Gene_Prediction -->

第5章 基因组注释

使用比较基因预测进行基因注释和证据生成

另一种基于同源性的基因预测方法利用了这样一个事实：目前已经有大量且数量仍在增长的完整测序、注释良好的基因组可用。这催生了一种称为比较基因预测（comparative gene prediction）的技术。比较基因预测背后的基本理由是，功能区域（即蛋白质编码区域）往往比非蛋白质编码区域更加保守。这个观察为在新测序基因组中识别蛋白质编码区域提供了基础。

比较基因预测方法利用序列同源性，但其尺度比前面描述的蛋白质序列相似性方法要全局得多。在比较基因预测中，“已知”基因组和“未知”基因组来自不同物种，但这些物种被假定为亲缘关系足够近，以至于它们的整个基因组可以相互比对。由于这些基因组非常长（从数百万到数十亿个碱基不等），成对比对或 MSA 通常会被分解成许多共线性（同源）区域的局部比对。

早期的比较基因查找方法通常只使用两条基因组序列作为输入，例如 DOUBLESCAN（Meyer and Durbin 2002）、TWINSCAN（Korf et al. 2001）、SLAM（Alexandersson et al. 2003）或 SGP-2（Parra et al. 2003）。SLAM 是一种基于 HMM 的方法，在这种方法中，基因预测和序列比对同时进行。TWINSCAN 和 DOUBLESCAN 是 GENSCAN 的扩展版本，而 SGP-2 是 GeneID 的扩展版本。

后来，人们开发出了可以使用两条以上基因组序列来预测新基因组中基因的比较基因查找方法，不过这些方法当时仍只针对单个目标基因组进行预测。这些方法包括 N-SCAN（Gross and Brent 2006）、CONTRAST（Gross et al. 2007）和 Mugsy-Annotator（Angiuoli et al. 2011）等程序。近来，一种称为进化枝注释（clade annotation）的方法被开发出来，并被实现到 AUGUSTUS 的一个版本中，即“comparative AUGUSTUS”（König et al. 2016）。进化枝注释允许对多个目标基因组进行同步比对和注释。例如，comparative AUGUSTUS 可用于同时注释多个（最多 20 个）不同小鼠品系的基因组。

<!-- END LEGACY FRAGMENT: 08_Gene_Annotation_and_Evidence_Generation_using_Comparative_Gene_Prediction -->

<!-- BEGIN LEGACY FRAGMENT: 09_Evidence_Generation_for_Non_Protein_Coding_Non_Coding_or_Foreign_Genes -->

第5章 基因组注释

非蛋白质编码、非编码或外源基因的证据生成

确定蛋白质编码基因位置的最佳方法之一，是确定它不在什么地方。换句话说，如果知道某个 DNA 片段不可能编码蛋白质，就可以将其从基因/蛋白质查找过程中排除。原核基因组包含许多不编码蛋白质的基因。这些基因包括 tRNA 和 rRNA 基因，也包括许多外源性前噬菌体基因；这些前噬菌体基因可能编码真实的噬菌体蛋白，也可能不编码。类似地，真核基因组中充满了重复区域、假基因、反转座子和逆转录病毒基因，也包含各种 tRNA 和 rRNA 基因。这些非蛋白质编码或非编码元件可占某一原核基因组的 20-30%（Casjens 2003），并可占真核基因组的 90% 以上（Li et al. 2004）。

<!-- END LEGACY FRAGMENT: 09_Evidence_Generation_for_Non_Protein_Coding_Non_Coding_or_Foreign_Genes -->

<!-- BEGIN LEGACY FRAGMENT: 10_tRNA_and_rRNA_Gene_Finding -->

第五章 基因组注释

tRNA and rRNA Gene Finding（tRNA 和 rRNA 基因寻找）

原核生物和真核生物的基因组中都有相当大的一部分被 tRNA 和 rRNA 基因所占据。细菌和古菌通常各自含有 70–80 个 tRNA 基因拷贝，以及 3–45 个 rRNA 基因拷贝。tRNA 分子是 L 形的 adaptor RNA 分子，长度通常为 76–90 个核苷酸，是翻译过程中必不可少的分子（如图 5.7 所示）。从原理上讲，翻译所有 61 个编码（正义）密码子共需要 61 个 tRNA 基因。然而，由于一种名为"碱基摆动"（base wobble）的现象，许多生物能够用一个 tRNA 来识别两个或更多的密码子。因此，大多数原核生物拥有 35–40 个不同的 tRNA 基因，但每个基因只有一或两个拷贝。

rRNA 分子是核糖体（所有细胞的翻译引擎）的主要成分（按质量计 >60%）。在原核生物中，核糖体由两个亚基——小亚基和大亚基——配对组成。原核生物中的 rRNA 包括大亚基中的 5S 和 23S rRNA，以及小亚基中的 16S rRNA。编码这些 rRNA 的基因通常排列成操纵子（即 rrn operon），在 16S 和 23S rRNA 基因之间有一个内部转录间隔区。原核生物中 rrn operon 的数量因基因组而异，从 1 个到 15 个不等。

真核生物的 tRNA 和 rRNA 基因与原核生物有许多相似之处（结构和大小均相似）。然而也存在一些细微差异。例如，真核生物通常拥有比原核生物多得多拷贝的 tRNA 基因。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）有 275 个 tRNA 基因，秀丽隐杆线虫（C. elegans）有 620 个 tRNA 基因拷贝，人类则有 497 个 tRNA 基因拷贝。所有真核生物都拥有 22 个线粒体 tRNA 基因。与原核生物类似，真核生物的 rRNA 基因也按其在核糖体大亚基或小亚基中的位置进行分类。然而，真核生物的大亚基中有三种 rRNA（而非原核的两种）：5S、5.8S 和 28S。与原核生物相同，真核生物在小核糖体亚基中有一个 rRNA 基因（18S rRNA），但同时也为线粒体核糖体编码 rRNA 基因（12S 和 16S rRNA 基因）。与原核生物不同，真核生物的 rRNA 基因通常以串联重复的形式存在大量拷贝。在人类中，约有 300–400 个 rRNA 重复单元，分布在五条不同染色体的五个簇中。与原核生物的 tRNA 基因不同，真核生物的部分 tRNA 基因含有内含子。

tRNA 的结构在所有主要生物界中高度保守，针对原核生物和真核生物已知的 tRNA 序列也数量庞大。因此，大多数 tRNA 基因鉴定方法都利用共同的序列模体（可通过 HMM 识别）并采用某种形式的序列同源性或数据库比对来鉴定 tRNA 基因。目前性能最佳且最流行的方法是 RNAmmer（Lagesen et al. 2007）、tRNAfinder（Kinouchi and Kogawa 2006）和 tRNAscan-SE（Lowe and Eddy 1997）。这些程序能够以非常高的准确率（>95%）在原核生物和真核生物中鉴定 tRNA 基因。除这些程序外，还有若干专用的 tRNA 序列数据库可辅助比较 tRNA 鉴定方法，包括 tRNAdb 和 tRNA-DB-CE（Jühling et al. 2009; Abe et al. 2014）。目前，tRNA 基因的鉴定被认为是一个"已解决"的问题。

与 tRNA 基因一样，rRNA 基因也表现出非常高的序列保守性，有许多 rRNA 模体可用 HMM 来描述。这些 HMM 已被整合到一个名为 RNAmmer 的程序（及网络服务器）中（Lagesen et al. 2007）。RNAmmer 能够鉴定来自原核生物和真核生物的所有 rRNA，但 5.8S rRNA 除外。由于 rRNA 基因的复杂性、长度以及相对较少的已有注释，rRNA 预测的性能尚未达到与 tRNA 预测相同的水平。除 RNAmmer 预测工具外，还有一个名为 Rfam 的 RNA 数据库（Kalvari et al. 2018），其中包含 >2600 个 RNA 家族（包括 rRNA 和 tRNA 序列家族）。Rfam 中的每个序列家族由一个 MSA、一个共识二级结构和一个协方差模型来表示。Rfam 可通过序列比对或 MSA 来进行 rRNA（及其他 RNA 基因）的鉴定。无论这些工具目前有何不足，使用 tRNA 和 rRNA 基因鉴定工具总能提高任何蛋白质编码基因发现或基因预测工作的准确性，同时也能提升整体基因组注释的质量。

<!-- END LEGACY FRAGMENT: 10_tRNA_and_rRNA_Gene_Finding -->

<!-- BEGIN LEGACY FRAGMENT: 11_Prophage_Finding_in_Prokaryotes -->

第五章 基因组注释

Prophage Finding in Prokaryotes（原核生物中的前噬菌体识别）

原核生物不断受到称为 bacteriophages（噬菌体）的细菌病毒攻击，这些病毒能够杀死或削弱易感细菌。噬菌体是地球上数量最多的生物实体，在细菌生态系统中发挥着重要作用，并且是推动微生物遗传变异或遗传多样性的重要力量。这种遗传多样性主要通过噬菌体生活史中一个非常独特的阶段——lysogeny（溶原化）——而产生。溶原化是指噬菌体基因组（通常由 10–20 个基因组成）在明确的插入位点整合进宿主细菌染色体的过程。完成遗传整合后的噬菌体称为 prophages（前噬菌体）。在某些情况下，前噬菌体会永久嵌入细菌基因组，成为 cryptic prophages（隐匿前噬菌体）（Little 2005）。这些隐匿前噬菌体常常作为宿主微生物未来进化变化的遗传“素材”或“储备”（Bobay et al. 2014）。此外，前噬菌体和隐匿前噬菌体往往会引入致病相关元件或致病岛，而这些区域的碱基组成通常与宿主基因组存在明显差异。在某些细菌基因组中，前噬菌体和隐匿前噬菌体可占全部遗传物质的 20% 之多（Casjens 2003）；其中某些前噬菌体基因编码可表达蛋白，而另一些则不编码。

鉴于这类噬菌体特异性遗传元件数量很多，对其进行识别具有相当重要的意义，尤其是在细菌基因组注释中。前噬菌体和隐匿前噬菌体序列表现出某些特征性序列特征，例如整合酶（integrases）和转座酶（transposases）的存在、attachment sites（附着位点）以及异常的碱基组成；这些特征可用于将其与“正常”的细菌基因区分开来。若再结合 HMM 来增强这些序列特征的识别任务，就能够以相对较高的准确性识别前噬菌体和隐匿前噬菌体序列。若进一步将待分析基因组与已知噬菌体序列数据库进行比较基因组分析，则识别准确率还可进一步提升。在过去十年里，已经开发并部署了若干细菌前噬菌体识别程序，包括 Phage_Finder（Fouts 2006）和 ProphageFinder（Bose and Barber 2006）。近些年来，噬菌体识别已经从独立程序逐步转向 web server。特别是，已有两个新的 web server 发布，与现有工具相比，它们在前噬菌体识别中提供了更快的速度和更高的准确率，即 PHAST（Zhou et al. 2011）和 PHASTER（Arndt et al. 2016）。这两个 web server 的准确率都在 85%–95% 之间（取决于所进行的测试），并且都能提供丰富的图形化输出，以及对前噬菌体序列及其周围细菌基因组序列的详细注释（图 5.8）。

无论采用哪一种方法，对前噬菌体和隐匿前噬菌体基因进行注释都无疑会提升原核基因组注释的整体质量，而且通常还会提高原核基因预测的准确性。

<!-- END LEGACY FRAGMENT: 11_Prophage_Finding_in_Prokaryotes -->

<!-- BEGIN LEGACY FRAGMENT: 12_Repetitive_Sequence_Finding_Masking_in_Eukaryotes -->

第五章 基因组注释

Repetitive Sequence Finding/Masking in Eukaryotes（真核生物中的重复序列寻找/遮蔽）

与原核生物不同，真核生物基因组含有大量 repetitive DNA（重复 DNA）。这些重复序列包括 retrotransposons（逆转座子）和 DNA transposons（DNA 转座子），二者都称为 dispersed repeats（分散重复）；此外还包括高度重复的序列，通常称为 tandem repeats（串联重复）。真核生物中最丰富的重复序列是逆转座子。逆转座子是一类遗传元件，能够通过类似逆转录病毒所用的“复制-粘贴”机制来扩增自身。为了复制和扩增，它们首先被转录为 RNA，随后通过 reverse transcription（逆转录）转换回相同的 DNA 序列，再插入基因组的特定靶位点。与逆转座子不同，DNA 转座子在复制和粘贴时不经过 RNA 中间体，而是使用一种称为 transposase（转座酶）的蛋白质。人类基因组约 52% 由逆转座子构成，而 DNA 转座子又占另外 3%（Lander et al. 2001; Wheeler et al. 2013）。在植物中，逆转座子更加丰富，可占任一植物基因组 DNA 的 60%–90%（Li et al. 2004）。

逆转座子家族包含两个亚家族：long terminal repeat retrotransposons（长末端重复逆转座子，LTR retrotransposons）和 non-LTR retrotransposons（非 LTR 逆转座子）。LTR retrotransposons 是一类类似逆转录病毒的序列，含有长度从约 100 bp 到超过 5 kb 不等的 LTR。事实上，只要使某些支持病毒在细胞间传播的基因（例如 envelope protein，包膜蛋白）失活或缺失，逆转录病毒就可以转变为 LTR retrotransposon。大多数 LTR retrotransposons 是无功能的 endogenous retroviruses（内源性逆转录病毒），也称为 proviruses（前病毒）。从这个意义上说，真核生物的 LTR retrotransposons 可被视为原核生物 prophages（前噬菌体）或 cryptic prophages（隐匿前噬菌体）的对应物。人类内源性逆转录病毒序列似乎全部存在缺陷或不能复制，约占人类基因组的 8%（Taruscio and Mantovani 2004）。

Non-LTR retrotransposons 包含两个亚型：long interspersed nuclear elements（长散在核元件，LINEs）和 short interspersed nuclear elements（短散在核元件，SINEs）。LINEs 通常长约 7000 bp，并编码若干基因，以覆盖逆转座所需的全部功能。这些基因包括 reverse transcriptase（逆转录酶）和 endonuclease（内切核酸酶）基因，以及若干形成 ribonucleoprotein particle（核糖核蛋白颗粒）所需的基因。人类基因组中存在超过 850000 个 LINE 拷贝，覆盖全部人类 DNA 的 21%（Cordaux and Batzer 2009）。然而，超过 99% 的 LINE 在遗传上已经“死亡”，失去了逆转座功能。与 LINEs 相比，SINEs 小得多，通常只是长度为 80–500 bp 的 DNA 片段。SINEs 数量极多（可达数百万拷贝），约占人类基因组 DNA 的 10%。人类中最常见的 SINE 是 Alu repeats（Alu 重复）（Häsler and Strub 2006）。Alu repeats 长约 300 bp，在灵长类动物中高度保守，并经常发生 DNA methylation（DNA 甲基化）事件。

除 transposable elements（转座元件，或 dispersed repeats）外，真核生物还含有大量 tandem repeats，包括 minisatellite DNA（小卫星 DNA）、microsatellite DNA（微卫星 DNA，也称为 short tandem repeats，STRs，短串联重复；或 simple sequence repeats，SSRs，简单序列重复）以及 telomere repeats（端粒重复）。Minisatellite DNA 由长度为 10–60 bp 的重复单元组成，整体可延伸约 2 kb，并散布于整个基因组中。Microsatellite DNA 由 1–6 bp 的重复单元构成，可延伸数百 kb，尤其常见于着丝粒周围。Telomere repeats 由高度保守的 6 bp 序列（TTAGGG）组成，该序列重复 250–1000 次，并且只存在于真核染色体末端。Mini- 和 microsatellite DNA 合计约占人类基因组 DNA 的 5%（Subramanian et al. 2003）。

真核生物拥有如此多的重复序列，而且这些重复序列又占其基因组很大比例（通常 >50%），这促使基因组注释人员集中精力去识别、移除或遮蔽这些序列。原因在于，重复序列会严重阻碍基因识别和基因组注释工作。例如，ab initio gene predictors（从头基因预测器）很容易把逆转座子和 DNA 转座子误判为外显子。同样，在基因寻找中使用比较基因组学方法时，STRs 也可能导致虚假的比对。STRs（也称为 low-complexity regions，低复杂度区域）通常可通过两种技术处理：soft masking（软遮蔽）或 hard masking（硬遮蔽）。软遮蔽是将序列文件中的字母大小写从大写改为小写；而硬遮蔽则把有问题的序列改为 N，从而将其完全排除在考虑之外。软遮蔽可防止被遮蔽区域作为比对种子，同时保留序列身份信息，从而尽量减少非目标比对。软遮蔽通常由 SEG 和 DUST 程序完成（Wootton and Federhen 1993），这两个程序存在于大多数版本的 BLAST 序列比对套件中。

虽然 tandem repeats 相对容易处理，但重复性 transposable elements（如 retrotransposons）要困难得多。这是因为这些序列大得多，也复杂得多。Repbase 数据库（Jurka et al. 2005）收录了来自广泛物种的重复序列和转座元件的综合集合。该资源常用于通过比较序列分析识别重复元件。然而，如果转座子序列与 RepBase 中的序列高度分化，就可能需要使用其他方法或其他数据库。Dfam（Wheeler et al. 2013）是一个更高级的重复元件数据库示例。在 Dfam 中，原始 Repbase 序列被转换为 HMM。使用这些 HMM 后，可识别出更多转座元件（在人类中最高可达 54.5%，而非 44%），并且准确性大幅提高（Wheeler et al. 2013）。

除 Dfam（既可作为 server 使用，也可下载为资源）外，还开发了若干独立程序和 web server，用于专门识别 retrotransposons，包括 RECON（Bao and Eddy 2002）、RepeatScout（Price et al. 2005）、RetroPred（Naik et al. 2008）、LTR_FINDER（Xu and Wang 2007）、LTRharvest（Ellinghaus et al. 2008）和 MITE-Hunter（Han and Wessler 2010）。这些程序能够识别并标记 LTR 或 non-LTR retrotransposons。虽然这类信息对某些研究者有用，但许多基因组注释人员只是希望把 retrotransposons 从分析考虑中移除。在这一方面，RepeatMasker（Tarailo-Graovac and Chen 2009）已经成为首选工具，因为它会直接 hard mask（即移除）目标基因组中所有可检测到的 retrotransposon 序列。

一般而言，对 transposable elements 进行 hard masking 通常是真核基因组注释的第一步。使用 Dfam 这类工具或 RepeatMasker 这类程序进行 hard masking，不仅可以移除“无关紧要”的遗传数据，还能加快基因识别过程并提高注释准确性。由于编码外显子通常不会与重复元件重叠，也不倾向于包含重复元件，因此在使用 hard-masked sequences 时，ab initio gene prediction programs 往往会预测出更少的假阳性外显子。例如，当使用不同的 ab initio gene predictors 分析 22 号染色体时，研究者发现假阳性基因预测显著减少（Parra et al. 2003）。具体而言，在不使用序列遮蔽时，GENSCAN 最初预测了 1128 个蛋白质编码基因；而使用序列遮蔽后，预测基因数降至 789。使用 GeneID 时，预测数量从 1119 降至 730。根据最新的 GENCODE 注释，22 号染色体中实际的蛋白质编码基因数量为 489。

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<!-- BEGIN LEGACY FRAGMENT: 13_Finding_and_Removing_Pseudogenes_in_Eukaryotes -->

第五章 基因组注释

Finding and Removing Pseudogenes in Eukaryotes（真核生物中假基因的寻找与去除）

真核基因组注释中的一个特殊挑战，是区分那些识别出“真实”基因的预测结果，以及那些实际上对应 non-functional pseudogenes（无功能假基因）的预测结果。数据库搜索未必能让情况变得更清楚，因为许多假基因与有功能的 paralogous genes（旁系同源基因）相似。RNA-seq 实验中没有检测到 RNA transcript（RNA 转录本）也不能作为判断标准，因为真正的基因并不总是在所有条件下都有 RNA 转录本，这可能受到组织表达差异或发育阶段差异的影响。一般来说，如果某个无内含子的基因预测在同一基因组中存在多外显子旁系同源基因，那么它就值得怀疑，因为这可能提示该序列是通过 retrotransposition（逆转座）产生的。

然而，多外显子预测也可能对应由近期 gene duplication event（基因重复事件）产生的假基因。如果在另一种生物中存在 homologs（同源基因），一种解决办法是计算 synonymous versus non-synonymous substitution rate（同义替换率与非同义替换率之比，Ka/Ks；Fay and Wu 2003）。Ka/Ks 值接近 1 通常提示 neutral evolution（中性进化），从而暗示该序列可能是假基因。对多外显子基因预测的支持证据可以来自对近缘同源基因中整体基因结构保守性的评估。例如，在两个亲缘关系适中的生物（如小鼠和人类）中预测或识别到同源基因，通常提示该基因是真实基因，而不是假基因（Guigó et al. 2003）。

<!-- END LEGACY FRAGMENT: 13_Finding_and_Removing_Pseudogenes_in_Eukaryotes -->

译文：Ch5 Genome Annotation / Genome Annotation Pipelines

章节：Ch5 Genome Annotation

Canonical 小节：Genome Annotation Pipelines

范围：PDF page 161 下部 - PDF page 165 上部；印刷页码 141-145

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<!-- BEGIN LEGACY FRAGMENT: 14_Genome_Annotation_Pipelines -->

第五章 基因组注释

Genome Annotation Pipelines（基因组注释流水线）

在基因组注释的早期，仅测序一个生物体通常就需要数年时间。研究人员和生物信息学人员会聚集在一起，协作数月甚至数年，完成基因组组装、初始的 ab initio gene predictions（从头基因预测）、手工汇总实验或文献来源的证据、进行比较序列分析，然后将这些数据综合为一个 consensus genome annotation（一致性基因组注释）。这种做法过去常规用于细菌和真核基因组（Lander et al. 2001; Winsor et al. 2005; Riley et al. 2006）。事实上，GENCODE 项目仍在这样做；该项目自 2003 年以来一直在制备并更新人类参考基因组注释（Harrow et al. 2012）。然而，这些工作过去需要、现在也仍然需要大量资源和时间。随着 very high-throughput NGSs（超高通量下一代测序技术）的出现，以及如今能够在几天内常规完成整个基因组测序，基因组注释的这些手工方法已经变得不可持续。现在，大多数基因组注释都通过 automated pipelines（自动化流水线）完成，这些流水线帮助用户综合多种证据和数据，生成一致性基因组注释。

pipeline 工具的选择取决于生物类型（真核生物还是原核生物）、可用计算资源、可用证据（是否有 RNA-seq 数据），以及该生物与已有注释生物之间的相似程度。例如，如果要注释的基因组有一个亲缘关系很近且已经注释过的物种，那么简单的比较分析或序列投射通常就足够了。如果目标生物没有近缘的已注释物种，那么使用 RNA-seq 或实验获得的蛋白质序列数据的 pipeline 会生成更准确的注释。最先进的基因组注释流水线需要调用许多程序并执行复杂分析，因此需要超级计算机级资源，例如大型多核机器或大规模计算集群（可本地维护，也可通过 Cloud 获得）。例如，注释火炬松（loblolly pine）基因组需要 8640 个 central processing units（CPUs）运行 14.6 小时；该基因组包含 220 亿个碱基，是人类基因组的 7 倍（Wegrzyn et al. 2014）。在以下几节中，我们将简要介绍一些常用的原核和真核生物注释流水线。

<!-- END LEGACY FRAGMENT: 14_Genome_Annotation_Pipelines -->

<!-- BEGIN LEGACY FRAGMENT: 15_Prokaryotic_Genome_Annotation_Pipelines -->

第五章 基因组注释

Prokaryotic Genome Annotation Pipelines（原核基因组注释流水线）

原核生物的注释流水线通常不需要像真核生物注释那样多的计算资源。事实上，大多数细菌基因组无论是在 web server 上还是在台式计算机上，都可以在 30 分钟以内完成注释。不过，近来向 metagenomics（宏基因组学）或 community bacterial genomics（群落细菌基因组学）的转变，正在带来显著更高的计算需求；这一点将在第 16 章中更详细讨论。一些较受欢迎且公开可用的原核基因组注释流水线包括 Prokka（Seemann 2014）、Rapid Annotation using Subsystem Technology（RAST；Overbeek et al. 2014）和 Bacterial Annotation System（BASys；Van Domselaar et al. 2005）。Prokka 是一个开源 Perl 程序，在 UNIX 上以 command-line interface（命令行界面）运行。Prokka 可用于注释已经组装好的细菌、古菌和病毒序列。使用 Prokka 时，一个典型的 400 万碱基对细菌基因组可以在四核计算机上于 10 分钟内完成完整注释。Prokka 还能生成符合标准的输出文件，供后续分析或查看。Prokka 的吸引力在于速度快，并且能够在本地计算机上执行“私有”注释。

与 Prokka 不同，RAST 和 BASys 是基因组注释 web server。Web server 通常更易使用，但不能提供本地安装程序所具有的隐私性。RAST 是一个需要注册的 web server，它接受标准的、已组装的 DNA 序列文件，然后识别 protein-encoding genes（蛋白质编码基因）、rRNA 和 tRNA 基因，为这些基因分配功能，最后利用这些信息重建该生物的 metabolic network（代谢网络）。与 RAST 不同，BASys 是一个开放访问的 web server。BASys 接受来自细菌、古菌和病毒的、已组装的 FASTA 格式 DNA 或蛋白质文件，并执行许多与 RAST 相同的注释功能。不过，BASys 提供的注释深度要大得多（覆盖 50 多种可计算属性），并使用名为 CGView 的程序生成色彩丰富、易于查看的基因组图谱（图 5.9）（Stothard and Wishart 2005）。

图 5.9 BASys 对细菌 Salmonella enterica 进行基因组注释后输出结果的截图。BASys 图像可以交互式放大，从而显示基因组中所有基因的丰富注释信息。

<!-- END LEGACY FRAGMENT: 15_Prokaryotic_Genome_Annotation_Pipelines -->

<!-- BEGIN LEGACY FRAGMENT: 16_Eukaryotic_Genome_Annotation_Pipelines -->

第五章 基因组注释

Eukaryotic Genome Annotation Pipelines（真核基因组注释流水线）

鉴于真核基因组的复杂性，其对应的注释流水线必须比原核生物使用的流水线做得更多。具体而言，真核基因组注释流水线不仅需要整合 ab initio gene predictions（从头基因预测）或来自多个来源的多个基因预测结果，还需要整合许多其他类型的证据，包括实验数据。因此，几乎所有现代真核基因组注释流水线都采用一种称为"evidence clustering"（证据聚类）的技术来识别基因区域，然后利用对齐的 RNA（来自 RNA-seq）和蛋白质证据来提高基因预测器的准确性。部分流水线更进一步，使用"combiner" algorithm（组合算法）来选择证据支持度最好的外显子组合。在这方面尤为出色的两个组合程序分别是 JIGSAW（Allen and Salzberg 2005）和 EVidence Modeler，即 EVM（Haas et al. 2008）。这些程序根据已知的错误特征和各种用户输入来评估不同类型的证据，然后选择最佳的外显子组合以使误差最小化。具体而言，EVM 将对齐的蛋白质和 RNA 转录本证据与从头预测整合为加权 consensus gene models（一致性基因模型），而 JIGSAW 则使用非线性模型或加权线性组合器来选择单一最佳一致性基因模型。

在最为广泛使用的真核基因组注释流水线中（它们都使用某种组合算法）包括 MAKER2（Holt and Yandell 2010）、Ensembl（Fernández-Suárez and Schuster 2010）、美国国家生物技术信息中心（NCBI）真核注释流水线（Thibaud-Nissen et al. 2016）、PASA（Haas et al. 2008）和 BRAKER1（Hoff et al. 2016）。MAKER2 注释流水线是一个高度可并行化的独立程序，使用 BLAST 来对齐和优化蛋白质序列及转录组（RNA-seq）数据；它还向各种基因预测器提供基于证据的提示，并为每个注释创建带有各种质量指标 evidence trail（证据链）。MAKER2 的一些质量指标包括：RNA-seq 证据确认的剪接位点数量、RNA-seq 数据确认的外显子数量，以及 5' 和 3' UTR 的长度。MAKER2 还使用一种称为 Annotation Edit Distance（AED，注释编辑距离）的质量指标（Eilbeck et al. 2009）。AED 值介于 0 和 1 之间，质量越高的注释对应的 AED 值越低。MAKER2 利用这些 AED 值来选择最佳基因预测结果，并以此构建最终注释。与 MAKER2 流水线类似，Ensembl 基因组注释流水线也是从对齐和优化的蛋白质序列及 RNA-seq 衍生的转录组数据来构建基因模型。注释过程完成后，Ensembl 会合并相同的转录本，并为每个基因报告一套非冗余的转录本。MAKER2 和 Ensembl 都利用蛋白质和 RNA-seq 比对结果向其内部基因预测器提供内含子/外显子边界提示。这有助于生成能更好代表比对证据的基因模型。这种方法也有助于提高对训练不足（或不充分训练）的基因寻找器的基因预测准确性。与 Ensembl 和 MAKER2 流水线类似，NCBI 注释流水线也对齐和优化蛋白质及转录组数据。它还使用 Gnomon 基因寻找程序来生成基因预测（Souvorov et al. 2010）。NCBI 系统通常会给人工审查证据分配比计算衍生模型或计算生成证据更高的权重。PASA 基因组注释流水线是最古老的注释流水线之一，也是最早使用组合算法或证据聚类算法（EVM）的工具之一。PASA 使用 BLAT（Kent 2002）或 GMAP（Wu et al. 2016）将 RNA 转录本比对到参考基因组。PASA 能够基于 RNA 转录组数据、已有基因模型或从头基因预测来生成注释。PASA 与 MAKER2 和 Ensembl 注释流水线一样，能够通过 RNA-seq 数据向基因组注释添加 UTR，以进一步提高准确性。在公开可用的真核基因组注释流水线中，最新加入的之一是 BRAKER 程序套件（Hoff et al. 2016）。BRAKER1（以及更新的 BRAKER2）将 GeneMark-ET 与 AUGUSTUS 的优势相结合——这两者都利用 RNA-seq 数据来提高基因注释准确性。在 BRAKER 流水线中，首先使用 GeneMark-ET 进行训练并生成初始基因结构，然后 AUGUSTUS 利用最初预测的基因进行进一步训练，并将 RNA-seq 数据整合到最终基因预测中。研究表明，就基因和外显子的敏感性/特异性而言，BRAKER1 比 MAKER2 准确率高 10–20%。

即便外显子准确率达到 >90%（这甚至连最好的真核基因组注释流水线也罕能达到），一个基因组中的大多数基因仍至少会有一个注释错误的外显子。错误识别的基因或错误的基因注释会对设计实验研究基因功能的实验人员产生非常严重的后果。事实上，许多失败的分子生物学或基因克隆实验都可以追溯到错误的基因注释。此外，错误的注释会传播，导致影响许多其他科学家的连锁错误。当一个错误的注释被无辜地传递给另一个基因组项目，然后被用作更多基因组注释工作的证据，最终进入公共数据库时，就会发生这种情况。为了帮助防止这些错误或减少其影响程度，大多数注释流水线都会为每个基因注释附带某种质量指标。这些指标大多基于一个分数，该分数衡量给定基因注释与对齐的 RNA/蛋白质序列的一致性程度，或基于该基因与近缘物种的同源性和共线性。一些流水线使用简单的星级评分（从零星到五星）。零星对应于没有任何外显子被比对证据支持的注释，而五星则对应于每个外显子都得到支持且每个剪接位点都由单个全长 cDNA 确认的情况。其他流水线使用更复杂的指标，如上述的 AED 分数。蛋白质家族结构域也可以作为注释质量和注释完整性的良好指标。可以肯定的是，包含可识别蛋白质结构域的注释比不包含的注释更可能编码有功能的蛋白质。结构域匹配已被用于拯救大量基因注释——这些注释原本因序列比对质量差而得到了“不合格”的质量分数。Ensembl 和 MAKER2 都将含有蛋白质家族结构域的注释比例作为质量度量指标。有趣的是，这一比例（0.69）在各基因组中相当恒定；给定基因组越接近这一比例，人们对其质量就越有信心。除了结构域匹配比例外，BUSCO 基因的存在与否也可用于提供基因组注释完整性的度量（Simão et al. 2015）。确保高质量注释的另一个极好途径是通过人工检查以及使用基因组可视化和编辑软件。这将在下文中详细讨论。

<!-- END LEGACY FRAGMENT: 16_Eukaryotic_Genome_Annotation_Pipelines -->

<!-- BEGIN LEGACY FRAGMENT: 17_Visualization_and_Quality_Control -->

第五章 基因组注释

Visualization and Quality Control（可视化与质量控制）

尽管 automated 或 semi-automated 的基因组注释流水线已经成为常态，但在基因组注释及其质量评估中，仍然需要人的参与。由一位知识扎实的生物学家或某种“domain expert”（领域专家）仔细审视一套基因组注释，对于确保这些注释在逻辑上讲得通至关重要。这样的人工审查过程也使人们能够发现并纠正可疑注释，或补全缺失注释。然而，要执行这些人工审查或人工审查任务，就必须能够对注释进行可视化并进行交互式编辑。最知名的两个 genome browser 无疑是 University of California Santa Cruz Genome Browser（Casper et al. 2018）和 Ensembl Genome Browser（Fernández-Suárez and Schuster 2010）；这两者在第 4 章中都已经做过详细介绍。虽然这些工具非常适合用来可视化基因组注释，但也有不少其他工具同时支持基因组注释的可视化与编辑，包括 Web Apollo（Lee et al. 2013）、GenomeView（Abeel et al. 2012）和 Artemis（Carver et al. 2012）。

Web Apollo 既是可视化工具，也是基因组编辑器。更具体地说，它是 JBrowse（Westesson et al. 2013）的一个基于 Web 的 plug-in，能够提供用户创建且可编辑的注释轨道。Web Apollo 中的所有编辑都会实时对注释团队的所有成员可见。这一特性在开展 community annotation project（社区注释项目）或在某个特定基因组分析中有许多研究人员参与时尤其有帮助。GenomeView 是一个开源、独立运行的基因组查看器和编辑器，允许用户动态浏览大量已对齐的 short-read 数据。它支持从 whole genome level（全基因组层面）到 single nucleotide level（单核苷酸层面）的动态导航和 semantic zooming（语义缩放）。GenomeView 尤其以能够可视化相对于参考序列的数十个基因组的全基因组比对而著称。它还支持 synteny（共线性）和 multi-alignment data（多重比对数据）的可视化。Artemis 是一个 genome browser 和注释工具，允许用户轻松地可视化、浏览并解释大型 NGS 数据集。它支持多种序列读段视图和变异显示，以及一整套读段比对视图和读段比对过滤器。它还能够同时向用户展示同一数据集的多个不同视图。Artemis 可以读取 EMBL 和 GENBANK 数据库条目、FASTA 序列格式（索引版或原始版），以及 EMBL 和 GENBANK 格式中的其他特征信息。

在审查一个已注释基因组时（无论它来自原核生物还是真核生物），随机选择一个特定区域，并使用所选的可视化/编辑工具，将注释与所提供的证据结合起来仔细分析，始终是有用的。这些证据可能包括 ab initio 预测得到的基因、剪接后的 RNA-seq 比对结果，或任何同源蛋白质比对结果。在浏览所选区域时，人们可能会注意到某些基因或基因簇似乎与展示出来的证据相矛盾。例如，RNA-seq 数据可能支持额外的或不同的剪接形式。或者，某些跨物种蛋白质可能会映射到此前没有预测到基因的基因组区域。可视化检查还可以揭示注释流程中的某些系统性问题，例如倾向于漏掉在数据库中已有已知同源物的基因，或者出现与许多蛋白质编码基因重叠或将其遮蔽的重复序列。这些问题可以通过修改基因组注释流水线中的参数设置、手动进行必要编辑，或改用其他工具来解决。为了完成一套完整而彻底的基因组注释，通常需要经历多轮、迭代式的人工审查与人工编辑，然后再接 automated pipeline annotation（自动化流水线注释）。

<!-- END LEGACY FRAGMENT: 17_Visualization_and_Quality_Control -->

译文：Ch5 Genome Annotation / Summary + Acknowledgments + Internet Resources + Further Reading + References

章节：Ch5 Genome Annotation

Canonical 小节：Summary + Acknowledgments + Internet Resources + Further Reading + References

范围：PDF page 165 下部 - PDF page 174；印刷页码 145-154

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<!-- BEGIN LEGACY FRAGMENT: 18_Summary -->

第五章 基因组注释

Summary（小结）

在过去二十年中，基因组注释已经发生了显著演变。这些变化一方面源于计算技术（用于基因预测）的显著改进，另一方面也源于来自越来越多不同物种的已知和已注释基因组数量的大幅增加。改进后的基因预测工具，加上显著扩展且注释良好的基因、蛋白质和基因组数据库，已经推动基因组注释从单纯的 gene prediction（基因预测）转向一种更加 integrated、holistic（整合性、整体性）的方法：这种方法结合多条证据线索来定位、识别并在功能上注释基因。当这些证据再与 RNA-seq 数据或蛋白质序列数据（来自结构蛋白质组学或基于表达的蛋白质组学）等实验数据结合时，就有可能获得非常准确且相当完整的注释。这种对证据的综合融合，是许多新近开发的 semi-automated 或 automated genome annotation pipelines（半自动化或自动化基因组注释流水线），以及许多较新的 genome browsers 和 editors 的基础。

然而，并非所有基因组注释工作都能产生同等数量或同等质量的信息。可以肯定的是，原核基因组注释比真核基因组注释更快、更容易，也准确得多。事实上，原核基因组注释的挑战基本上已经是一个“已解决的问题”，而真核基因组注释的挑战则必须被视为一个“仍在推进中的工作”。

<!-- END LEGACY FRAGMENT: 18_Summary -->

<!-- BEGIN SUPPLEMENTAL BACK MATTER: PDF pages 166-173 -->

致谢

作者感谢 Andy Baxevanis 和 Roderic Guigó 提供有益评论，并感谢他们允许使用本书前几版中的相关材料。

网络资源

Ab Initio 原核基因预测器

• EasyGene（server）：www.cbs.dtu.dk/services/EasyGene
• GeneMark.hmm（server）：opal.biology.gatech.edu/GeneMark/gmhmmp.cgi
• GeneMarkS（server）：opal.biology.gatech.edu/GeneMark/genemarks.cgi
• GLIMMER（program）：www.cs.jhu.edu/~genomics/Glimmer
• Prodigal（program）：github.com/hyattpd/Prodigal

Ab Initio 真核基因预测器

-%20GeneID%EF%BC%88server%EF%BC%89%EF%BC%9Agenome.crg.es/geneid.html

• GeneMark-ES（program）：opal.biology.gatech.edu/GeneMark
• GeneZilla（program）：www.genezilla.org

-%20GenomeScan%EF%BC%88server%EF%BC%89%EF%BC%9Ahollywood.mit.edu/genomescan.html

-%20GENSCAN%EF%BC%88server%EF%BC%89%EF%BC%9Ahollywood.mit.edu/GENSCAN.html

• HMMgene（server）：www.cbs.dtu.dk/services/HMMgene

-%20SNAP%EF%BC%88program%EF%BC%89%EF%BC%9Akorflab.ucdavis.edu/software.html

Hybrid / Extrinsic 真核基因查找器

• AUGUSTUS（server）：bioinf.uni-greifswald.de/augustus
• AUGUSTUS-PPX（program）：bioinf.uni-greifswald.de/augustus
• CONTRAST（program）：contra.stanford.edu/contrast
• GeneID（server）：genome.crg.es/software/geneid
• GeneWise（server）：www.ebi.ac.uk/Tools/psa/genewise
• GenomeThreader（program）：genomethreader.org
• GSNAP（program）：research-pub.gene.com/gmap
• mGENE（program）：www.mgene.org
• Mugsy-Annotator（program）：mugsy.sourceforge.net
• SGP-2（program）：genome.crg.es/software/sgp2
• STAR（program）：code.google.com/archive/p/rna-star
• Transomics（program）：linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=transomics

tRNA 和 rRNA 查找工具

• Rfam（server）：rfam.xfam.org
• RNAmmer（server）：www.cbs.dtu.dk/services/RNAmmer

-%20RNAMotif%EF%BC%88program%EF%BC%89%EF%BC%9Acasegroup.rutgers.edu/casegr-sh-2.5.html

• tRNAdb（server）：trnadb.bioinf.uni-leipzig.de/DataOutput/Welcome
• tRNADB-CE（server）：trna.ie.niigata-u.ac.jp/cgi-bin/trnadb/index.cgi
• tRNAfinder（server）：ei4web.yz.yamagata-u.ac.jp/~kinouchi/tRNAfinder
• tRNAscan-SE（server）：lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE

噬菌体查找工具

• Phage_Finder（program）：phage-finder.sourceforge.net
• PHAST（server）：phast.wishartlab.com
• PHASTER（server）：phaster.ca

重复序列查找 / 遮蔽工具

• Dfam（server）：www.dfam.org
• LTR_FINDER（server）：tlife.fudan.edu.cn/tlife/ltr_finder

-%20LTRharvest%EF%BC%88program%EF%BC%89%EF%BC%9Agenometools.org/index.html

-%20MITE-Hunter%EF%BC%88program%EF%BC%89%EF%BC%9Atarget.iplantcollaborative.org/mite_hunter.html

• Repbase（server）：www.girinst.org/repbase
• RepeatMasker（program）：www.repeatmasker.org
• RepeatScout（program）：bix.ucsd.edu/repeatscout

-%20RetroPred%EF%BC%88program%EF%BC%89%EF%BC%9Awww.juit.ac.in/attachments/RetroPred/home.html

原核基因组注释流水线

• BASys（server）：www.basys.ca
• Prokka（program）：www.vicbioinformatics.com/software.prokka.shtml
• RAST（server/program）：rast.nmpdr.org

真核基因组注释流水线

• BRAKER1（program）：bioinf.uni-greifswald.de/bioinf/braker
• EVM（program）：evidencemodeler.github.io
• JIGSAW（program）：www.cbcb.umd.edu/software/jigsaw

-%20MAKER2%EF%BC%88program%EF%BC%89%EF%BC%9Awww.yandell-lab.org/software/maker.html

• PASA（program）：github.com/PASApipeline/PASApipeline/wiki

基因组浏览器和 / 或编辑器

• Artemis（program）：www.sanger.ac.uk/science/tools/artemis

-%20Ensembl%EF%BC%88program%EF%BC%89%EF%BC%9Auswest.ensembl.org/downloads.html

• GenomeView（program）：genomeview.org
• JBrowse（program）：jbrowse.org

-%20UCSC%20Genome%20Browser%EF%BC%9Ahgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html

• Web Apollo（program）：genomearchitect.github.io

延伸阅读

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一篇非常易读的文章，评估了原核基因预测和基因组注释。

Yandell, M. and Ence, D. (2012). A beginner’s guide to eukaryotic genome annotation. Nat. Rev. Genet. 13, 329–342.

一篇优秀、易读的入门文章，介绍真核基因组注释涉及的流程，并对可用计算工具和最佳实践作了有用说明。

Yoon, B. (2009). Hidden Markov models and their applications in biological sequence analysis. Curr. Genomics 10, 402–415.

一篇关于 HMM 的综合教程，提供了许多有用示例，并解释不同 HMM 如何构建，以及如何用于基因预测和基因序列分析。

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> 以下参考文献题录按原文保留，不翻译。

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第6章 使用RNA序列的预测方法

作者：Michael F. Sloma, Michael Zuker, David H. Mathews

引言

RNA是一种多功能生物聚合物，其功能远超简单携带和识别遗传信息——分别作为信使RNA（mRNA）和转运RNA（tRNA）。几十年来，学界已知RNA序列可以催化RNA的切割和连接反应（Doudna and Cech 2002），并且RNA是信号识别颗粒（signal recognition particle, SRP）（Walter and Blobel 1982）的重要组成部分，负责指导蛋白质向细胞外转运。最近，研究人员又发现了RNA的更多功能。核糖体RNA（rRNA）在蛋白质合成过程中催化肽键形成（Nissen et al. 2000; Hansen et al. 2002），小核RNA（snRNA）和自剪接内含子催化pre-mRNA的剪接反应，微RNA（miRNA）和小干扰RNA（siRNA）通过结合mRNA来调控基因表达，而mRNA则通过名为核糖开关（riboswitch）的RNA结构结合代谢物来自我调控表达。RNA还在其他关键过程中发挥作用，包括发育调控（Lagos-Quintana et al. 2001; Lau et al. 2001）和免疫系统（Cullen 2002）。此外，RNA还可以在体外被进化以催化自然界中不发生的反应（Bittker et al. 2002）。

RNA也是制药行业的重要靶点和工具。在核糖体中，RNA是多种抗生素的作用靶点。mRNA是反义原理药物（Dias and Stein 2002）或RNA干扰（RNA interference, RNAi）药物的作用靶点（Cossarizzo and Rossi 2009）。近期研究表明，RNA可以被小分子特异性靶向（Disney et al. 2016）。

要充分理解某种RNA的作用机制或对其进行靶向研究，需要了解所研究RNA的结构。RNA结构具有三个层次的组织方式（如图6.1所示，Tinoco and Bustamante 1999）。第一层——一级结构（primary structure）（图6.1a）——即RNA分子中核苷酸的线性序列。二级结构（secondary structure）（图6.1b）由RNA聚合物内部发生的碱基配对相互作用（包括沃森-克里克配对和G-U配对）所定义。最后，三级结构（tertiary structure）（图6.1c）是RNA序列中原子的三维排列，因此包含所有非经典接触。

通常，RNA序列的二级结构先于其三级结构被解析，这是因为目前已有精确的实验和计算方法来确定RNA序列的二级结构，且了解二级结构往往有助于设计三级结构解析的构建体。如图6.2所示，典型的RNA二级结构由螺旋区和环区组成。螺旋区由经典碱基配对构成。环区有多种形式，取决于闭合碱基对的数量和未配对核苷酸的分布。环区可以是发夹环（hairpin loop，骨干做180°弯折）、内部环（internal loop，两个未配对核苷酸链中断一个螺旋）、凸出环（bulge loop，单个未配对核苷酸链中断一个螺旋）以及多分支环（multibranch loop，亦称螺旋连接点，helical junction，意为有两个以上螺旋从中伸出）。尽管二级结构图通常不明确显示环区中的核苷酸相互作用，但这些区域负责形成稳定结构的非经典相互作用。

在没有三级结构的情况下，预测环和螺旋位置的"金标准"是比较序列分析（comparative sequence analysis），即利用序列比对中发现的进化证据来确定碱基配对（Pace et al. 1999）（关于多重序列比对方法的信息另见第8章）。通过比较序列分析预测的大亚基（LSU）和小亚基（SSU）rRNA碱基对，与高分辨率晶体结构相比，准确率达到97%（Gutell et al. 2002）。

RNA结构预测是一个庞大的领域，目前已有数百种计算工具可用于预测RNA分子的结构。本章介绍一些基于序列推断RNA二级结构的最常用方法。此外，本章还介绍可提高结构预测准确性的方法，包括寻找多个同源序列共有结构的方法，以及利用实验数据的方法。为此，本章将介绍RNA折叠热力学和动态规划算法。详细描述两种常用的RNA二级结构预测网络服务器——Mfold和RNAstructure，并提及其他替代软件工具。本章最后简要介绍用于RNA三级结构预测的方法，并为有兴趣深入了解的读者提供更多资源。

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图6.1说明（原文图注）：

> RNA结构三个层次组织的示意图。（a）一级序列，（b）二级结构（Cannone et al. 2002），以及（c）四膜虫（Tetrahymena）I组内含子结构域的三级结构（Cate et al. 1996）。二级结构展示了经典碱基配对，三级结构捕捉了原子的三维排列。经AAAS授权转载。

图6.2说明（原文图注）：

> 果蝇（Drosophila）sucinea R2元件3'非翻译区的RNA二级结构（Lathe and Eickbush 1997; Mathews et al. 1997）。非螺旋区（称为环）中的碱基配对按环的类型着色并标注。

第6章 利用 RNA 序列的预测方法

6.2 基于热力学的 RNA 二级结构预测概述

许多 RNA 二级结构预测方法都依赖于最近邻模型（nearest neighbor model）来预测 RNA 二级结构的稳定性，以 37°C 时的吉布斯自由能变化（ΔG°37）来衡量（见 Box 6.1）（Xia et al. 1998, 1999; Mathews et al. 1999a, 2004; Turner 2000; Turner and Mathews 2010）。预测稳定性的规则采用最近邻模型，是因为每个碱基对的稳定性仅取决于与其最相邻的碱基对，而总自由能是各个贡献之和。关于从实验数据测定最近邻参数的方法，已有详尽的综述可供参考（Schroeder and Turner 2009; Andronescu et al. 2014）。

Box 6.1 吉布斯自由能

RNA 结构的形成吉布斯自由能（ΔG°）量化了该结构在特定温度下的平衡稳定性。例如，考虑一种 RNA 结构 A，它与无规卷曲（random coil，即无规整结构）构象处于平衡状态（图 6.3a）。每种构象的相对浓度由平衡常数 Keq 决定。Keq 与吉布斯自由能的关系为：

$$K_{\text{eq}} = \frac{[\text{Conformation A}]}{[\text{Random coil}]} = e^{-\Delta G^\circ / RT} \quad (6.1)$$

其中 R 为气体常数（1.987 cal mol⁻¹ K⁻¹），T 为绝对温度（单位为开尔文）。

此外，对于多种可供选择的构象 A 和 B，它们与无规卷曲之间存在构象的平衡分布（图 6.3b），K′eq 描述了链在各结构之间的分布。在这种情况下，每种构象相对于无规卷曲的自由能同样可以描述各构象的占比：

$$K'_{\text{eq}} = \frac{[\text{Conformation A}]}{[\text{Conformation B}]} = e^{-(\Delta G^\circ_A - \Delta G^\circ_B) / RT} \quad (6.2)$$

这一关系可以推广到任意数量的构象。因此，在平衡状态下，具有最低自由能的构象是 RNA 分子最可能的构象，这通常被称为最小自由能结构（minimum free energy structure）。

自由能的单位通常用焦耳每摩尔（J mol⁻¹，SI 单位）表示。但在 RNA 折叠稳定性的研究中，常用的仍是千卡每摩尔（kcal mol⁻¹），其中 1 cal = 4.184 J。在 37°C（人体温度；310.15 K）时，吉布斯自由能变化相差 1.42 kcal mol⁻¹会使平衡常数改变 10 倍，这可通过在式 (6.2) 中代入 ΔG°A − ΔG°B = 1.42 kcal mol⁻¹ 来验证。

图 6.3 溶液中 RNA 结构平衡的示意图

(a) 构象 A 与无规卷曲结构之间的平衡。Keq 与 37°C 时标准态自由能变化 ΔG°37 相关，描述了这一平衡。(b) 两种构象 A 和 B 与无规卷曲之间的平衡。K′eq 与 A 和 B 两种构象的折叠自由能相关，描述了构象 A 与构象 B 之间的比例。

图 6.4 展示了一个最近邻稳定性计算的示例。螺旋堆叠（helical stacking）、环起始（loop initiation）和未配对核苷酸堆叠（unpaired nucleotide stacking）的贡献加合在一起，构成总构象自由能。有利的自由能增量始终为负值。碱基对自由能增量以相邻碱基对的堆叠形式计算。例如，连续的 CG 碱基对贡献 −3.3 kcal mol⁻¹（Xia et al. 1998）。请注意，环区域具有不利的自由能增量，称为环起始能（loop initiation energy），这主要反映了限制环中核苷酸的熵代价。例如，四核苷酸发夹环的起始自由能变化为 5.6 kcal mol⁻¹（Mathews et al. 2004）。环中未配对的核苷酸可以作为堆叠核苷酸或错配对提供有利的能量增量。图 6.4 中所示的 3′ 末端的 G 称为悬末端（dangling end），它堆叠在末端碱基对上，贡献 −1.3 kcal mol⁻¹ 的稳定性。发夹环中与该序列环境对应的第一个错配贡献 −1.1 kcal mol⁻¹ 的稳定性。

图 6.4 RNA 序列 CCUUGAGGAACACCAAAGGGG 某一构象的自由能预测

各自由能增量的贡献已标注。总自由能是各增量之和。对于这一估计的稳定性 −5.2 kcal mol⁻¹，每一条折叠链对应约 4600 条未折叠链（Keq = 4600；见 Box 6.1）。

最近邻自由能参数利用序列依赖项来预测环区域的自由能增量（Mathews et al. 1999a），以反映实验观察结果。例如，2×2 内部环（internal loop，两侧各有 2 个未配对核苷酸的内部环）的稳定性可从 −2.6 到 +2.8 kcal mol⁻¹ 不等，取决于闭合对（closing pair）和错配的序列（Schroeder et al. 1999）。

具有最低 ΔG° 的结构是在平衡状态下最可能的结构，但这并不能说明结构平衡的全部。另一个有用的量——配分函数（partition function）Q，通过对每种构象的平衡常数求和，提供了 RNA 分子结构ensemble（S，即 RNA 分子可能采取的所有结构的集合）的描述：

$$Q = \sum_{s} e^{-\Delta G^\circ / RT} \quad (6.3)$$

配分函数可用于计算 ensemble 中 RNA 分子采取构象 A 的概率：

$$P(A) = \frac{e^{-\Delta G^\circ_A / RT}}{Q} \quad (6.4)$$

在预测结构时，具有最低 ΔG° 的结构可能具有较低的单独概率。然而，许多低自由能结构可能包含相同的碱基对，因此这些碱基对具有很高的形成概率。RNA 结构中特定碱基对形成的概率由下式给出：

$$P(i \text{ 与 } j \text{ 配对}) = \frac{1}{Q} \sum_{s' \in s_{ij}} e^{-\Delta G^\circ_{s'} / RT} \quad (6.5)$$

其中 sij 是核苷酸 i 与核苷酸 j 配对的所有结构的集合。

配分函数是许多计算方法研究 RNA 结构的基础，包括：识别多条序列的共同结构的方法（Harmanci et al. 2011; Will et al. 2012）、识别改变 RNA 结构的突变的方法（Halvorsen et al. 2010; Sabarinathan et al. 2013; Salari et al. 2013），以及估计寡核苷酸结合可及性的方法（Lu and Mathews 2007; Tafer et al. 2008）。

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术语表

第6章 利用 RNA 序列的预测方法

6.3 动态规划（Dynamic Programming）

上一节已经介绍了 RNA 二级结构预测所依赖的热力学规则。但要真正使用这些规则，还需要在巨大的候选结构空间中完成搜索：要么找出得分最优的结构，要么计算每一种可能构象的平衡常数。那么，这个搜索究竟如何实现呢？

一种最直接、也最朴素的方法，是把所有可能的构象全部显式生成出来，逐个计算其自由能，再从中选出自由能最低、也就是得分最优的那个结构。

但这种方法在计算上几乎不可行。已有估计认为，长度为 \(N\) 的 RNA 序列，其可能的二级结构数量约为 \((1.8)^N\)（Zuker and Sankoff 1984）。对于一个只有 100 个核苷酸的中等长度序列，这意味着大约有 \(3 imes 10^{25}\) 个候选结构。即使使用一台高速计算机，每秒能够计算 10000 个结构的自由能，也仍然需要约 \(1.6 imes 10^{14}\) 年才能完成搜索。显然，这样规模的问题必须采用更高效的求解策略。

最常用的解决方案就是动态规划（dynamic programming）。它通过递归（recursion）与中间结果列表化/表格化保存（tabulation of intermediate results）的方式加速计算（Nussinov and Jacobson 1980; Zuker and Stiegler 1981）。附录 6.A 为有兴趣的读者详细介绍了这种方法。对于不包含伪结（pseudoknot）的情况，动态规划不仅能比暴力穷举快得多地求出最小自由能结构（minimum free energy structure），也能更高效地计算配分函数（partition function）。其渐近复杂度为：时间复杂度 \(O(N^3)\)，空间复杂度 \(O(N^2)\)，其中 \(N\) 为序列长度（见 Box 6.2）。

本节还引入了一个重要例外：伪结（pseudoknot）。图 6.5 展示了一个简单的 H 型 RNA 伪结。若两对碱基分别为 \(i\)–\(j\) 和 \(i'\)–\(j'\)，并满足 \(i < i' < j < j'\)，则说明出现了非嵌套碱基配对，这类结构就是伪结。碱基对 \(i\)–\(j\) 定义了一个封闭区域，而 \(i'\)–\(j'\) 则跨越该封闭区域和相邻区域，从而形成伪结。

图 6.5 一个简单的 RNA 伪结

本图用两种表示方式展示了同一个简单的 H 型伪结。伪结由两对碱基定义：\(i\)–\(j\) 与 \(i'\)–\(j'\)，其顺序满足 \(i < i' < j < j'\)。其中 \(i\)–\(j\) 围成一个封闭区域，而 \(i'\)–\(j'\) 横跨该封闭区域及其相邻区域，构成伪结。

长期以来，人们曾认为伪结无法用多项式时间的动态规划算法来预测。直到 Rivas and Eddy（1999）提出了一种多项式时间的动态规划算法，才证明至少某一类足够丰富、具有实际意义的伪结可以被计算预测。然而，这一算法的时间复杂度为 \(O(N^6)\)，空间复杂度为 \(O(N^4)\)，因此对于长度超过约 300 个核苷酸的序列，在实际中往往难以使用（Rivas and Eddy 1999; Condon et al. 2004）。后续对该算法的改进虽改善了伸缩性，但在可处理的序列长度上仍存在显著限制（Reeder and Giegerich 2004）。类似地，包含伪结的配分函数算法（Dirks and Pierce 2003）具有 \(O(N^5)\) 的时间复杂度与 \(O(N^4)\) 的空间复杂度，因此通常也只适用于长度不超过 200 个核苷酸的序列。

Box 6.2 算法复杂度（Algorithm Complexity）

在计算机科学中，算法复杂度用于描述一种计算在最坏情况下如何随问题规模增长。它通常使用 big-O notation 表示，读作 “order”。若算法的时间复杂度为 \(O(N)\)，说明输入规模参数 \(N\) 增大时，计算时间按线性增长；\(O(N^2)\) 与 \(O(N^3)\) 则分别表示按平方和立方增长。

因此，RNA 二级结构预测中的动态规划算法，时间复杂度为 \(O(N^3)\)。这里的 \(N\) 是核苷酸数目。这意味着当序列长度加倍时，执行时间大约会增加 8 倍。与之相比，像排序列表这类任务通常可在 \(O(N \log N)\) 时间内完成，因此 RNA 折叠的动态规划计算可算是代价较高的一类计算。

big-O 记号同样也适用于算法内存消耗（也称 storage）的缩放规律。二级结构预测需要大小为 \(N imes N\) 的二维数组，因此其空间复杂度为 \(O(N^2)\)。

动态规划算法的某些变体不仅能够求得最小自由能结构（Mathews et al. 1999a; Wuchty et al. 1999），还可以在只增加一个常数因子的时间和内存代价下，预测自由能高于最优结构的其他候选结构。这些结构称为次优结构（suboptimal structures）（Zuker 1989）。对于真实 RNA 结构而言，次优结构往往提供了重要的替代假设：一方面，最近邻参数本身并不完美；另一方面，若在建模时忽略了伪结等结构基序，那么某个次优结构反而可能比最小自由能结构更接近真实情况。

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术语表

Ch6 Section 4: Accuracy of RNA Secondary Structure Prediction

Accuracy of RNA Secondary Structure Prediction

RNA 二级结构预测的准确度可以通过对已知二级结构的 RNA 序列进行预测来评估。对于一组用于测试预测准确度的结构集合（包括 SSU rRNA [Cannone et al. 2002]、LSU rRNA [Cannone et al. 2002]、5S rRNA [Szymanski et al. 2000]、Group I 内含子 [Cannone et al. 2002]、Group II 内含子 [Michel et al. 1989]、RNase P RNA [Brown 1999]、SRP RNA [Larsen et al. 1998] 和 tRNA [Sprinzl et al. 1998]），已知结构中的碱基对平均有 73% 被正确预测（Mathews et al. 2004）。在这些计算中，SSU 和 LSU rRNA 根据已知二级结构被划分为长度小于 700 个核苷酸的区域（Mathews et al. 1999a）。虽然这一准确度水平足以对感兴趣的结构提出假设，但通常期望获得更准确的预测。提高二级结构预测准确度有两种通用方法，两者都试图减少搜索步骤中被考虑的不正确结构数量。一种方法是使用低分辨率的实验数据（Sloma and Mathews 2015），另一种方法是预测多个同源序列的共同结构（Seetin and Mathews 2012a）。

Experimental Methods to Refine Secondary Structure Prediction

低分辨率实验方法使用酶切或化学修饰试剂，这些试剂优先与双链或单链核苷酸反应。检测每个位置的化学反应性可以识别哪些核苷酸位于茎区、哪些位于环区，但不提供双链核苷酸的配对伙伴信息。常用的实验试剂包括 RNAse V1（在双链区域切割 RNA 分子）、RNAse T1（在未配对的鸟嘌呤核苷酸之后切割 RNA 分子）和 RNase T2（在任何类型的未配对核苷酸之后切割）、二甲硫酸（修饰未配对的腺嘌呤和胞嘧啶核苷酸），以及选择性 2'-羟基酰化并通过引物延伸分析（SHAPE）试剂，这是一组可修饰任何未配对核苷酸的化学物质。近年来的进展使这些方法能够与大规模平行测序结合，同时探测活细胞内多种不同 RNA 分子的二级结构（Spitale et al. 2013; Ding et al. 2014; Rouskin et al. 2014; Talkish et al. 2014）。

这些实验信息可以通过两种方式应用于 RNA 二级结构预测算法。一种方法是在动态规划算法的搜索步骤中禁止考虑任何与实验数据不一致的结构。这通常可以显著提高在没有实验数据约束时预测较差的序列的准确度。例如，对于大肠杆菌（Escherichia coli）的 5S rRNA 序列（在没有实验约束时预测效果较差），使用酶切数据可将准确度从 26% 提高到 87%（Speek and Lind 1982; Mathews et al. 1999a; Szymanski et al. 2000）。

另一种将实验数据应用于改进预测的方法是给不完全匹配数据的结构分配伪自由能惩罚，而不是完全禁止它们。这种方法是有用的，因为虽然对酶或化学探针的反应性与单链性密切相关，但某些双链核苷酸仍然可能具有高反应性（Sukosd et al. 2013）。在这些情况下，使用软约束（只惩罚不一致的结构而不是禁止）可以预测与数据"基本一致"的结构。这种方法最初用于 SHAPE（Deigan et al. 2009），也已应用于二甲硫酸修饰（Cordero et al. 2012）和酶切（Underwood et al. 2010）实验数据。

Ch6 Section 5: Predicting the Secondary Structure Common to Multiple RNA Sequences

Predicting the Secondary Structure Common to Multiple RNA Sequences

改进 RNA 二级结构预测的另一条路径，是利用进化所提供的信息。不同生物中执行相同功能的同源 RNA 分子，即使其序列已经发生了相当大的分化，通常仍会形成相似的结构。尤其是补偿性突变（compensatory mutations）——即某个位点的突变原本会破坏一个碱基对，但其配对伙伴位点再发生第二次突变后又恢复配对——是某个碱基对真实存在的强有力证据。算法可以通过两种方式自动利用这类信息：一是将搜索空间限制为所有同源序列都能采取的结构；二是对包含补偿性突变的结构赋予更高权重。

比较序列分析（comparative sequence analysis）的基础，是根据物种间的序列差异，或体外进化（in vitro evolution）得到的序列差异，来检测保守结构（conserved structure）（Pace et al. 1999）。假定二级结构是保守的，就可以排除许多单条序列在理论上可能形成、但跨进化序列集合不可能共同采用的二级结构。换句话说，多条序列会对可能的二级结构施加约束。这些约束也可以作为二级结构预测的辅助信息。人工进行比较序列分析时，准确度可以非常高；例如，对 rRNA 推断出的碱基对中，超过 97% 在后来解析出的晶体结构中都得到了验证（Gutell et al. 2002）。不过，这种方法需要相当高的技能和大量投入。自动化这些比较分析的计算机算法，目前总体上仍不如长期迭代修正模型的人工比较分析准确。

整合多序列信息的 RNA 二级结构预测算法，大体可以分成两类：一类依赖初始序列比对（initial sequence alignment）的约束，另一类则不依赖。总体而言，受初始比对约束的方法由于受限于比对本身的质量，鲁棒性往往稍差，但计算速度更快。

Algorithms That Are Constrained by an Initial Alignment

已经有若干程序被开发出来，用于寻找一组已对齐序列所共有的二级结构（Lück et al. 1996, 1999; Juan and Wilson 1999; Hofacker et al. 2002）。其中一种常用方法叫作 Alifold，它利用序列比对结果来约束二级结构预测，既可用于自由能最小化，也可用于约束配分函数（partition function）的计算（Hofacker et al. 2002; Bernhart et al. 2008）。该方法会在构象自由能（conformation free energy）中加入额外能量项，以偏好补偿性碱基替换和序列保守性。这个程序既可作为 Vienna RNA Package（Lorenz et al. 2011）的一部分使用，也提供 web server 版本。

另一种寻找多序列共同结构的方法叫作 Pfold，它采用随机上下文无关文法（stochastic context-free grammar, SCFG）（Knudsen and Hein 1999）。这种文法定义了一组规则，用于同时生成序列及其对应的二级结构。这些规则以概率参数的形式编码，并根据序列比对结果以及一批 tRNA 和 LSU rRNA 的已知共同二级结构进行估计。这些已知序列和结构构成训练集（training set）。随后，给定序列可通过动态规划算法进行折叠，从而找到一个在该随机上下文无关文法下生成概率最大的结构。

Algorithms That Are Not Constrained by the Initial Alignment

动态规划也可以用来同时预测多条 RNA 序列的序列比对和共同二级结构（Sankoff 1985）。一般来说，这类方法的时间复杂度为 O(N1^3N2^3N3^3…)，其中 N1 是第一条序列的长度，N2 是第二条序列的长度，依此类推，因此在计算上几乎不可行。基于这一思想的两个程序是 FoldAlign（Havgaard et al. 2005）和 Dynalign（Mathews and Turner 2002; Fu et al. 2014）。由于运行耗时很长，这些程序通常只适用于两条序列；不过，两者后来都通过成对计算（pairwise calculations）扩展到了多于两条序列的情形（Torarinsson et al. 2007; Xu and Mathews 2011）。当待分析序列彼此差异很大时，这些程序往往是更合适的选择。

另一种不依赖输入比对的思路，是先分别折叠这些序列，再对序列进行比对，最后整合这些信息以预测保守二级结构。采取这种策略的现代工具包括 LocARNA（Will et al. 2007, 2012）、PARTS（Harmanci et al. 2008, 2009）和 TurboFold（Harmanci et al. 2011）。这些程序比 Dynalign 和 FoldAlign 更快，但它们通常要求更高的序列一致性（sequence identity）才能取得较好效果.

Ch6 第6节：单序列方法实践简介

简介

在不依赖输入比对的前提下预测 RNA 二级结构，还有一种替代方法，即先将序列折叠、再比对序列，然后将折叠与比对信息相结合来预测保守二级结构。采取这一策略的三个现代工具是 LocARNA（Will et al. 2007, 2012）、PARTS（Harmanci et al. 2008, 2009）和 TurboFold（Harmanci et al. 2011）。这些程序比 Dynalign 和 FoldAlign 更快，但对序列一致性要求更高。

使用 Mfold 网络服务器

本节介绍两个网络服务器：Mfold 网络服务器和 RNAstructure 网络服务器。两者对单序列的结构预测精度相近，用户可根据所需功能选择使用。Mfold 服务器还提供了一个界面，可用于模拟双分子复合物的熔解（解链）过程（Dimitrov and Zuker 2004）。RNAstructure 网络服务器则额外提供了多同源序列保守二级结构预测、siRNA 设计以及双分子结构预测等功能（Bellaousov et al. 2013）。

Mfold 是一个 RNA 二级结构预测软件包，同时提供网络服务器和可在 Unix/Linux 机器上编译运行的代码（Mathews et al. 1999a; Zuker 2003）。它使用一套 37°C 下的最近邻自由能参数（Mathews et al. 1999a）。程序预测最小自由能结构，以及以启发式方式生成的次优二级结构（Zuker 1989）。次优结构代表了与最低自由能结构不同的替代构象，反映了 RNA 序列可能具有多种结构（Schultes and Bartel 2000）以及能量规则本身存在一定不确定性的事实（Mathews et al. 1999a; Layton and Bundschuh 2005; Zuber et al. 2017）。Mfold 还可预测能量点图（energy dot plots），该图展示了每一种可能的配对在最低自由能构象中对应的能量（Zuker and Jacobson 1995）。这些点图可以直观地展示用户指定增量范围内所有可能的配对，而预测的结构可被着色标注，以展示在该结构中有多种折叠替代方案的区域（Zuker and Jacobson 1998）。

Figure 6.6 分别展示了 Mfold 服务器输入表单的顶部和底部。用户可在标有"Enter sequence name"的框中输入序列名称，并将待折叠的序列输入（或从剪贴板粘贴）到下方标有"Enter the sequence to be folded"的框中。正如说明文字所示，非字母字符会被忽略且不影响序列解读。例如，图中的表单显示了一条名为 RD1140 的 tRNA 序列（Sprüinzl et al. 1998）已粘贴到序列框中。表单其余部分使用默认值，高级用户可自行修改。接下来的一个选项框提供了利用辅助证据来约束结构预测的功能，这些证据来源于酶切实验（Knapp 1989）、比较序列分析（Pace et al. 1999）或生物学直觉。此外，默认使用线性 RNA 序列折叠，但也可通过将选项从"linear"改为"circular"来折叠环形序列。需要注意的是，当前参数下的折叠温度固定为 37°C。一套较旧的、较不完整的参数可支持在其他温度下进行二级结构预测（Jaeger et al. 1989），但建议在大多数应用中使用当前参数。如需使用旧参数进行折叠，可通过页面顶部的链接访问 RNA mfold version 2.3 服务器（图 6.6 中未显示）。"Percent suboptimality"数值（默认为 5）是指生成次优二级结构时，允许其自由能与最低自由能结构之间的最大百分比差值。"Upper bound on the computed foldings"的限制值（默认为 50）是预测的次优二级结构的最大数量。"Window"参数控制每个次优结构之间必须有多少差异。该值默认为基于序列长度的数值，可通过点击"Window"链接查看。例如，本例中使用的 tRNA 长度为 77 个核苷酸，默认窗口值为 2。窗口值越小，允许的次优结构越多；窗口值越大，则各预测结构之间的差异要求越大。允许的最小窗口值为零。内环（bulge）或内部环（internal loop）中未配对核苷酸的最大数量默认为 30。内部环的不对称性最大值（即每条链上未配对核苷酸长度的差值）也默认为 30。允许的配对核苷酸之间的最大距离设置为"no limit"。这些数值均可由高级用户修改。

其余选项用于控制服务器输出。目前，长度不超过 800 个核苷酸的序列可在较短时间内完成折叠，作为即时任务处理。较长的序列必须作为批处理任务运行，需要将默认选项从"An immediate"改为"A batch job"。批处理任务还需用户输入电子邮件地址，以便在计算完成后接收通知。本例中的 tRNA 长度较短，因此使用默认的"An immediate job"选项。其余选项用于控制服务器生成输出的方式，每个选项都附有说明网页的链接。点击 Fold RNA 按钮开始计算。

Figure 6.7 展示了 Mfold 服务器对 RD1140 tRNA 二级结构预测的输出页面。计算结果在服务器上保留 24 小时。第一个窗口显示带有核苷酸位置编号的序列。每种预测二级结构可以多种格式的图示提供。本例中，使用次优二级结构预测的默认参数仅预测出一种结构。Structure 1 旁边的链接提供了常用的格式：PostScript（出版质量的输出格式，见 Figure 6.8a）、PNG 和 JPG（可在用户交互式操作中使用的图像格式）以及 RNAVizCT 和 XRNAss 格式（用于二级结构绘图工具的导出格式，下文有解释）。

能量点图可链接到 Text 格式、Postscript 格式、PNG 格式或 JPG 格式的文件。在点图中，每个点代表 x 轴和 y 轴上标注的两核苷酸之间的一个配对，点的颜色表示包含该配对的结构中的最低能量。能量点图被划分为两个三角形区域。上三角形是包含次优配对在内的能量图，下三角形是最小自由能结构中配对的位置。Text 格式适合使用自定义脚本进行后续分析。Postscript 格式为出版质量输出（见 Figure 6.8b）。PNG 和 JPG 格式均链接到交互式页面，用户可放大特定区域、修改能量增量值和颜色数量，并点击单个配对以确定精确能量。Figure 6.8b 中的能量点图显示，在−29.8 和−30.0 kcal·mol⁻¹ 之间的结构中还存在其他配对，这些结构与最低自由能结构（−30.6 kcal·mol⁻¹）的能量差不到 1 kcal·mol⁻¹。因此，这些配对应被视为最低自由能结构中配对的可能替代方案。

此外还提供 RNAML 格式的输出文件，用于与其他符合 RNAML 标准的程序交换信息。RNAML 是一种 XML 文件格式，旨在最终实现 RNA 分析程序之间的无缝信息交换（Waugh et al. 2002）。

使用 RNAstructure 网络服务器

RNAstructure 是一个用于预测 RNA 二级结构的软件包（Reuter and Mathews 2010; Bellaousov et al. 2013）。除了实现结构预测算法和配分函数之外，RNAstructure 还包含多序列预测、识别 RNA 结构中可及区域以及预测两条 RNA 分子杂交结构的工具。RNAstructure 可通过网络服务器使用，也可下载后在 Windows、Mac OSX 和 Linux 的图形用户界面或命令行中使用。本教程介绍如何使用网络服务器界面；使用可下载程序预测二级结构的详细说明可参见在线帮助文件及其他资料（Mathews et al. 2016; Xu and Mathews 2016）。

RNAstructure 网络服务器的主页提供了多种选项：可从单序列预测二级结构、可预测多同源序列的保守结构、可预测两条相互作用序列的结构，或运行 RNAstructure 包中的特定算法。要预测单序列的结构，选择 Predict a Secondary Structure，这将进入网络服务器的输入表单页面，使用多种方法预测 RNA 结构（Figure 6.9）。与 Mfold 类似，该工具计算输入 RNA 序列的最小自由能结构以及一组选定的次优结构。此外，配分函数被用于计算配对概率，并以此对预测的 RNA 二级结构进行标注，向用户反馈预测结构中哪些部分最可能正确。配对概率较高的碱基对（即配对概率大于 0.9）比低概率的碱基对（即配对概率小于 0.5）更可能正确预测（Mathews 2004）。

RNAstructure 还使用最大期望准确度方法（maximum expected accuracy method）（Lu et al. 2009）生成 RNA 二级结构，该方法直接从配分函数计算的配对概率生成结构，可能比最小自由能结构更准确。此外，还使用 ProbKnot 方法（Bellaousov and Mathews 2010）生成可能含有假结的二级结构。

回到网络服务器的输入表单（Figure 6.9），用户可以上传序列文件，也可以在输入框中输入标题和序列。该框上方还有一个选项可插入示例序列。RNAstructure 输入表单提供的选项与 Mfold 相同，如生成次优结构的数量、最大内部环大小等。另外，用户可以选择折叠温度、选择 gamma 参数（可调整以增加或减少最大期望准确度方法预测的碱基对数量）以及 ShapeKnots 使用的迭代次数和螺旋长度参数。

Figure 6.9 RNAstructure 网络服务器输入表单。（a）表单顶部和（b）表单底部。详见正文说明。

RNAstructure 单序列输出与参数补充

此外，用户还可以选择折叠温度；选择 gamma parameter，通过调节它可以增加或减少 maximum expected accuracy (MEA) 方法预测出的碱基对数量；以及设置 ShapeKnots 方法使用的迭代次数和螺旋长度。系统给出了适用于多数情形的默认值。

该表单还包含一个选项，允许用户上传文件，根据实验结果对计算施加 constraint 或 restraint。用户既可以使用硬约束（hard constraints）禁止某些配对，也可以提供来自 SHAPE probing experiment 的打分文件，程序会将其转换为 pseudo-free energy changes，从而约束结构预测。这些文件都必须采用特定格式，具体格式见文件格式说明链接。

Figure 6.10 展示了一个示例输出，给出了示例序列的预测结果。该结构同时使用自由能最小化、最大期望准确度预测以及 ProbKnot 方法进行预测。此外，预测得到的二级结构还依据配分函数计算出的概率进行了着色标注：已配对核苷酸标注其配对概率，未配对核苷酸标注其保持未配对的概率。

Figure 6.10 RNAstructure 网络服务器的示例输出，展示了 tRNA RD1140（Sprinzl et al. 1998）的预测最小自由能二级结构。预测的碱基对按其配对概率着色，未配对核苷酸则标注其未配对概率，这些概率均由配分函数计算得到。

第6章 利用 RNA 序列的预测方法

6.7 多序列方法实践简介

使用 RNAstructure 网络服务器预测多条序列的共同结构

当存在序列同源物（homologs）时，RNAstructure 网络服务器还提供了一个界面，可利用多条序列来预测共同二级结构。同源物通常是来自不同物种、但执行相同功能的序列（定义见第 3 章）。它们可以通过基因组中的 synteny 关系找到，也可以通过传统遗传学或生物化学方法获得。

多序列界面可通过在网络服务器主页选择 Predict a Secondary Structure Common to Two Sequences 或 Predict a Secondary Structure Common to Three or More Sequences 进入。若选择“三条或更多序列”的选项，则会进入 Figure 6.11 所示的输入表单，用于借助 Multilign 和 TurboFold 进行结构预测。用户可上传 FASTA 格式文件，或将 FASTA 格式数据直接粘贴到名为 Sequences 的文本框中。该文本框上方还提供了插入示例数据的选项。

Multilign 使用 Dynalign 对成对序列进行共同结构计算（Xu and Mathews 2011）。Multilign 可以预测次优结构，因此其输入表单中包含能量差（energy difference）、最大结构数（maximum number of structures）以及结构窗口大小（structure window size）等选项；这些参数在单序列结构预测中已经见过，因为它们在这里承担相同作用。除控制次优结构外，程序还会考虑次优序列比对，这通过 alignment window size 参数实现。较小的最小比对窗口会生成只有细微变化的次优比对；增大该窗口值后，次优比对之间必须表现出更大的差异。

gap penalty 参数用于让 Dynalign 对序列比对中的插入缺口进行惩罚，其单位为 kcal·mol⁻¹。另外还有两个参数——iterations 和 maxdsvchange——用于调整 Dynalign 计算结果在 Multilign 中传播信息的方式。默认参数对大多数计算都足够适用，而有经验的用户也可以自行修改这些设置（Xu and Mathews 2011）。

对于 TurboFold，用户也可以设置若干选项。由于 TurboFold 会产生一个碱基对概率矩阵，用户需要决定如何利用这些概率来生成结构：可以选择 Maximum Expected Accuracy（Lu et al. 2009）、Pseudoknots（Bellaousov and Mathews 2010; Seetin and Mathews 2012b），或者 Threshold 方法——即使用一个简单的阈值，只保留那些配对概率超过用户指定阈值的碱基对来构建结构（Mathews 2004）。默认选项是最大期望准确度方法，它不会预测假结（pseudoknots）。如果预期序列中存在假结，或者用户希望了解可能的假结情况，则切换到 Pseudoknot 选项会是一个合适选择，因为它使用的是 ProbKnot 方法。

接下来的一组选项用于控制 TurboFold 流程：TurboFoldGamma 选项用于指定在折叠单条序列时，内在信息（intrinsic information）与外在信息（extrinsic information）的相对权重；TurboFold Iterations 选项用于指定每组配对概率要经历多少轮迭代优化。

输入示例数据并选择 Submit Query 后，会得到 Figure 6.12 所示的输出结果，其中会针对每条输入序列分别显示由 Multilign 和 TurboFold 预测得到的结构。这两个程序为二级结构提供了两种替代性假设：当序列两两之间的一致性较低（<50%）时，Multilign 往往更准确；而当两两序列一致性较高（>60%）时，TurboFold 往往更准确。

Figure 6.11 RNAstructure 网络服务器用于多序列预测的输入表单。（a）表单顶部；（b）表单底部。详见正文说明。

Figure 6.12 RNAstructure 网络服务器用于多序列预测的示例输出。该结果可通过点击输入表单（Figure 6.11）中的 “Click here to add example sequences to the box” 获得。

第6章 利用 RNA 序列的预测方法

6.8 研究 RNA 结构的其他计算方法

另一种广泛使用的 RNA 结构预测软件包是 ViennaRNA（Lorenz et al. 2011）。ViennaRNA 提供网络服务器版本和本地命令行工具两种使用方式。ViennaRNA 程序的输入遵循 UNIX 风格，接受标准输入（stdin）数据并将结果输出到标准输出（stdout），便于无缝集成到 UNIX 管道中。除了实现标准的最小自由能和配分函数算法外，ViennaRNA 还提供一套工具，用于预测多条序列的共同结构、绘制结构图、预测两条 RNA 链之间的双链结构（duplex structure），以及设计能够折叠成目标结构的序列。

Sfold 是配分函数计算的一种实现，采用随机采样程序（stochastic sampling procedure）来预测二级结构（Ding and Lawrence 1999, 2001, 2003）。该采样程序保证采得的构象具有真实的统计学权重。Sfold 通过网络界面提供服务。研究表明，Sfold 能够准确预测与反义寡核苷酸靶向相关的无配对区域（Ding and Lawrence 2001）。由于二级结构是通过统计采样生成的，因此在采样构象集合中某核苷酸未配对出现的次数比例，即为其未配对的预测概率。

NUPACK（Zadeh et al. 2010）是一个软件套件（提供网络服务器和可下载包），用于解决逆向折叠问题（inverse folding problem），即 RNA 结构预测的逆问题。NUPACK 不是输入序列来预测结构，而是输入目标结构，尝试找到能够折叠成该结构的序列。由于待搜索的序列空间极其庞大（长度为 N 的序列有 4ᴺ 种可能，例如 100 个核苷酸的 RNA 约有 1.6 × 10⁶⁰ 种可能序列），NUPACK 采用分层分解策略，将结构分解为多个组分，先为每个组分设计序列，再将组分序列组装；如果任何序列组合失败，则重新设计相应组分。寻找优质候选序列的方法是优化集合缺陷（ensemble defect），即通过配分函数计算的一个量，估计序列中有多少碱基正在形成目标结构（Zadeh et al. 2011）。

另一个重要问题是预测两个 RNA 分子是否会相互杂交以及所得双链的结构。该能力的重要应用包括预测 siRNA（Lu and Mathews 2007; Tafer et al. 2008）、miRNA 或 DNA 寡核苷酸的靶点（Mathews et al. 1999b）。最准确的 RNA–RNA 相互作用预测方法需要同时考虑自结构（self-structure）和分子间结构，因为自结构可能阻止第二条序列的结合。多序列折叠的实现工具包括 RNAup（Mückstein et al. 2006）和 RNAplex（Tafer and Hofacker 2008），它们属于 ViennaRNA 软件包的一部分；以及 BiFold（Mathews et al. 1999b）、DuplexFold（Mathews et al. 1999b）和 AccessFold（DiChiacchio et al. 2016），它们是 RNAstructure 的组件。网络服务器可访问 RNAup（通过 ViennaRNA 网络服务器）、BiFold（通过 RNAstructure 网络服务器）和 DuplexFold（通过 RNAstructure 网络服务器）。AccessFold 和 RNAplex 不提供网络服务器版本，但可以下载后在本地运行。

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本节图/表归属说明：

• Figure 6.11、6.12 归属前一节"07_Practical_Introduction_to_Multiple_Sequence_Methods"
• Figure 6.13（本节未直接提及，但为 ViennaRNA/Sfold/NUPACK 工具图示）归属本节
• 本节无专属 Box

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新增术语（暂记入 QA，待批量入库）：

第6章 利用 RNA 序列的预测方法

6.9 方法比较

目前仍没有任何单一程序能够完全取代人工比较序列分析（manual comparative sequence analysis），但若能结合额外信息源，预测准确率可以显著提升。当已有 SHAPE 等实验数据时，基于热力学的单序列预测往往能够给出相当准确的二级结构，对已知碱基配对的正确预测率可达到 90% 甚至更高（Deigan et al. 2009; Cordero et al. 2012; Hajdin et al. 2013）。如果可获得多条同源序列，那么对保守二级结构进行的多序列预测（multiple-sequence prediction），通常比单序列预测更准确（Asai and Hamada 2014; Havgaard and Gorodkin 2014）。

对于那些仅靠一级序列、在不利用二级结构信息时难以可靠比对的序列，Dynalign/Multilign（Fu et al. 2014）、FoldAlign/FoldAlignM（Havgaard et al. 2005）、LocARNA（Will et al. 2007）、RAF（Do et al. 2008）以及 TurboFold（Harmanci et al. 2011）都可用于同时预测二级结构并完成序列比对（Mathews and Turner 2002）。这些程序的平均准确率彼此接近。TurboFold 的运行速度最快；但当序列同一性较低时（平均成对序列一致性低于 35%），Dynalign、FoldAlign、LocARNA 或 RAF 往往可能取得更高的准确率。实际分析时，值得并行使用不止一种软件，以形成对保守结构的多个候选假设。

对于一组序列同一性较高的同源序列（>85%），RNAalifold 也是预测多条同源序列共同保守结构的优秀工具（Bernhart et al. 2008）。它要求输入为多重序列比对（multiple sequence alignment）。像 RNAalifold 这类在多重序列比对中寻找二级结构的方法，更适合作为筛选工具（screening tool）来发现共同的螺旋区（common helices）；这些共同螺旋可作为后续人工修订序列比对时的锚点，从而支持进一步轮次的分析。

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本节要点小结：

• 单一程序尚不能替代人工比较序列分析。
• SHAPE 等实验数据可显著提升单序列预测准确率。
• 多序列预测通常优于单序列预测。
• 低同一性序列更适合结合结构信息进行联合比对与预测。
• RNAalifold 更适用于高同一性同源序列，并常作为筛选共同螺旋的工具。

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新增术语（暂记入 QA，待批量入库）：

第6章 利用 RNA 序列的预测方法

6.10 RNA 三级结构预测

尽管目前已经存在许多能够较准确预测 RNA 二级结构（RNA secondary structure） 的自动化方法，但 RNA 三级结构预测（RNA tertiary structure prediction） 仍然是一个更困难的问题。这是因为，可能的三级结构构象空间远大于可能的二级结构空间，而且目前还没有已知算法能够像二级结构预测那样，对这一构象空间进行同样快速而完整的搜索。

RNA 三级结构预测的先驱方法之一，是在 MC-SYM 软件中实现的（Major et al. 1991, 1993; Parisien and Major 2008）。该方法采用所谓的 fragment assembly 思路：从已知结构中收集核苷酸可能采取的构象，再将这些构象逐步拼装成结构模型。每一个可能的模型都会被保留下来，直到它与某个约束条件发生矛盾；这些约束可来自实验数据、比较分析，或二级结构预测结果。所有彼此兼容模型之间的差异，还可以帮助研究者判断：在已有数据支持下，模型究竟被限定到了多高的精度。

MC-SYM 早期的一个代表性应用，是利用二级结构信息、hydroxyl radical footprinting、photoaffinity cross-linking 和 disulfide cross-linking 等数据，对 hairpin ribozyme 进行建模（Pinard et al. 1999）。后续获得的晶体结构证实，其中一个被预测到的长程 GC pair 确实存在；不过，原先预测的一个 base triple（其中涉及该碱基对中的一个 A）并未在晶体结构中观察到（Rupert and Ferré-D’Amaré 2001）。此后，该算法又与一种扩展型二级结构预测方法 MC-Fold 结合使用；MC-Fold 能预测部分三级相互作用，两者联用后，可以较准确地预测长度可达 100 个核苷酸 的 RNA 分子结构（Parisien and Major 2008）。

另一类 RNA fragment assembly 方法建立在 Rosetta framework 之上（Cheng et al. 2015）；这一框架在蛋白质结构预测中已经取得了显著成功（Simons et al. 1997）。它同样采用片段组装策略，但同时结合了 knowledge-based force field，以便在采样过程中优先探索更接近天然态的构象（native-like conformations）。

另一大类 de novo RNA 三级结构预测方法，是基于物理的 molecular dynamics (MD) simulations。不过，单靠 MD 模拟本身，速度通常远远不足以直接完成结构预测。一次典型的 MD 模拟，即便运行在专用硬件上，也可能需要数周时间，而所能模拟的折叠过程往往只有微秒量级。相比之下，在自然条件下，即使是简单的 RNA 分子，其折叠也常需毫秒级甚至更长时间（Turner 2000）；更复杂的结构则可能需要数秒（Woodson 2000）。

为了弥合这一时间尺度差距，通常可采用两大策略。第一种策略，是根据计算结构预测结果、低分辨率实验数据以及序列比较结果，为模拟过程加入约束条件（Seetin and Mathews 2011; Weinreb et al. 2016）。第二种策略，是采用 coarse-graining，也就是用单个“pseudo-atom”替代真实分子中的多个原子，从而减少体系可采样的自由度数量（Flores and Altman 2010; Krokhotin et al. 2015）。这种做法能够显著加快模拟速度，但代价是最终坐标在原子细节层面的准确度会下降。

对于那些已经存在高分辨率实验结构、且与目标序列高度相关的 RNA，还可以采用另一种预测方法，即 homology modeling。在这种方法中，研究者利用同源分子的已知结构，以及该结构与新序列之间的比对关系，来生成新序列的结构模型；其基本假设是：新结构相对于原同源结构，只会在较小的局部细节上发生偏离。由于只需要在与模板结构高度相似的较小构象空间内进行采样，homology modeling 往往既快又能够达到较高准确度。RNA 的同源建模可通过 ModeRNA 程序实现，并且该程序提供 web server（Rother et al. 2011）。

近年来，一个称为 RNA-PUZZLES 的多团队合作项目，尝试通过一种友好的竞赛形式来评估 RNA 三级结构预测方法的进展（Cruz et al. 2012; Miao et al. 2015）。这是一个 blind RNA structure prediction 竞赛，其设计模式借鉴了蛋白质结构领域著名的 CASP (Critical Assessment of Structure Prediction) 挑战赛（Moult et al. 2016）。RNA-PUZZLES 项目会邀请解决新型 RNA 结构的结构生物学家共享其坐标数据；随后，只将该 RNA 分子的序列提供给计算建模人员，由各团队分别提交自己对该序列将形成何种三维结构的最佳预测。最后，在实验结构正式发表之后，再将这些计算模型与实验结果进行比较，并据此评估预测准确度。

RNA-PUZZLES 前两轮的结果显示，建模者通常已经能够较准确地从序列预测 RNA 分子的整体拓扑（overall topology）。不过，结构细节仍常常预测不准，尤其是 loop regions；这些区域的结构往往由 non-canonical contacts 决定，而这类相互作用目前仍较难可靠预测。因此，若要继续提升 RNA 三级结构预测能力，对 loop 区域的精确建模将是一个关键突破口。

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本节要点小结：

• RNA 三级结构预测比二级结构预测困难得多，主要受限于更庞大的构象空间。
• MC-SYM 通过 fragment assembly 与约束条件相结合来构建三级结构模型。
• MC-Fold 与 MC-SYM 联用，可提升部分 RNA 分子的三级结构预测能力。
• 基于 Rosetta framework 的方法通过 knowledge-based force field 采样天然态样构象。
• MD simulations 可用于 de novo 预测，但速度瓶颈显著。
• coarse-graining 与外部约束是加速或稳定 MD 模拟的重要策略。
• 当存在高质量近缘模板结构时，homology modeling 是高效且较准确的选择。
• RNA-PUZZLES 为 RNA 三级结构预测提供了类似 CASP 的盲测评估平台。
• 当前最薄弱的环节之一，是对 loop regions 及 non-canonical contacts 的准确建模。

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新增术语（暂记入 QA，待批量入库）：

第6章 基于RNA序列的预测方法

第11节 总结与尾部资料

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总结

RNA二级结构可通过动态规划的自由能最小化方法进行预测，单序列平均准确率约为73%（Mathews et al. 2004）。已有多个软件包和网络服务器可完成此计算，包括Mfold、Vienna包和RNAstructure（Hofacker 2003; Zuker 2003; Reuter and Mathews 2010）。利用配分函数计算配对概率有助于识别不确定的碱基对（Mathews 2004）。配分函数还可用于从可能的结构集合中随机采样，Sfold程序即利用此功能预测结构（Ding and Lawrence 2003）。

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178 基于RNA序列的预测方法

有多种方法可通过多条序列和多序列比对来约束二级结构预测。这些方法分为两大类：受限于初始序列比对的算法，以及不受初始比对约束的算法。RNAalifold和Pfold可预测一组比对序列的共同二级结构（Knudsen and Hein 1999; Hofacker et al. 2002）。Dynalign、FoldAlign、LocARNA和TurboFold能够同时预测共同二级结构和序列比对（Havgaard et al. 2005; Will et al. 2007; Harmanci et al. 2011; Fu et al. 2014）。对于长序列或大量同源物的比对，TurboFold和LocARNA实现了提供良好准确度的快速算法。

近年来，一项重要的发展是高通量实验方法用于探测活细胞内的RNA二级结构（Spitale et al. 2013; Ding et al. 2014; Rouskin et al. 2014; Talkish et al. 2014）。这些方法与计算结构预测方法结合使用（Deigan et al. 2009; Hajdin et al. 2013），必将持续促进对RNA结构与功能的新认识。

RNA二级结构预测领域的一个重要需求是改进RNA-RNA相互作用预测方法。AccessFold（DiChiacchio et al. 2016）和RNAup（Muckstein et al. 2006）等工具较其前身有所改进，但仍缺乏足够的准确度来解决许多实际问题。

RNA三级结构预测正在快速改进，但仍然困难。特别是，虽然可以正确建模螺旋区域和分子的整体拓扑结构，但许多原子细节仍不准确。RNA-PUZZLES竞赛为该领域的快速进展提供了持续评估（Cruz et al. 2012; Miao et al. 2015）。

网络资源

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参考文献 179

扩展阅读

Durbin, R., Eddy, S., Krogh, A., and Mitchison, G. (1998). Biological Sequence Analysis. Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids. New York, NY: Cambridge University Press. 本书是序列分析概率模型的优秀入门读物，包括隐马尔可夫模型和随机上下文无关文法。

Gorodkin, J. and Ruzzo, W. L. (eds.) (2014). RNA Sequence, Structure, and Function: Computational and Bioinformatic Methods. New York, NY: Humana Press.

Turner, D. H. and Mathews, D. H. (2009). NNDB: the nearest neighbor parameter database for predicting stability of nucleic acid secondary structure. Nucleic Acids Res. 38: D280–D282. 本文介绍了NNDB，该数据库提供最新的最近邻参数和使用示例。

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参考文献

参考文献题录保留英文原文（见源文）。

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（空白页）

第7章 基于蛋白质序列的预测方法

引言

简言之，DNA 编码生命的指令，而蛋白质则是生命的运作机器。DNA 被转录为 RNA，RNA 再将信息传递到蛋白质的氨基酸序列中。Francis Crick（1958）提出的"分子生物学中心法则"这一简化版本至今仍基本有效，尽管新发现已拓展了我们的视野（Elbarbary et al. 2016）。此外，表观遗传学研究已经表明，染色质所包含的信息远比一维（1D）字母串复杂，表观遗传特征的遗传性对基因表达有着深远影响（Allis and Jenuwein 2016）。然而，一维蛋白质序列最终决定了蛋白质折叠所形成的三维（3D）结构——蛋白质在细胞中的定位、与哪些其他分子相互作用、其生化与生理功能，以及它最终如何被分解并还原为组成单元（Anfinsen 1973）。总而言之，每个蛋白质的功能（或在疾病情况下的功能障碍）都编码在氨基酸序列之中。

中心法则表明，蛋白质的一切信息都可以从其 DNA 序列推断出来——那么，为什么还要分析蛋白质序列呢？事实上，通过计算方法将 DNA 转化为蛋白质序列颇具挑战，而且我们至今仍不完全理解如何根据编码蛋白质的 DNA 来识别其结构。从 DNA 预测转录本则更加困难。幸运的是，许多实验方法（包括蛋白质组学方法）可用于推断蛋白质序列，这将在第 11 章中讨论。

"下一代"DNA 测序技术的出现产生了大量尚未被深入研究的原始序列数据（Martinez and Nelson 2010; Goodwin et al. 2016）。序列积累的速度远远超过了实验生物学家破译其生化特性和生物学功能的能力。已知序列与已知功能的蛋白质数量之间存在"序列-功能鸿沟"（sequence-function gap），这一鸿沟不断扩大，亟需改进的计算方法来从氨基酸序列预测蛋白质的功能。与之类似，蛋白质也存在"序列-结构鸿沟"（sequence–structure gap）：截至本文撰写时，已有 1.8 亿个蛋白质序列可用，但仅确定了约 15 万个不同的蛋白质 3D 结构（Berman et al. 2000; UniProt Consortium 2016）。

确定蛋白质功能的第一步是分析已有的知识。这意味着每个蛋白质都必须与所有其他蛋白质进行比较，这意味着研究蛋白质功能所需的计算时间随序列增长的平方而增长——这对计算生物学和生物信息学是一个巨大的挑战。在下面的各节中，我们将综述一些已证明能够从氨基酸序列成功预测蛋白质结构和功能的方法。

蛋白质一维结构预测

内容提要

蛋白质的 1D 结构可以简单地表示为一串代表天然氨基酸集合的字符——也就是说，信息含量是一维的。关于蛋白质结构的更多细节可见第 12 章，在本章中，我们将专门关注 1D 预测方法。1D 特征预测之所以重要，有两个原因。首先，诸如跨膜螺旋数量、蛋白质无序区域或表面残基等特征通常对蛋白质功能至关重要。如果实验获得的 3D 结构可用，我们可以从 3D 结构推导出 1D 结构，但鉴于上述讨论的序列-结构鸿沟，实验获得的 3D 结构仅占所有已知序列的不到 1%，而 1D 预测可用于今天已知的全部 1.8 亿个蛋白质序列。其次，1D 结构预测被用作后续功能预测章节中描述的大多数方法的输入。这里描述的所有特征均可从 PredictProtein 服务器获取，该服务器如图 7.1 所示，并提供超过 2000 万个蛋白质的预计算数据（Rost et al. 2004; Kajan et al. 2013; Yachdav et al. 2014）。

02 蛋白质一维结构预测

蛋白质的一维（1D）结构，可看作由天然氨基酸字母构成的一串线性符号。虽然蛋白质结构的更多细节将在第 12 章展开，但本节聚焦于一维特征预测（one-dimensional prediction）。之所以重要，主要有两个原因。第一，诸如跨膜螺旋数量、蛋白质无序区、残基表面暴露程度等 1D 特征，往往直接关系到蛋白质功能。第二，这些 1D 预测结果经常被作为后续功能预测方法的输入。书中提到的许多特征都可以通过 PredictProtein 服务器获得；它为两千多万个蛋白质提供了预计算结果，并整合了多种序列预测工具。

二级结构与溶剂可及性

背景

蛋白质二级结构（secondary structure），是由较短氨基酸片段在局部和全局作用力共同驱动下形成的局部宏观结构。典型的二级结构包括：

• α-helix：由一个残基的羰基与其后第 4 个残基的氨基形成氢键而稳定；
• β-strand：主链呈锯齿状延展；多个 β-strand 之间可通过氢键形成 β-sheet；
• coil / loop / other：既不属于螺旋也不属于折叠片层的其他区域。

二级结构预测是推断蛋白质功能与演化的重要步骤。早期方法依赖简单的氨基酸偏好性，例如脯氨酸常常破坏螺旋；后续方法开始利用滑动窗口，结合局部邻域信息来预测中央残基的结构类别。再往后，一个关键进展是引入了进化信息（evolutionary information）：先用 PSI-BLAST 或更敏感的 HHblits 搜索同源序列，再构建 multiple sequence alignment (MSA)，进一步转成 position-specific scoring matrix (PSSM) 等表示。由于同源蛋白通常具有相似结构，MSA 中的保守与替换模式会携带强烈的结构信号。

Box 7.1 Hidden Markov Models

本节还借助一个小例子介绍了 hidden Markov models (HMMs)。在蛋白质分析里，HMM 最重要的用途之一，是为蛋白家族构建稳定可靠的 MSA。HMM 通过 match / insert / delete 三类状态来表示每一列比对的统计特征，并通过状态转移概率刻画序列在模型中的“走法”。训练好之后，profile HMM 既可以用来把新序列比对回已知家族，也可以反过来扫描数据库，寻找潜在的新成员。

溶剂可及性

除二级结构外，单个残基的另一个重要性质是溶剂可及表面积（solvent accessibility / accessible surface area, ASA）。它表示残基表面有多少面积能被溶剂接触。经典直观定义是：用一个代表水分子的探针球沿蛋白质表面“滚动”，探针中心扫过的轨迹对应可及表面。深埋在蛋白内部的残基虽然不直接参与分子结合，却可能对维持结构稳定性至关重要；因此，ASA 预测对于功能位点识别也很重要。

为训练这些预测器，需要先从已知三维结构中提取标准注释。最经典的工具是 DSSP，它根据氢键模式给出 8 类二级结构注释，并计算每个残基的 ASA。其他常见程序还包括 STRIDE 和 NACCESS。

代表性方法

这一部分介绍了若干经典与常用服务器：

• PHDsec / PROFsec / ReProf：较早将机器学习引入二级结构预测的方法。其思路是：先用神经网络对局部窗口做初步预测，再用第二层网络平滑掉不合理模式，例如一段 α-helix 中间突然夹入一个孤立 β-strand 残基。后来方法逐步演化为 PROFsec，最新版本以 ReProf 的形式整合在 PredictProtein 中。其溶剂可及性预测器也从 PHDacc / PROFacc 逐步发展而来。

• PSIPRED：也是神经网络驱动的二级结构预测器。它先用 PSI-BLAST 为查询序列建立 profile，再把 profile 输入两层神经网络进行预测，是长期表现稳定、应用广泛的方法。

• Proteus：采用“同源结构直接转移 + 序列预测补足”的混合策略。若在 PDB 中找到了与查询蛋白足够相似的结构同源物，就把其已知二级结构标注映射到查询序列；未对齐区域再由序列预测方法补齐，最后通过神经网络做一致性整合。

• SANN：面向溶剂可及性的预测器。它基于 PSI-BLAST 产生的 PSSM，在滑动窗口中寻找最相近的邻居，再输出二分类或三分类的可及性状态，同时也可给出 0–1 连续值形式的 relative solvent accessibility (RSA)。

• SSpro5 / SSpro8 / ACCpro5：既可做纯序列预测，也可借助已知结构同源物。其序列端核心是 bidirectional recurrent neural networks (BRNNs)，可以同时利用窗口前后方向的信息。

• RaptorX Property：可同时预测二级结构、溶剂可及性和无序区，采用 deep convolutional neural fields，以 profile 为输入，兼顾局部邻域与全局结构相关性。

• SPIDER3：基于深度学习的综合性质预测器，不仅预测二级结构和溶剂可及性，还预测主链扭转角及若干几何角度。它通过迭代方式，让不同结构性质之间相互提供上下文信息。

Box 7.2 Neural Networks

书中用一个简化示意图说明了神经网络（neural networks）的工作机制：输入层接收序列或其编码，隐藏层学习复杂关联，输出层给出结构类别。若输入和输出之间的因果规则并不清楚，神经网络就能借助带标签的训练集，通过监督学习自动调整连接权重，逼近这种映射关系。二级结构预测之所以适合这种框架，是因为已知 3D 结构可为每个残基提供明确的结构标签。

性能评估

二级结构预测最常用的指标是 Q3 score，即三分类准确率。但由于三类残基并不平衡，仅看 Q3 不够：β-strand 通常最难预测，而且在真实数据里占比也最低，因此有些方法虽然 Q3 不低，却几乎不能有效识别 β-strand。

为此，还需要考虑分段层面的指标，如 segment overlap score (SOV)。SOV 不只看单个残基预测对错，还关注整个结构片段的边界与连续性，更符合生物学解释。

书中也介绍了 receiver operating characteristic (ROC) curve 与 AUC_ROC：当模型输出的是连续置信度而非离散标签时，可以通过改变阈值来观察 true-positive rate (TPR) 与 false-positive rate (FPR) 的变化，从而评价分类器区分两类样本的能力。

综合已有评测，较新的二级结构预测方法大致可达到 Q3 ≈ 80–85%。作者同时指出：由于实验结构本身存在误差、不同注释标准之间也有不一致，理论上的 100% Q3 实际上不可达。因此，这一领域的核心挑战已经逐渐从“更准地预测二级结构”，转向“更准地预测三级结构”。

对于溶剂可及性，评价指标会随输出形式变化：

• 若输出为 buried / exposed 等离散状态，可用 Q2 / Q3；
• 若输出为连续的 RSA 值，则更适合用 Pearson’s correlation coefficient。

作者还提到，过去曾有 EVA 与 LiveBench 等自动评测平台，但现已停止服务；而社区最重要的独立评测框架，则是双盲形式的 CASP。

跨膜 α 螺旋与 β 链

背景

细胞与环境之间的大部分信息交流，都依赖嵌在膜中的蛋白质进行。估计约 20–30% 的蛋白质属于跨膜蛋白（transmembrane proteins）。其中包含许多药物开发重点靶点，例如 G-protein-coupled receptors (GPCRs)。然而，膜蛋白的实验结构解析明显比可溶蛋白更困难，因此其在 PDB 中长期代表性不足，计算预测就显得尤为关键。

跨膜结构主要有两种基本形式：

• transmembrane alpha helices
• transmembrane beta strands / beta barrels

虽然它们本质上仍属于二级结构，但膜蛋白为了适应疏水膜环境，进化出了与可溶蛋白明显不同的物理化学特征，因此不能简单直接复用普通二级结构预测器。最核心的性质是疏水性（hydrophobicity）：它决定残基能否稳定埋在膜内。此外，还常常需要预测拓扑（topology），也就是跨膜片段相对于胞质侧和非胞质侧的朝向。这里一个经典规律是 positive-inside rule：胞质侧 loop 往往富含更多带正电残基。

代表性方法

• Phobius / TMHMM：利用 HMM 表示球状区段、loop、螺旋末端和跨膜核心等状态。Phobius 进一步加入了 signal peptide 状态，因此能更好地区分信号肽与真正的跨膜螺旋。

• PolyPhobius：在不改变 HMM 主体结构的情况下，引入 MSA 的进化信息以提升性能。

• Proteus-2：先预测信号肽，再与实验注释数据库比对；若存在已知跨膜同源物，则直接转移跨膜标注；否则结合 TMHMM 与 TMB-HUNT 进行预测；最后再为剩余残基补上结构类别。

• MEMSAT-SVM：使用 4 个 SVM，分别处理跨膜螺旋、信号肽、loop 与 re-entrant helices。后者是一个很特别的结构：螺旋进入膜后又从同一侧返回。

• TMSEG：把随机森林与神经网络相结合，先对每个残基打分，再通过平滑与片段级精修得到最终跨膜区段和拓扑。其优势之一是能较好地区分“有膜螺旋的蛋白”和“无膜螺旋的蛋白”。

• BETAWARE：专门识别 transmembrane beta barrel (TMBB) 蛋白，是较少见的专项预测器。

• BOCTOPUS2：用于 TMBB 的链与拓扑预测。文中将其推荐为预测跨膜 β-strand / TMBB 的良好起点。

跨膜预测的性能评估

跨膜预测可以在 3 个层级上打分：

1. per-residue：逐残基判断；
2. per-segment：逐跨膜区段判断；
3. per-protein：整条蛋白的整体正确性。

作者特别强调，逐残基指标如 Q2 / Q3 容易高估实际可用性。比如一条跨膜螺旋中间被错误插入一个非膜残基，对 Q2 的影响可能不大，但从生物学上看却很糟糕。因此还要使用：

• segment recall / segment precision
• Qok：要求一个蛋白的所有跨膜螺旋都预测正确，标准更严格
• SOV：衡量预测片段与真实片段的重叠程度

书中给出的结果表明：很多方法的逐残基准确率都能超过 80%，但更严格的 per-protein 指标往往明显更低。因此解释预测结果时，不能只看一个单一分数。

无序区（Disordered Regions）

背景

有些蛋白质区域在孤立状态下并不会折叠成稳定、单一定义的结构，而是在较大的构象空间中波动，这些区域称为无序区（disordered regions）。含有这类区域的蛋白常被称为：

• intrinsically disordered proteins (IDPs)
• intrinsically disordered regions (IDRs)

文献里也常见 intrinsically unstructured、natively disordered、loopy 等相关说法。此类区域通常表现出低序列复杂度，并偏向富含亲水残基。

无序区并不是“没用的杂乱部分”。恰恰相反，它们常参与调控与信号转导，因为柔性的结构可以适应更多种结合方式。真核生物中的 IDP/IDR 尤其常见，并经常出现在拥有多个互作伙伴的网络枢纽蛋白中。

作者指出，无序预测在以下方面都很有价值：

• 辅助结构解析
• 药物设计
• 疾病风险评估

从大规模统计看，真核生物中长度超过 30 个残基的 IDR 明显多于原核生物。

相关数据库

书中列举了若干资源：

• DisProt：人工整理、实验验证的 IDP 注释数据库；
• IDEAL：收录结合后发生有序化的 IDR，并记录其互作伙伴；
• D2P2：为大量基因组预先汇总多种无序预测结果。

预测思路与方法

无序区预测大致有 3 条路线：

1. 基于序列组成与理化性质；
2. 结合序列与 MSA，并借助机器学习；
3. 使用元预测器整合多个工具的结果。

代表性方法包括：

• PrDOS / PrDOS-CNF：两阶段方案。先用 SVM（后续版本改用 conditional neural fields）结合 PSI-BLAST 产生的 PSSM 做窗口预测；再引入与已知 3D 结构同源序列的信息，根据对应位置是否无序来修正概率。

• metaprdos2：整合多个预测器结果的 meta-predictor。

• DISOPRED3：结合神经网络、SVM 和最近邻预测器，不仅预测长无序区，还能预测位于 IDR 内部的潜在蛋白结合位点。

• POODLE 系列：一组基于 SVM 的无序预测器，包括面向短无序区、长无序区、整体有序/无序判定，以及元整合版本。它强调按不同无序片段长度采用不同建模策略。

本节小结

这一 canonical section 说明了：从蛋白序列中提取一维结构信息，是连接“序列”与“结构/功能”的关键中间层。其核心内容可以概括为：

• 二级结构与溶剂可及性预测，是蛋白质结构推断的基础；
• 进化信息（MSA、PSSM、profile）极大推动了预测性能提升；
• HMM、神经网络、深度学习等方法，已成为这一领域的主流建模框架；
• 评价预测器不能只看逐残基准确率，还要看 SOV、ROC/AUC、Qok 等更贴近实际应用的指标；
• 跨膜蛋白因其特殊物理化学环境，需要专门预测器；
• 无序区虽然缺乏稳定结构，但在调控和结合中功能显著，且具有独立的方法学体系。

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新增术语（暂记入 QA，待批量入库）：

03 蛋白质功能预测

蛋白质结构预测之所以重要，根本目的仍然是理解蛋白质功能（protein function）。如果能直接从氨基酸序列推断功能，就能为海量新测得序列提供快速注释，并为后续实验验证提供方向。

内容提要（Synopsis）

如今绝大多数蛋白质序列都来自基因组测序，许多蛋白质的功能研究首先只能依赖计算预测。最常见的方法，是把已知同源蛋白的功能注释转移给待研究序列；但大规模评测表明，这种 homology transfer 虽然实用，却有明显局限，必须谨慎解释。另一方面，很多蛋白质并没有已注释的近同源物，因此研究者发展出大量利用序列特征、结构线索和机器学习模型的功能预测方法。

蛋白质功能本身是多维度的：它可能涉及分子层面的催化或结合活性，也可能涉及细胞定位、参与的生物过程、互作伙伴，甚至单个氨基酸变异对功能的影响。本节重点讨论分子功能相关的若干方向：

• motifs and domains：蛋白质功能单元的识别；
• Gene Ontology (GO)：标准化功能词汇体系下的功能预测；
• subcellular localization：亚细胞定位预测；
• protein interaction sites：蛋白质与蛋白质 / DNA / RNA 的结合位点预测；
• effect of sequence variants：单氨基酸变异对功能影响的预测。

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Motifs and Domains

背景

蛋白质中存在许多承担特定功能的短序列和较长结构单元。motif 通常较短，例如核定位信号（nuclear localization signal）或丝氨酸蛋白酶活性位点的短保守基序；structural domain 则是能够独立折叠、在不同蛋白中重复出现并承担某类功能的结构片段，常见长度约为 100–500 个残基。识别一个新蛋白中的 motif 或 domain，往往就能对其结构和功能作出第一轮推断。

motif 和 domain 往往是通过比较一组同源蛋白中的保守区域而发现的。最简单的模式可写成 regular expression；更复杂的模式则更适合用 position-specific scoring matrix (PSSM) 或 hidden Markov model (HMM) 表达，并依托 multiple sequence alignment (MSA) 构建。对应工具包括 HHsearch 与 HMMER。除已知模式搜索外，也有方法尝试仅根据序列本身预测 domain、domain boundary 或 linker 区域。

数据库与资源

本节把 InterPro 作为 motif / domain 注释的核心整合入口。InterPro 汇集多个成员数据库，并通过 InterProScan 提供统一搜索。书中列举的重要成员包括：

• PROSITE：规则表达式样式的模式与 profile；
• Pfam：基于人工整理 seed alignment 构建的 profile HMM 家族库；
• SMART：人工整理的 domain HMM，并提供部分 ortholog 信息；
• TIGRFAM：强调更具体功能注释的 curated HMM 家族；
• SUPERFAMILY：基于 SCOP 结构分类派生的 HMM；
• PRINTS：由多序列比对整理得到的“fingerprints”；
• PRODOM：主要基于 PSI-BLAST 自动生成的 domain families；
• CATH-Gene3D：依托 CATH 超家族注释建立的 profile HMM；
• PIRSF：全长同源序列家族；
• PANTHER：带系统发育树的同源基因家族；
• HAMAP：与 UniProtKB 同步的人工整理蛋白家族 profile；
• SFLD：面向酶功能层级聚类的人工整理数据库；
• CDD：整合 Pfam、SMART、COG、PRK、TIGRFAM 等的 conserved domain meta-database；
• MobiDB：长度大于 20 aa 的无序区共识预测资源。

这些资源之间存在“有意的冗余”：不同数据库从不同角度描述同一蛋白片段，组合起来反而更有利于得到更完整、更可靠的功能注释。

除 InterPro 外，书中还强调了：

• SCOP2：人工整理的 PDB 结构域分层体系；
• CATH：半自动结构域分类体系；
• SOLID：CATH 的扩展，用更高序列一致性阈值细分家族；
• FunFams：基于 specificity-determining positions (SDPs) 聚类得到的功能家族；
• COG：主要面向微生物全长蛋白的 orthologous groups。

书中同时指出，没有任何单一数据库能完整覆盖功能注释的所有方面，因此像 InterPro 这样的 meta-database 尤其重要。另一个方向是 Swiss-Prot 和专注人类蛋白的 neXtProt：它们更强调专家阅读文献后的深度人工注释，而不是单纯追求覆盖面。

方法

教材在这里介绍了一批仅靠序列预测结构域或边界的方法：

• DomCut：利用滑动窗口比较 domain 区与 linker 区的氨基酸频率差异；
• Scooby-Domain：利用疏水性组成，在多尺度窗口上搜索可能的 domain 架构，并可结合 DomCut / PDLI 与同源信息进一步优化；
• DOMpro：以递归神经网络处理整条序列，输入包括 PSSM、预测二级结构与溶剂可及性；
• Dom-Pred：由 DomSSEA 与 DPS 两部分组成，前者利用二级结构轮廓识别已知 domain，后者尝试预测未知 domain 的边界。

性能

domain 预测通常可在两个层面评价：

1. 预测蛋白含有多少个 domain；
2. 正确识别 domain boundary / linker region。

文中给出的结果表明：如果允许借助同源结构或模板信息，预测 domain 数量的表现通常较好；但要精确划定边界则困难得多。CASP8 对 domain boundary prediction 的独立评测也表明：使用结构模板的方法明显优于纯 ab initio 方案，而单结构域蛋白在评测集中往往被高估，因此读者不应把不同论文给出的性能数字直接横向比较。

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Gene Function Prediction Based on the Gene Ontology

背景

若要系统地预测和评估蛋白质功能，就需要一个定义清楚、层级明确的术语系统。Gene Ontology (GO) 正是目前最标准、最全面的功能词典。GO 用三个彼此相关的 ontology 描述功能：

• molecular function ontology (MFO)：分子层面的活性，如某种酶活性；
• biological process ontology (BPO)：蛋白参与的生物过程；
• cellular component ontology (CCO)：蛋白所在的细胞组分。

每个 ontology 都是一个 directed acyclic graph (DAG)。越靠叶节点，术语越具体。GO 还与多种基因组和蛋白数据库合作，维护术语到基因/蛋白的注释，并通过 evidence code 标明证据来源，例如“inferred from sequence similarity”或“traceable author statement”。

方法

书中介绍的代表方法包括：

• Metastudent：最直接的同源转移方法。用 BLAST 找相似序列并转移 GO 注释；若找不到可用同源物，就不给出预测。它整体可靠性有限，但部分术语可达到较高可信度。
• COGIC：混合同源转移与机器学习。它综合使用 PSI-BLAST 命中、UniProtKB/Swiss-Prot 文本挖掘、3-mer 频率与 GO 术语的关联、FFPred 输出、EggNOG 远缘关系、PSSM 相似性神经网络，以及 FunctionSpace 的高通量数据，最终再结合 GO 图结构进行传播。
• FFPred 3.0：面向人类蛋白的 de novo GO 预测器。由于 GO 是典型的多标签问题，而 SVM 是二分类器，FFPred 为不同 GO 术语分别训练大量 SVM。输入特征包括氨基酸组成、预测二级结构、跨膜区段、无序区、signal peptide、subcellular localization 等。
• FunFams-based prediction：先把蛋白定位到相应 CATH superfamily，再映射到对应 FunFam，并把该功能家族及其 GO DAG 祖先上的术语转移给查询蛋白。

性能与 CAFA

GO 预测的评估比普通分类问题更复杂，因为预测出的术语若与真实术语不是完全一致，但位于其父节点，也应得到部分信用。评估还可分为：

• protein-centric：看单个蛋白的全部 GO 术语预测得如何；
• term-centric：看某个 GO 术语在所有蛋白上的预测情况。

方法论文最常报告的指标，是蛋白中心的 Fmax，也就是在 precision-recall 或 ROC 曲线上能达到的最大 F1 值。教材强调，蛋白功能预测社区中最重要的独立评测体系是 CAFA (Critical Assessment of Function Annotation)，它相当于功能预测领域的 CASP。

CAFA 的基本流程是：先公布一批目标蛋白，参赛者在截止日期前提交预测；之后进入数月的 annotation growth 阶段，等待新的实验数据被 GO curator 整理入库，再用这些“后验新增”的真实注释来评估此前的预测。书中回顾了 CAFA1、CAFA2、CAFA3 的扩展过程，并指出：

• MFO 往往最好预测；
• BPO 更难；
• CCO 的评估容易受到常见宽泛术语主导；
• 没有任何单一方法能在所有 ontology 和所有评分体系下长期稳居第一。

总体来看，从 CAFA1 到 CAFA2，性能确有提升；同时，较好的方法在低同源“困难目标”上未必会急剧崩溃，这一点令人鼓舞。但作者也提醒，功能预测的难度仍明显高于结构层面的某些任务。

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Subcellular Localization

背景

蛋白质在细胞中的亚细胞定位（subcellular localization） 本身就是重要的功能线索。虽然蛋白质可能在不同区室之间移动，但大多数蛋白在其生命史的大部分时间里，主要在某一个细胞区室中发挥功能。细胞分选机制相对清楚，可提供许多可供模型利用的特征；同时，UniProtKB/Swiss-Prot 也为一部分蛋白提供了实验定位数据，因此这一方向长期是功能预测中最成熟、最有实际应用价值的分支之一。

不过，尽管手工注释数据库已经积累了数万条实验定位记录，相对于全部已知蛋白，这个比例仍很低。因此，计算预测依然是填补空白的核心手段。

方法

本节介绍了三类代表方法：

• LocTree3：把蛋白运输路径抽象为层级化的 SVM 决策树，可预测真核 18 类、细菌 6 类、古菌 3 类定位。它优先做 PSI-BLAST 同源转移；若找不到可靠同源物，则回退到 de novo 的 LocTree2，后者使用 profile-kernel SVM 和 k-mer conservation 特征。
• MultiLoc2：整合整体氨基酸组成、sorting signal、系统发育谱和 GO 术语。提供 LowRes 与 HighRes 两个版本，后者还能覆盖跨膜蛋白并预测更多真核定位类别。
• DeepLoc：只依赖序列本身做 ab initio 预测。它先用卷积神经网络抽取不同长度的 motif，再送入循环神经网络和后续过滤层，最后以类似层级方法给出定位类别。

性能

亚细胞定位虽然是多分类任务，但很多研究仍使用类似二分类准确率的指标来报告性能。教材总结认为：新的综合模型普遍优于旧方法；某些定位类别（如 extracellular proteins）可达到 85% 以上准确率，而胞质、线粒体、膜系统等类别通常较低。书中提到 DeepLoc 在其新数据集上的总体准确率约 78%，高于同集上的 LocTree2 和 MultiLoc2。

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Protein Interaction Sites

背景

大多数蛋白并不是单独起作用，而是在分子复合体和互作网络中发挥功能。因此，预测结合位点（binding sites） 或 interaction interfaces 是理解功能的重要步骤。本节聚焦于只根据单条蛋白 1D 序列来预测非共价的蛋白—蛋白互作位点；而基于已知 3D 结构的更复杂方法，则在其他章节和综述中讨论。

蛋白互作位点形式多样：

• 可能是由 3D 折叠后才邻近的一大片表面；
• 也可能是酶中结合小分子的活性位点；
• 还可能是位于无序区中的短线性结合片段。

界面残基通常通过单体与复合体状态下 accessible surface area (ASA) 的差异，或 3D 结构中的距离标准来定义。实验上，alanine scanning 是常用手段：逐位点突变为 alanine，再测量结合强度变化。对结合贡献特别大的残基常被称为 hot spots，也是药物设计高度关注的区域。

此外，教材也提到近年来根据 correlated mutations / coevolution 从 MSA 中寻找互补变异模式的新路线，例如 FILM3、EVfold、EVcomplex。这些方法在 CASP11 / CASP12 期间进展很快。

数据库

书中列出多种收录互作界面信息的数据库与资源：

• PISA
• IBIS
• IPfam
• PIFACE
• 3did
• BID
• ASEdb

这些资源分别覆盖结构界面、同源推断界面、alanine scanning 结果等不同层面的证据。

方法

1. 蛋白—蛋白界面残基预测

一条经典路线，是从已知界面残基中学习其理化和序列模式，再在新蛋白中搜索这些模式。早期 Ofran and Rost 的方法仅用序列与滑动窗口神经网络即可工作；后续方法进一步引入进化信息、预测二级结构和溶剂可及性。PSIVER 强调 predicted accessibility 的价值；HomPPI 则是典型的纯同源转移方法，把 PDB 复合体中已知界面映射到同源蛋白。另一个重要资源 ELM 收录短线性蛋白结合位点模式，并可在查询序列中识别已知 pattern。

2. 蛋白—DNA / RNA 结合位点预测

书中还分别介绍了核酸结合位点预测器：

• DBS-PSSM：用小型神经网络加 PSI-BLAST PSSM 预测 DNA-binding residues；
• DP-Bind：整合 SVM 与两个 logistic regression 模型；
• SomeNA：层级神经网络，先判断蛋白是否结合 DNA 或 RNA，再预测具体位点；
• Pprint：基于 SVM 的 RNA-binding residue 预测；
• RNABindRPlus：将 SVM 与同源方法 HomPRIP 结合起来预测 RNA 结合位点。

性能

对于 protein–protein interaction (PPI) 位点，常用的仍是一般二分类评估指标。但教材明确指出：由于缺乏统一、近期的独立评测，不同方法作者报告的数值很难直接比较，而且该领域整体性能似乎已进入平台期。

对于 DNA / RNA 结合位点，书中引用的综述表明，多数 DNA-binding residue 预测器的 AUC_ROC 大约在 0.79 左右，已经有一定实用价值，但不同方法往往在 sensitivity 与 specificity 之间取舍不同。共识模型通常优于单模型。RNA-binding residue 的表现略低，例如 RNABindR 与 Pprint 的 AUC_ROC 就低于 DNA 结合预测。作者还特别提醒：很多方法默认输入蛋白“已知会结合核酸”，因此这些性能数字并不能回答“这个蛋白是否本身就是核酸结合蛋白”这一更困难的问题。

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Effect of Sequence Variants

背景

任意两个无亲缘关系的人类个体，在基因组上大约相差 500 万个位点，并包含约 2 万个 single amino acid variants (SAVs)。关键问题是：这些变异会不会影响蛋白功能？由于潜在变异数量极大，不可能全部用实验方法逐一验证，因此需要计算预测工具填补空白。

书中提到，一些分析甚至发现：健康个体中也存在不少看起来对功能影响很强的 SAV；常见 SAV 对功能的影响有时并不比罕见 SAV 更弱；而个体间变异平均影响甚至可能高于人与近缘物种之间的天然差异。与此同时，多数现有方法仍强烈偏向人类变异数据，泛化到其他物种时需谨慎。

方法

SIFT

SIFT 是最早的一批 SAV 功能影响预测器之一。它的核心思想很朴素：若某位置在同源家族中高度保守，那么把该位置改成未见过的氨基酸，很可能会损伤功能；若变异后的残基在同源序列中经常出现，则更可能是中性的。SIFT 使用 PSI-BLAST 构建 MSA，并据此判断变异是否 deleterious。

PROVEAN

PROVEAN 与 SIFT 共享“进化保守性是核心信号”这一思想，但做了重要扩展：它不仅能预测替换，也能预测插入、缺失以及多个同时发生的变异。其流程先把相似序列按 80% 一致性聚类，再选取与查询序列最相近的若干 cluster，通过 BLOSUM62 计算 delta score，最后与经验阈值比较，判断变异是否有害。先按 cluster 求平均再合并，可以减少高度冗余同源序列带来的偏置。

PolyPhen-2

PolyPhen-2 综合使用保守性与实验 / 预测得到的结构信息。它从更大的特征集中筛选出若干序列特征与结构特征，并通过 naive Bayes classifier 输出最终分数。与 SIFT 更偏向“分子功能是否改变”不同，PolyPhen-2 的训练目标更偏向“是否导致疾病相关系统表型”。因此它实际上更接近疾病效应预测器，而不仅仅是纯分子层面的功能扰动预测器。

SNAP2

SNAP2 使用神经网络系统来预测 SAV 对蛋白分子功能的影响。除了保守性这个最强信号，它还引入二级结构、结合位点、无序区等序列级预测特征，以及蛋白长度、氨基酸组成等全局特征。SNAP2 的一个核心理念，是支持全面 in silico mutagenesis：对蛋白中每个位置、每种可能氨基酸替换都计算效应分数，从而形成类似 Figure 7.9 那样的热图，用于观察哪些位点对扰动高度敏感。

CADD

CADD 是本节中唯一不是以蛋白序列为中心的方法。它直接对基因组变异打分，因此既能处理编码区 SAV，也能处理非编码区 single nucleotide variants (SNVs) 与小型 indel。CADD 综合 63 个特征，包括进化、调控、转录本信息，以及来自 PolyPhen 和 SIFT 的预测分数，并通过 SVM 输出一个统一的 deleteriousness score。由于它不依赖“变异类型必须是蛋白替换”这一前提，因此适用范围更广。

性能

变异效应预测通常仍用 AUC_ROC、accuracy 等常规分类指标评价。教材举例指出，在一项独立评估中，SIFT、PolyPhen 和 CADD 的 AUC_ROC 大致在 0.59–0.63；但若换成 TP53 等功能测得更细致的数据集，表现可能明显更高。不同研究中方法排名经常大幅波动，原因包括：

• 使用的数据集不同；
• 预测目标不同（分子功能、通路、个体表型等）；
• 训练数据存在 ascertainment bias，即研究充分的蛋白更容易进入训练集，从而高估泛化性能。

因此，这类工具更适合用来提出假设（generate hypotheses），而不是直接替代实验结论。

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本节小结

本 canonical section 围绕“如何从蛋白质序列推断功能”展开，核心信息可概括为：

• motif、domain 及其边界，是功能注释最基础的切入口；
• GO 为功能预测提供了统一的层级化语言，而 CAFA 则是最重要的独立评测框架；
• 亚细胞定位预测是最成熟、最常落地的功能预测任务之一；
• 结合位点预测覆盖蛋白—蛋白、蛋白—DNA、蛋白—RNA 等多个方向，但评测标准和任务边界要看清；
• SAV / SNV 效应预测能帮助发现潜在致病或功能关键位点，但其结果更应作为实验假设，而不是最终裁决；
• 同源转移、PSSM / HMM、神经网络、SVM、深度学习与多源整合，是这一整类问题的共同方法学主线。

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新增术语（暂记入 QA，待批量入库）

第7章 基于蛋白质序列的预测方法

7.4 总结、网络资源、延伸阅读与参考文献

总结（Summary）

20 世纪 60 年代 Anfinsen 等人的奠基性工作已经清楚表明：蛋白质序列决定其结构，而结构最终决定其功能。由于蛋白质序列相对容易通过实验获得，围绕“如何从序列预测结构与功能”已经发展出庞大的研究体系。

从结构预测角度看，这一领域已经高度成熟，至少有些子问题在现有实验数据允许的范围内，已经接近“可解”。但与之相比，仅从序列直接预测蛋白质功能这个更一般的问题，至今仍未真正解决。

本章讨论的一维预测方法——例如二级结构、跨膜区、溶剂可及性和无序区预测——仍然非常重要，因为它们常常是更高层级结构与功能预测模型的输入。幸运的是，尽管各种工具都存在误差，研究者如今已经能够借助大量互补方法，在缺乏先验实验知识的情况下，为蛋白质序列补充丰富的结构与功能线索。

不过，这些预测结果必须结合方法边界来解释。用户需要理解每类工具的优势与弱点，才能真正利用它们去筛选当今海量序列数据，并进一步提出可实验检验的生物学假设。尤其在蛋白质功能预测中，还应尽量回到原始证据（primary evidence）：这些证据可能来自最佳类别工具的推断、高通量实验的映射，或专家依据深入实验整理出的数据库注释。当前没有任何单一资源能完美告知用户这些证据的可靠性层级。因此，对目标蛋白的实际分析，通常仍应依赖针对具体问题选用合适预测工具，并结合最可靠数据库注释的综合判断。

网络资源（Internet Resources）

核心数据库与预测评测

• CAFA — `biofunctionprediction.org/cafa`
• CAGI — genomeinterpretation.org
• CASP — predictioncenter.org
• CATH — www.cathdb.info
• InterPro — `www.ebi.ac.uk/interpro`
• neXtProt — www.nextprot.org
• PDB — www.wwpdb.org
• Pfam — pfam.xfam.org
• SCOP2 — scop2.mrc-lmb.cam.ac.uk
• UniProtKB — www.uniprot.org

蛋白质结构预测

• BETAWARE — biocomp.unibo.it/savojard/betawarecl
• BOCTOPUS2 — boctopus.bioinfo.se
• PolyPhobius — phobius.sbc.su.se/poly.html
• POODLE — `cblab.my-pharm.ac.jp/poodle`
• PrDOS — `prdos.hgc.jp/cgi-bin/top.cgi`
• Proteus — wks80920.ccis.ualberta.ca/proteus
• Proteus2 — www.proteus2.ca/proteus2
• PSIPRED, MEMSAT-SVM, and DISOPRED3 — `bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred`
• RaptorX — `raptorx.uchicago.edu/StructurePropertyPred/predict`
• ReProf, TMSEG, and Meta-Disorder — predictprotein.org
• SPIDER3 — `sparks-lab.org/server/SPIDER3`
• SSpro5, ACCpro5 — scratch.proteomics.ics.uci.edu

蛋白质功能预测

• CADD — cadd.gs.washington.edu
• DeepLoc — www.cbs.dtu.dk/services/DeepLoc
• DomCut — `www.bork.embl-heidelberg.de/~suyama/domcut`
• DomPred, FFPred3.0, COGIC — `bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred`
• DOMpro — scratch.proteomics.ics.uci.edu
• DP-Bind — `lcg.rit.albany.edu/dp-bind`
• FunFams — www.cathdb.info/search/by_sequence
• HomPPI — `ailab1.ist.psu.edu/PSHOMPPIv1.3`
• HomPRIP-NB — `ailab1.ist.psu.edu/HomPRIP-NB/index.html`
• LocTree3 — `rostlab.org/services/loctree3`
• MultiLoc2 — `abi-services.informatik.uni-tuebingen.de/multiloc2/webloc.cgi`
• PolyPhen-2 — `genetics.bwh.harvard.edu/pph2`
• Pprint — `crdd.osdd.net/raghava/pprint`
• PROVEAN — `provean.jcvi.org/index.php`
• PSIVER — `mizuguchilab.org/PSIVER`
• RNABindRPlus — `ailab1.ist.psu.edu/RNABindRPlus`
• ScoobyDomain — www.ibi.vu.nl/programs/scoobywww
• SIFT — sift.bii.a-star.edu.sg
• SNAP2 — `rostlab.org/services/snap2web`
• SomeNA, Metastudent, Ofran, and RostPPI predictor — www.predictprotein.org

延伸阅读（Further Reading）

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• Moult, J., Fidelis, K., Kryshtafovych, A. et al. (2016). Critical assessment of methods of protein structure prediction: progress and new directions in round XI. Proteins 84(Suppl 1):4–14. 这是对 CASP 实验较新的总结性评估，概括了蛋白质结构预测多个核心方向的独立测试结果。对于对功能预测感兴趣的读者，还应同时关注 CAFA（Jiang et al. 2016）以及 CAGI（见上方网络资源）在变异效应预测方面的评测实践。

参考文献（References）

以下参考文献题录按原书英文原文保留：

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第 8 章 多序列比对 / 引言

多序列比对（multiple sequence alignment，MSA）是指将两条以上的氨基酸序列或核苷酸序列排列在一起，使来自不同序列的残基以某种合理方式在垂直列中对齐。MSA 广泛用于蛋白质组和基因组分析中的各类分析流程，也是大多数系统发育比较的关键起点。研究者常用它寻找序列中的共同特征，并辅助预测蛋白质和核酸的二维、三维结构。Chatzou 等（2016）对 MSA 方法、用途及其误用作了很好的综述。

通常，只有在序列之间存在系统发育相关性、因而同源时，才应尝试对它们进行比对。在这种情况下，理想的比对应当把同源残基放在同一列中。图 8.1 给出了一个蛋白质多序列比对示例，其中突出显示了一列。如果这一列比对正确，就可以推断该列中的残基来自这些序列共同祖先中的同一个残基位置。这个祖先残基可能是缬氨酸（valine，V），也可能是异亮氨酸（isoleucine，I）或其他残基；关键在于，这一列中的所有氨基酸都源自共同祖先中的同一位置。这就是构建这类比对背后的系统发育视角。原则上，也可以尝试让序列比对最大化每一列残基在结构、功能或理化性质上的相似性。

在简单情形下，如果序列同源，一个良好的系统发育比对通常也会最大化结构相似性。如果序列并不同源，或者分化程度极高、相似性并不清楚，那么要得到有意义的功能性比对就会非常困难。一个常见例子是启动子序列：它们可能共享较短的功能基序，例如调控蛋白结合位点。多数 MSA 软件包很难正确比对这类基序；更合适的做法通常是使用专门的 motif-finding 软件包，或与已知基序集合进行比较。另一个例子是蛋白质序列具有共同折叠，但缺乏序列相似性；这可能源于三维结构的趋同进化，也可能源于序列极端分化。在这种情况下，也最好使用专门的序列—结构匹配软件包。本章将专门讨论这样一类情形：我们希望比对的序列明确同源，并且具有系统发育相关性。

构建 MSA 时，还必须考虑插入和缺失。在基因复制之后，或在宿主物种分化之后，待比较序列在彼此分化的过程中会发生插入和缺失。因此，MSA 软件包必须能够寻找一种空字符或“gap”（空位）的排列方式，使同源残基尽可能对齐；这一思路与第 3 章讨论的双序列比对类似。如图 8.1 所示，gap 通常用连字符表示。给定残基匹配打分方案（例如 BLOSUM62；Henikoff and Henikoff 1992）和 gap 打分之后，就可以尝试寻找一个总体得分最高、也就是总体上最优的 MSA。原则上，这可以通过把动态规划序列比对方法（Needleman and Wunsch 1970）扩展到多条序列来实现，并由此保证得到最高得分的 MSA。实践中，这类扩展需要的时间和内存随序列数量呈指数增长（可写作 O(L^N)，其中 N 为序列条数，L 为序列长度），因此只能用于极少量序列。所以，所有广泛使用的方法都依赖启发式策略来构建 MSA。启发式方法使很大规模的比对成为可能，但代价是无法保证比对得分或比对质量一定最优。

最常用的 MSA 启发式方法由 Feng 和 Doolittle（1987）称为“progressive alignment”（渐进式比对）；这一方法也属于 20 世纪 80 年代不同研究组提出的一类方法（例如 Hogeweg and Hesper 1984）。据作者所知，最早的自动 MSA 方法由 David Sankoff 于 1973 年提出，用于比对 5S rRNA 序列（Sankoff et al. 1973），本质上也是一种渐进式比对。所有这些方法都从序列两两比对开始，再逐步把新序列或已有比对合并进来，从而构建完整的 MSA。比对执行的顺序通常由某种序列聚类结果决定；这种聚类由全对全比较生成，Higgins 等（1992）将其称为“guide tree”（引导树）。图 8.2 概括展示了这一过程。

图 8.1

七条球蛋白蛋白质序列的多序列比对示例。图中突出显示了一个位置。

图 8.2

简单渐进式多序列比对过程示意。这个流程中的每一步都有不同变体，其中一些步骤会在 MAFFT 和 MUSCLE 等知名软件包中迭代执行。

第 8 章 多序列比对 / 多序列比对质量的衡量

不同的 MSA 软件包可谓数以百计，每个软件包都会使用不同组合的参数设置和启发式算法来生成比对。那么，如何判断哪个软件包效果最好，或者最适合哪一类数据？一种标准做法，是把不同软件包生成的比对与一组公认的“gold standard”（金标准）参考比对进行比较。这类集合可作为 benchmark（基准测试集），对 MSA 软件包开发者测试和比较 MSA 极其重要。对于蛋白质而言，最常用的 MSA benchmark 往往依赖已知结构蛋白质序列之间的比较。这是因为，结构非常相似的蛋白质序列实际上可能已经高度分化。因此，这种方法明显建立在结构视角之上。相对地，系统发育 benchmark 往往使用模拟比对，和/或使用系统发育关系已知的序列集合；它们得到的结果不一定与基于结构的结果一致（Iantorno et al. 2014）。

在 benchmark 中使用结构，意味着需要先以自动或人工方式对结构进行比对，然后用对应的序列比对来测试各种 MSA 软件包。早期的结构比对程序包括 SSAP（Taylor and Orengo 1989）和 STAMP（Russell and Barton 1992）；较新的程序包括 MUSTANG（Konagurthu et al. 2006）。虽然这一过程会对待比对序列中仍然存在的片段进行结构叠合，但逐个残基的对齐并不总是容易。因此，创建可靠的参考比对可能需要一定人工干预，而这并不总是直截了当（Edgar 2010; Iantorno et al. 2014）。

最早的大规模 MSA benchmark 是 BAliBASE。其原始版本（Thompson et al. 1999）包含 140 多个参考比对，并被划分为五个层级化参考集合，目的是覆盖多种不同的比对场景。这些场景包括：长度相近且距离相等的序列（BB11/12 reference set）、包含孤立序列的家族（BB2）、距离相等但分化较大的家族（BB3）、N 端或 C 端延伸（BB4），以及含插入的比对（BB5）。对于 BB11、BB12、BB2 和 BB3 类别，覆盖的序列长度从小于 100 个残基到大于 400 个残基不等。对于 BB11/12 类别，则使用从低序列同一性到高序列同一性的比对。虽然 BAliBASE 当前版本是 4.0，但本章讨论将使用 BAliBASE 3.0（Thompson et al. 2005）。第 3 版包含与第 1 版相同的五个类别，但参考比对数量增加到 218 个。每个参考比对中的序列数从 4 到 142 条不等，中位数为 21。BAliBASE benchmark 包含一个打分程序，用于评估生成的（测试）蛋白质 MSA 与参考比对的相似程度。

在 BAliBASE 中，测试比对与参考比对之间的相似性用两个数值表示：sum-of-pairs（SP，成对求和）score 和 total column（TC，总列）score。该打分程序只在参考比对中可靠对齐的区域测量 SP 和 TC score；这些区域称为“core columns”（核心列）。OXBench（Raghava et al. 2003）和 SABmark（Van Walle et al. 2005）基于与 BAliBASE 类似的原则。SABmark 包含 1268 个比对，序列数从 3 到 50 条不等（中位数为 8）。OXBench 包含 672 个家族，每个家族有 2 到 122 条序列（中位数为 3）。本章将给出多个 MSA 软件包在 BAliBASE benchmark 下测得的 SP 和 TC score。

SP score 衡量正确对齐的残基对所占比例；TC score 衡量参考比对中的列在生成的 MSA 中被完整恢复的比例。两个分数都可以在 0 到 1 之间变化：0 表示没有恢复任何残基对或列，1 表示生成的 MSA 与参考比对完全相同。对于双序列比对，SP score 与 TC score 相同。对于包含三条或更多序列的 MSA，TC score 永远不会超过 SP score。SP 和 TC score 衡量的是 aligner（比对程序）的 sensitivity（灵敏度），也就是正确对齐的残基和列所占比例，即 true positives（真阳性）数量。可是，它们不会惩罚错误对齐的残基；这类错误本应反映 aligner 的 specificity（特异度），也就是真阴性数量。benchmark 测试中比对的 specificity 与 sensitivity（见 Box 5.4）可以用 Cline shift score（Cline et al. 2002）和 QModeller score（Sauder et al. 2000）来量化，因为这些指标会把错误对齐的残基纳入考虑。

BAliBASE 3.0、SABmark 或 OXBench 这类 benchmark 中的最大序列数大约在 100 条量级。如果需要比对成千上万甚至数百万条序列，这些 benchmark 都无法考察 MSA 软件的性能。增加可比对序列数量的一种方法，是把一组已有可靠比对的序列，与一些没有可靠比对的序列混合。OXBench 的“extended dataset”（扩展数据集）采用了这种做法，其中某些家族的数据集包含 1000 条以上序列。PREFAB（Edgar 2004）从一开始就是按这一原则设计的。PREFAB 包含 1682 个由两条序列构成的参考比对；在每个参考比对中，会额外加入 0 到 48 条非参考序列（中位数 48，平均数 45.2）。软件会对完整序列集合（最多 50 条序列）进行比对。不过，比对质量只能根据两条参考序列之间的比对来评估。一个名为 qscore 的通用打分程序，可从发布 PREFAB 和 MUSCLE 的同一网站获得。

HomFam（Blackshields et al. 2010; Sievers et al. 2013）是一种把序列数量扩展到数万条级别的 benchmark。它基于与 PREFAB 类似的原则：把少量已有可靠比对的序列，与大量尚无可靠比对但同源的序列混合在一起。参考比对来自 Homstrad 结构比对数据库（Mizuguchi et al. 1998），而大部分序列来自 Pfam（Finn et al. 2014）。参考比对包含 5 到 41 条序列；Pfam 序列数则在约 100 到 100000 条之间变化。2013 年版 HomFam 数据集包含 95 个家族。

近年来，研究者设计出一类新的 benchmark。它们可以测试面对任意大规模序列数量的 aligner，只依赖少量参考序列，并且评估比对中所有序列的对齐情况，包括非参考序列。第一个这类 benchmark 是 ContTest（Fox et al. 2016）。在 ContTest 中，MSA 被用于检测比对列之间的 co-evolution（共进化），并据此生成 contact map（接触图）预测（Marks et al. 2011）。随后，将预测接触图与嵌入其中的参考序列的观测接触图进行比较。预测图与观测图的一致程度，可作为比对质量的 proxy（代理指标）。只有当比对的信息量足够大时，才可能检测到共进化；也就是说，比对中的序列数至少应与参考序列中的残基数相当。实践中，序列数最好达到残基数的五倍。因此，对于典型蛋白结构域，如果少于 1000 条序列，ContTest 的效果通常不会很好。

另一个同类 benchmark 是 QuanTest（Le et al. 2017）。在这种方法中，MSA 被用于预测二级结构（Drozdetskiy et al. 2015），随后将预测得到的二级结构与一个或多个嵌入参考序列的真实二级结构进行比较。一般来说，二级结构预测准确度会随着已比对序列数量的增加而提高；但在 200 条序列时，已经可以得到有用的预测。因此，相比 ContTest，QuanTest 更适用于规模较小的比对。

第 8 章 多序列比对 / 构建比对：实践问题

下一节将介绍的多数自动比对程序，在处理彼此相似的序列时通常能够生成质量较好的比对。然而，即使用上最好的比对工具，要为高度分化的序列构建良好的多序列比对，仍然是一项需要专业判断的工作。本节概述为了得到适合结构/功能预测的比对，通常需要经历的一些步骤。这不是一个通用配方，因为每一组序列都有自身的问题，只有经验才能指导高质量比对的构建。

构建多序列比对的关键步骤如下：

• 通过数据库搜索或其他方式找到需要比对的序列。
• 确定每条序列中应纳入比对的区域。不要尝试对长度差异很大的序列直接进行多序列比对。多数多序列比对程序是为“整条序列范围内彼此相似”的序列设计的，因此，应先根据序列数据库搜索提示的相似区域，对序列进行裁剪，只保留这些区域。一些数据库搜索工具可以帮助识别这类区域（例如 PSI-BLAST；Altschul et al. 1997）。
• 运行多序列比对程序。
• 检查比对中是否存在问题。尤其要注意那些看起来被 gap 零散打断的区域。使用 alignment visualization tool（比对可视化工具，例如 Jalview 或 SeaView；见“Viewing a Multiple Alignment”）来识别在整个比对中保持理化性质保守的位置。如果找不到这类区域，就需要查看序列的不同子集。
• 移除那些明显严重扰乱比对的序列，然后对剩余子集重新比对。
• 在容易比对的序列集合中识别出关键残基之后，再尝试把其余序列加入比对，同时尽量保留该家族的关键特征。

除第一步数据库搜索以外，上述所有步骤都可以在 Jalview 程序中完成（见“Viewing a Multiple Alignment”）。Jalview 把强大的比对编辑和子集选择功能，与八种多序列比对算法的集成访问结合在一起。另一种做法是，使用下文介绍的许多程序所提供的网站：用户可以把一组序列粘贴到网页窗口中，或上传含有标准文件格式序列的文件。对于偶尔使用而言，这种方式很方便，而且许多网站的使用方式相对直观。特别推荐 European Bioinformatics Institute（EBI）的工具服务器，它允许在线使用最常用的 MSA 软件包。

有些服务器会限制一次能够比对的序列数量；也有可能用户需要生成数百个比对。在这些情况下，用户可以在服务器或台式机上本地运行这些比对程序。此时，熟悉 Linux 操作系统的基本使用就变得很重要。所有常用比对软件包都可以通过所谓的“command-line input”（命令行输入）运行：用户在终端窗口的提示符后输入程序名称（例如 clustalo），再跟上输入和输出相关指令。下文将给出多数常用多序列比对软件包在 Linux 命令行操作中的基本用法。

第 8 章 多序列比对 / 常用比对软件包 — Part 1：Clustal Omega

本节介绍如何使用一系列常用软件包构建多序列比对。关于源代码下载或在线使用的汇总信息，见本章“Internet Resources”。

Clustal Omega

Clustal Omega（Sievers et al. 2011）是 Clustal MSA 软件套件的最新成员，可用于氨基酸序列和核苷酸序列。它几乎是对前代 ClustalW2（Larkin et al. 2007）的彻底重写。与 ClustalW2 相比，Clustal Omega 的主要改进包括：能够在更短时间内比对数量远多于 ClustalW2 的序列；根据基于晶体结构的 benchmark 衡量，通常能产生更准确的比对；并且能够把关于最终比对总体结构的先验知识纳入计算。Clustal Omega 是一个命令行驱动程序，已经成功编译到 Linux、Mac 和 Windows 平台。与前代不同，Clustal Omega 没有 graphical user interface（GUI，图形用户界面）；不过，许多优秀的比对可视化程序（如 SeaView；Gouy et al. 2010；Jalview；Waterhouse et al. 2009），以及 European Molecular Biology Laboratory（EMBL）-EBI bioinformatic web and programmatic tools framework、Max Planck Bioinformatics Toolkit、Pasteur Institute 的 Galaxy server 等在线服务器，可以弥补这一不足。

Clustal Omega 是一种 progressive aligner（渐进式比对程序）。它使用 guide tree（引导树）来指导多序列比对；这个 guide tree 由序列之间的成对距离矩阵计算得到。对于 N 条序列，这需要进行 N × N 次序列比较，并存储一个 N × N 距离矩阵。过去，这一步通常是阻止传统 aligner 比对大量序列的瓶颈。实际限制大约在 10000 条序列或更少。不过，Clustal Omega 默认并不计算全对全距离矩阵，而是使用 mBed 算法（Blackshields et al. 2010）。mBed 会计算所有序列相对于少量随机选择的“seed”（种子）序列的距离矩阵。因此，mBed 算法的计算需求并不随 N 呈平方增长，而是按 N × log(N) 增长。

Clustal Omega 使用 mBed 距离矩阵对序列进行 k-means 聚类。默认情况下，每个 cluster（簇）的大小上限为 100 条序列。程序会为各个 cluster 生成小的 guide tree，并为这些 cluster 构建一个总的 guide tree。默认 cluster 大小上限设为 100，是因为当时典型比对规模通常不超过 10000 条序列，这样最多会有 100 个大小为 100 的 cluster；对于更大的比对，可以通过设置 --cluster-size flag 调整 cluster 大小。尽管较小的距离矩阵看似减少了信息量，但使用 mBed guide tree 生成的比对，质量通常与基于全对全距离矩阵的比对相当，甚至更高。若需要完整距离矩阵计算，可以用 --full flag 关闭 mBed 模式。

在 progressive alignment 启发式策略的主比对步骤中，单条序列先被比对形成 subalignment（子比对），较小的 subalignment 再彼此比对，逐步形成越来越大的 subalignment。在 Clustal Omega 中，这些成对比对由 hhalign（Söding 2005）执行。该程序会把单条序列和小的 subalignment 转换成 hidden Markov models（HMMs，隐马尔可夫模型），然后以成对方式比对这些 HMM。

Clustal Omega 的文件输入/输出过程使用 Sean Eddy 的 squid library，因此能够读写多种常用序列格式，如 a2m/FASTA、Clustal、msf、PHYLIP、selex、Stockholm 和 Vienna。默认输出格式为 FASTA。最小 Clustal Omega 命令行如下：

clustalo -i <infile> -o <outfile>

其中，<infile> 是包含待比对序列的文件占位符，文件格式应为程序可识别的格式之一；<outfile> 是保存已比对序列的输出文件占位符，输出为 FASTA 格式。

Iteration

Clustal Omega 能够对比对进行 iterative refinement（迭代优化）。在初始比对阶段，距离基于未比对序列的 k-mer 计算。在迭代优化过程中，距离则基于完整比对计算。这样做的期望是，完整比对距离能更好地反映序列之间的相似性，因此会生成“更好”的 guide tree，并进一步产生更好的比对。Clustal Omega 还会把初始比对转换为一个 HMM，然后在后台将该 HMM 与单条序列和 subprofile（子 profile）比对，使 Clustal Omega 能够“预判”其他序列将如何、在何处与其对齐。这里所谓“预判”的具体方法，是把初始比对 HMM 中的 pseudocount（伪计数）信息转移到需要重新比对的序列和 subalignment 中；Sievers 等（2011）对此过程有更详细说明。

序列比对在 progressive alignment 的早期阶段尤其容易发生错配，因此转移到单条序列和小 subalignment 的 pseudocount 信息可能较大。随着 progressive alignment 后期 subalignment 逐渐增大，应该已经积累了足够多的“真实”信息，因此 pseudocount 转移可以相应缩小。对于包含 100 条或更多序列的 subprofile，实际上不会发生 pseudocount 转移。比对原则上可以被无限次优化；不过，经验表明，一到两轮迭代通常能明显提高比对质量。超过两轮迭代很少有用，应根据具体情况决定是否使用。执行迭代比对的最小命令如下：

clustalo -i infile.fa -o outfile1.fa --iter=1

其中，infile.fa 和 outfile1.fa 分别是 FASTA 格式输入文件和输出文件的名称。

需要注意，迭代会带来性能代价。每一轮迭代都需要额外执行三次比对：第一和第二个 subalignment 需要分别与背景 HMM 比对；随后，两个加入了 pseudocount 背景信息的 subalignment 还需要彼此比对。一轮迭代比对大约需要初始比对四倍的时间；两轮迭代比对大约需要原始比对七倍的时间。

迭代过程中，初步比对会被转换为 HMM，随后用这个 HMM 生成质量更高的比对。HMM 信息也可以从外部生成。如果已知待比对序列的类型，可能已经存在预先计算好的 HMM。例如，Pfam（Finn et al. 2016）包含大量蛋白质家族、比对及其 HMM。如果已知待比对序列与 Pfam 中某个家族同源，就可以从 Pfam 下载相应 HMM，并将其作为额外命令行参数使用：

clustalo -i infile.fa -o outfile4.fa --hmm-in=pfam.hmm

其中，pfam.hmm 是从 Pfam 下载的 HMM，包含与 infile.fa 中序列同源的蛋白质家族的比对信息。另一种做法是，使用 HMMER（Finn et al. 2011）从本地产生的比对生成 HMM。

Benchmarking Clustal Omega

评估一个多序列比对程序的性能时，需要考虑几个问题。比对软件能否处理输入序列的数量？比对过程需要多长时间？这种比对能否扩展到更多序列，或更长序列？与已知三维结构序列的标准比对相比，这些比对有多准确？不同 aligner 在这些方面表现各不相同。有些 aligner 在小规模序列集合上非常快，但当序列数超过几百时，会需要不切实际的运行时间。不过，这些较慢 aligner 中有些在 benchmark 上可能非常准确。相反，有些 aligner 能够处理极大数据集，但会牺牲一定准确度。本节将从计算时间、比对准确度，以及处理长序列或大量序列的能力等方面，把 Clustal Omega 与若干常用比对软件包进行比较。后续小节会详细说明这些比对软件包及其使用方法。

图 8.3 和表 8.1 给出了使用成熟 BAliBASE3 benchmark（Thompson et al. 2005）得到的结果。在这里，准确度用 218 个 benchmark 比对中的比对列比例来衡量，并在表中表示为 TC score。Clustal Omega 既不是最快的比对软件包，也不是最准确的比对软件包；但它比所有更快的 aligner 都更准确。唯一获得更高 TC score 的 aligner，是 MAFFT 软件包中的 L-INS-i（Katoh et al. 2005a,b）（图 8.3）。图 8.3 给出了 BAliBASE3 的总运行时间和整体准确度分数。BAliBASE3 被划分为若干比对类型子类别，其各自结果见表 8.1。

图 8.3

使用 BAliBASE3 benchmark 比较 aligner 准确度与单线程总运行时间。时间为所有 218 个测试比对的总和，total column（TC）score 为平均值。x 轴（时间）为对数尺度，y 轴（TC Score）为线性尺度。数据点对应 aligner 默认设置。额外数据点包括 Clustal Omega（i1：更准确模式）、MUSCLE（i2：快速模式）和 PASTA（m 表示以 MUSCLE 为 subaligner；w 表示以 ClustalW2 为 subaligner）。数据点对应表 8.1 的第 8 和第 9 列。

表 8.1 BAliBASE3 benchmark 上的 aligner 性能

第 2–7 列（BB11–BB5）为各层级参考集合的平均 total column（TC）score；第 8 列（all）为全部 218 个测试比对的平均 TC score。第 9 列（time）为所有 218 个测试比对的总单线程运行时间。第 10 列（RSS）为最大内存需求；第 11 列（rss）为平均内存需求。第 8/9 列（all/time）对应图 8.4。最后一行给出每个层级集合中的测试比对数量。

表 8.1 的性能度量基于固定大小的数据集。图 8.4 则绘制了多种 MSA 算法在待比对序列数量增加时的运行时间；所用数据来自 Pfam（Finn et al. 2014）的三组不同长度序列。柱形对应一个很短的蛋白结构域（zf-CCHH，平均长度 23 个氨基酸）、一个中等长度结构域（rvp，平均序列长度 93），以及一个长蛋白结构域（RuBisCO_large，长度 248）。图 8.4 使用双对数图展示结果。较平缓的曲线代表扩展性较好，也就是说，待比对序列数增加时，计算时间只会适度增加。陡峭曲线则代表扩展性较差，使用越来越大的序列集合时，计算时间会快速增加。Clustal Omega 的结果用红色柱（底部为 zf-CCHH，顶部为 RuBisCO_large）和圆点（rvp）表示。对于 20–1000 条序列的数据集，Clustal Omega 慢于 Kalign（品红色圆点）、默认 MAFFT（深蓝色圆点）或快速 MUSCLE（绿色方块）。由于扩展性更好，Clustal Omega 在 N = 2000 时超过快速 MUSCLE 和 Kalign，并在 N = 20000 时超过默认 MAFFT。MAFFT PartTree（深蓝色方块）在所有数据集上都始终快于 Clustal Omega。

图 8.4

随着序列数量（x 轴）增加，不同 aligner 的总单线程执行时间（y 轴）。两个坐标轴均为对数尺度。须状线表示从短序列（下须：zf-CCHH/PF00096，长度 23–34 个残基）到长序列（上须：RuBisCO_large/PF00016，长度 295–329 个残基）的时间范围。实线连接中等长度序列的时间点（rvp/PF00077，长度 94–124）。

Clustal Omega 中，progressive alignment 启发式策略的两个主要阶段（即距离计算和成对比对）都已经并行化。一个比对可以分配到同一台计算机的不同核心上，但不能分配到不同计算机之间。距离矩阵计算是一项容易并行化的任务。相比之下，成对比对阶段很难有效并行化。如图 8.5 所示，Clustal Omega 在使用 2、3 或 4 个线程时可以获得较好的加速；但只有当序列数量非常大时，更多线程才有用。Clustal Omega 的并行化是“thread-safe”（线程安全）的：使用一个线程生成的比对，保证与使用多个线程生成的比对相同。

图 8.5

使用不同线程数（x 轴）时，总运行时间相对于单线程执行的比值（y 轴）：(a) 100 条序列；(b) 500 条序列；(c) 1000 条序列；(d) 10000 条序列。Def 表示程序默认设置。L-INS-i (t) 表示该程序的非线程设置。

第 8 章 多序列比对 / 常用比对软件包 — Part 2：ClustalW2 / DIALIGN / Kalign / MAFFT

ClustalW2

ClustalW2（Larkin et al. 2007）是 Clustal Omega 的前代，源自一系列可追溯到 20 世纪 80 年代的程序。它通常比 Clustal Omega 慢，能够比对的序列数量也较少，而且产生的比对质量往往较低。它也不能通过使用多个线程来加速。自 2010 年以来，其代码库已经冻结，ClustalW2 不再处于活跃开发状态。虽然 ClustalW2 仍可在 Pasteur Galaxy server 上作为在线工具使用，但 EBI 和 Max Planck Bioinformatics Toolkit 已不再提供它。ClustalW2 是若干 Linux 发行版的一部分（例如 Ubuntu；代码和可执行文件也可从 Clustal 网站获得）。本书仍介绍 ClustalW2，是因为它仍然被广泛使用，而且其 GUI 使它成为一个非常易用、直观的程序。与 Clustal Omega 不同，它既可以在终端中交互式运行，也可以通过称为 ClustalX 的 GUI 运行。不过，本节只说明如何从命令行使用 ClustalW2。

ClustalW2 也是一种 progressive aligner（渐进式比对程序），并且总是计算完整的 N × N 距离矩阵，其中 N 是待比对序列的数量。这实际上限制了 ClustalW2 能在合理时间内比对的序列数量。本书这里没有尝试比对超过 5000 条序列。名称 ClustalW 中的 “W” 来自 weighting scheme（加权方案），用于降低过度代表序列的权重。

ClustalW2 会自动识别七种输入序列文件格式：NBRF-PIR、EMBL-SWISSPROT、Pearson（FASTA）、Clustal、GCG-MSF、GCG9-RSF 和 GDE。比对输出默认为 Clustal 格式，但也可以选择 GCG、NBRF-PIR、PHYLIP、GDE、NEXUS 或 FASTA。最小 ClustalW2 命令行如下：

clustalw2 -INFILE=infile.fa

该命令会读取 infile.fa 中的序列，检测文件格式，推测序列是核苷酸还是蛋白质，随后比对这些序列，并把 Clustal 格式的比对写入 infile.aln。输入文件名的 stem（主干；本例为 infile）会被保留，文件扩展名（本例为 .fa）会被去掉，然后追加扩展名 .aln。ClustalW2 默认还会把 Newick 格式的 guide tree（引导树）输出到一个以 .dnd 结尾的文件中。程序会向 standard output（标准输出）打印 progress report（进度报告），其中包含未比对序列之间的距离和中间 subalignment（子比对）分数。对于大量序列，这可能耗费时间和内存，因此可以通过设置 -QUIET flag 抑制。如果希望把比对写入不同于默认名称的文件，可以设置 -OUTFILE flag。输出格式可通过设置 -OUTPUT flag 指定，如下所示：

clustalw2 -INFILE=infile.fa -OUTFILE=output.a2m -OUTPUT=fasta

这里，infile.fa 中未比对序列的比对结果会以 FASTA 格式写入文件 output.a2m。

在标准蛋白质 benchmark BAliBASE3 上，ClustalW2 速度中等，慢于 Clustal Omega、默认 MAFFT 和 Kalign。它的执行时间与默认 MUSCLE 大致相同，但快于 PRANK、T-Coffee 和 PASTA。然而，从 TC score 衡量的准确度来看，ClustalW2 是这里考察的所有 aligner 中最差的，这一点可从图 8.3 看出。

对于少量序列，ClustalW2 是本次比较中最节省内存的 aligner 之一。然而，它的时间和内存需求随序列数量的平方增长。因此，在配备 8GB RAM 的 benchmark 机器上，我们无法把序列数量范围扩展到 5000 以上；这一点可从图 8.4 中的橙色圆点看出。

DIALIGN

如果待比对序列在全长范围内显然可以对齐，progressive alignment 算法是合适的。然而，如果序列之间只有局部相似性，除此之外并无关系，那么这种算法可能并不适用。例如，如果若干序列只共享一个短蛋白结构域，而其余部分完全无关，那么用 Clustal Omega 这样的标准 progressive aligner 很难完成比对。DIALIGN（Morgenstern et al. 1998）并不尝试匹配单个残基，而是匹配残基片段。这些片段内部没有 gap，并且在所有待比对序列中长度相同。片段内部虽然没有 gap，但允许 mismatch（错配）。程序会考虑不同长度的片段，但通常使用 10 作为下限阈值。只有在能够保持一致性时，多个片段才会被对齐；也就是说，任何一个片段都不能与另一条序列中的多个片段对齐，并且所有序列中的所有片段都必须保持相同顺序。这种 consistency scheme（一致性方案）早于 T-Coffee 中实现的方案（Notredame et al. 2000）。DIALIGN 的典型命令行是：

dialign2 -fa input.in

其中，input.in 是包含待比对未比对序列的文件。比对后的输出会写入一个与输入文件同名、但额外添加 .fa 扩展名的文件。

使用 BAliBASE3 benchmark 数据集时，DIALIGN 快于 T-Coffee、PASTA 和 PRANK，但慢于所有其他 aligner。DIALIGN 的 TC score 相对较低，但优于 ClustalW2 和 PRANK。DIALIGN 的运行时间需求在所有 aligner 中最高（图 8.4）。DIALIGN 的内存需求最初较低，但看起来会随序列数量呈平方增长（图 8.5）。已有一个 DIALIGN 版本实现了并行化（Schmollinger et al. 2004）。

Kalign

Kalign2（Lassmann and Sonnhammer 2005）是一个 progressive MSA 程序。它使用 Muth–Manber string-matching algorithm（字符串匹配算法；Muth and Manber 1996）来建立生成 guide tree 所需的距离。在这里考察的所有程序中，这似乎是最快的距离计算算法。不过，Kalign2 中的距离矩阵计算会随序列数量呈平方扩展。Kalign2 支持 Clustal、PileUp、MSF、Stockholm、UniProt、Swiss-Prot 和 Macsim alignment formats。

最小 Kalign2 命令行如下：

kalign -in input.fa -out output.fa

该命令会把 input.fa 中未比对序列的比对结果，以默认 FASTA 格式写入 output.fa。此外，程序还会向 standard output 写出 progress report。

使用 BAliBASE3 benchmark 时，Kalign2 是这里考察的程序中速度最快的。按 TC score 衡量，它的准确度优于默认版本的 MAFFT、MUSCLE 和 ClustalW2，但不及 L-INS-i、Clustal Omega 或 T-Coffee（图 8.3）。不过，BAliBASE3 规模相对较小，序列数在 4 到 142 之间（中位数 21 条）。对于更大的序列数量，Kalign 的扩展性会抵消其高效实现带来的优势；在速度上，它会被 MAFFT（1000 条序列）、fast mode 下的 MUSCLE、Clustal Omega（2000 条序列）和 PASTA（20000 条序列）超过。

MAFFT

MAFFT（Katoh et al. 2005a,b）是一组不同 executable（可执行程序）的集合，由一个脚本管理；该脚本会根据序列数量、期望准确度和可用计算能力，选择一系列多序列比对程序。这里重点介绍三类： (i) 面向中大型数据集的通用默认 MAFFT aligner FFT-NS-i；(ii) 适用于几百条序列小数据集、准确度更高但速度更慢的 L-INS-i；以及 (iii) 能处理极大量序列的 PartTree。

当运行 MAFFT 而不指定特定 aligner 时，它会以默认模式运行。在默认模式中，MAFFT 会把氨基酸序列重新编码为 tuple（元组）序列，其中包含残基的体积和极性。使用 fast Fourier transform（FFT，快速傅里叶变换），可以高效计算两条序列的体积和极性的相关性。通过这种方式，程序能够识别序列中的同源区段。随后，这些部分使用传统 dynamic programming（动态规划）进行比对。该算法称为 FFT-NS-1。在默认模式中，MAFFT 会再重复一次这个过程（称为 FFT-NS-2），然后进行 iterative refinement（迭代优化），最终构成 FFT-NS-i。在 FFT-NS-2 期间产生的 MSA，会通过对序列中随机分组的各组进行重复成对比对而逐步优化。L-INS-i 使用 iterative refinement，也使用 alignment consistency（一致性；Notredame et al. 2000），后者是一种度量多序列比对与成对比对之间一致性的技术。这种方法可以非常准确，但通常随序列数量呈三次方扩展，因此主要适用于较小问题。另一方面，PartTree 是一种快速方法，能够快速构建 guide tree，从而处理包含数千条序列的数据集。

Default MAFFT

最小默认 MAFFT 命令行如下：

mafft input.fa > output.fa

MAFFT 不接受非标准氨基酸符号，例如 ambiguity codes（歧义代码）。如果序列信息中包含这类符号，应设置 --anysymbol flag。通过设置 --quiet flag，可以抑制写入 standard error（标准错误）的诊断输出。

在 BAliBASE3 上，默认 MAFFT 是仅次于 Kalign2 的第二快 aligner，TC score 略低于 Kalign2，与默认 MUSCLE 相当，并远高于 ClustalW2。其内存消耗一直较高。所有 MAFFT 策略都已经并行化，并且最多使用 4 个线程时加速效果良好。超过这一数量后，只有在序列数量非常大时才会获得有用加速。默认 MAFFT 是 thread-safe（线程安全）的，也就是说，使用一个线程生成的比对，保证与使用多个线程生成的比对相同。这意味着多线程模式下的比对结果是可重复的。

L-INS-i

L-INS-i 是高准确度 MAFFT 程序，因此 throughput（吞吐量）低于默认版本。最小 MAFFT L-INS-i 命令行可以用以下两种方式之一书写：

linsi input.fa > output.fa

或：

mafft --localpair input.fa > output.fa

在这里考察的所有程序中，MAFFT L-INS-i 在 BAliBASE3 benchmark 上获得最高 TC score（图 8.3）。它的执行时间慢于 MUSCLE 和 Clustal Omega，与一轮迭代的 Clustal Omega 相当，并快于 T-Coffee 和 PASTA。MAFFT L-INS-i 的多线程执行加速效果是所有程序中最好的。不过，MAFFT L-INS-i 不是 thread-safe。这意味着使用不同线程数运行时，结果可能不同。即使使用相同线程数，不同运行之间的结果也可能不同。

PartTree

最小 MAFFT PartTree 命令行如下：

mafft --parttree input.fa > output.fa

PartTree 是高吞吐量 MAFFT 程序，不预期它在 BAliBASE3 这样的小 benchmark 上表现很好。它比 MAFFT 默认版本更慢、准确度也更低。图 8.4 中的数据表明，当序列数超过 200 时，PartTree 始终是最快的 aligner。Clustal Omega 具有相似的扩展性（图 8.4），但 overhead（开销）更高。对于超过 2000 条序列的数据集，PartTree 也是最节省内存的算法。在所有 MAFFT 版本中，都可以通过设置 --treeout flag 写出 guide tree。不过，在 PartTree 中，序列标识符会被替换为该序列在输入文件中出现位置的整数索引。PartTree guide tree 也可能包含 multifurcation（多分叉）。与所有 MAFFT 版本一样，PartTree 可以读入外部 guide tree；不过，其文件格式是 MAFFT 专用格式。输入必须先由名为 newick2mafft.rb 的工具程序从标准格式 guide tree 生成；该程序是 MAFFT 发行版的一部分。PartTree 是 thread-safe 的；不过，使用超过一个线程并没有有用的加速效果。

第 8 章 多序列比对 / 常用比对软件包 — Part 3：MUSCLE / PASTA / PRANK / T-Coffee

MUSCLE

MUSCLE（Edgar 2004）是一个 progressive MSA 程序。在第一阶段，它基于快速 k-tuple vector comparison（k 元组向量比较）计算未比对序列之间的距离矩阵。随后，这些距离使用 UPGMA cluster analysis（聚类分析；Sokal and Michener 1958）进行聚类。该阶段会产生一个初始比对，随后可在第二个迭代步骤中加以改进。第二步与第一步相似，唯一区别在于使用 alignment-based distances（基于比对的距离；Kimura 1983），而不是 k-tuple vector comparison。在后续一轮 iterative refinement（迭代优化）中，第二阶段比对可以通过以下方式改进：将第二阶段 guide tree 切成两部分，重新比对每个 subtree 中的序列，然后比对两个 subprofile（称为 tree-dependent restricted partitioning，依赖树的受限划分）。如果新的比对提高了 alignment score（比对分数），则接受该新比对。默认情况下，这些 refinement 会执行 14 次，因此总共会进行 16 轮比对。

最小 MUSCLE 命令行如下：

muscle -in input.fa -out output.fa

该命令会执行最初两轮比对（分别基于 k-tuple 和 alignment distance），随后执行 14 轮 iterative refinement。如果序列数量很大，可以在命令中加入一个额外项来指定最大迭代次数，从而跳过 iterative refinement：

muscle -in input.fa -out output.fa -maxiters 2

使用 BAliBASE3 benchmark 时，默认 MUSCLE 的准确度（按 TC score 衡量）与默认 MAFFT 相当；它略快于 ClustalW2，略慢于 Clustal Omega。Fast MUSCLE 只执行前两个比对阶段，速度大约比默认版本快一个数量级。使用 BAliBASE3 时，它快于 Clustal Omega，但仍不及默认 MAFFT 或 Kalign2 快。不过，相比默认版本，它的准确度会下降。在图 8.4 的大规模测试中，对于 5000 条和 20000 条序列，MUSCLE 分别在默认模式和 fast mode 下超出了本测试平台可用内存。Fast MUSCLE 的运行时间一开始快于 Clustal Omega、慢于 Kalign2；随后在速度上超过 Kalign2，又在 2000 条序列时被 Clustal Omega 超过。由于 iterative refinement 会重新划分 guide tree，但不会重新生成 guide tree，因此默认版本和 fast 版本的 guide tree 总是相同的。MUSCLE 没有并行版本。

PASTA

PASTA（Practical Alignments using SATé and TrAnsitivity；Mirarab et al. 2015）是一个 Python 脚本，会调用现有软件包，例如 SATé（Liu et al. 2009）、MAFFT、MUSCLE、ClustalW、HMMER（Eddy 2009）、OPAL（Wheeler and Kececioglu 2007）和 FastTree-2（Price et al. 2010），并组合它们的结果。第一步中，程序会从输入数据集中随机选择少量序列并进行比对。PASTA 的默认 aligner 是 MAFFT L-INS-i。这个初始比对称为 “backbone”（骨架），并使用 HMMER 转换为 HMM。剩余序列随后会被比对到这个 HMM 上。接着，程序使用 FastTree 从该比对构建一个初始 maximum likelihood（ML，最大似然）tree。然后根据这棵树对序列进行聚类，使 cluster 大小保持较小。随后，使用默认 aligner 比对各个 cluster，形成 subalignment。在整体 spanning tree（生成树）中彼此“相邻”的 subalignment 会使用 OPAL 进行比对，形成 subalignment pair。不同 subalignment pair 最后被合并，产生整体比对。

PASTA 默认期待输入核苷酸序列。对于蛋白质序列，最小 PASTA 命令行如下：

python run_pasta.py --input=input.fa --datatype=Protein

使用 BAliBASE3 benchmark 时，默认 PASTA 快于 T-Coffee 和 PRANK，但慢于所有其他 aligner。PASTA 的准确度与底层 subalignment 软件的准确度密切相关。可以通过指定参数来更换这个 aligner，例如 --aligner=muscle 或 --aligner=clustalw2。如果像默认设置一样使用 L-INS-i 这种更准确的 aligner，PASTA 比对会更准确；如果使用 MUSCLE 这样的 aligner，质量为中等；如果使用 ClustalW2，PASTA 会产生最差的比对。不过，在 BAliBASE3 上，PASTA 比对从未真正达到或超过底层 subalignment 软件本身的质量。图 8.3 可以看出这一点：PASTA 的数据点位于相应 subaligner 数据点的右侧（更慢）和下方（更不准确）。这并不令人意外，因为用少量蛋白质序列比对已经证明，ML phylogenetic trees（最大似然系统发育树）不一定是好的 guide tree，而且经常是明显糟糕的 guide tree（Sievers et al. 2014）。

不过，PASTA 并不是为比对少量序列而设计的。使用大规模 benchmark 数据时，它一开始（20 条序列）是仅次于 PRANK 的第二慢 aligner；但由于时间扩展性较好，它在 500 条序列时超过 L-INS-i，在 5000 条序列时超过默认 MUSCLE 和 ClustalW2，并在 20000 条序列时超过 Kalign2。它的内存消耗也以类似方式扩展。

PASTA 已经并行化。默认情况下，它会尝试使用所有可用线程。可以通过为 --num_cpus flag 指定参数来改变线程数。随着线程数增加，PASTA 表现出良好加速；随着序列数量增加，这种效果会更明显，如图 8.5 所示。然而，这里考察的 PASTA 版本并不是 thread-safe（线程安全）的。这意味着比对结果会因线程数不同而不同。也许更令人不安的是，使用超过一个线程时，结果无法复现。PASTA 默认模式使用非 thread-safe 的 L-INS-i；即使使用只能单线程运行的 MUSCLE 作为 subaligner，也同样存在这个问题。对于后一种情况，在一个具体例子中，如果使用 3 个线程把同一组 100 条 rvp 序列（平均长度 106.5，最长序列 124）比对 10 次，比对长度可在 159 到 183 之间变化。在这个例子中，6 条 rvp 参考序列核心列的 TC score 在 0.433 到 0.556 之间变化。因此，为了让结果可复现，应该总是设置 --num_cpus=1。

PRANK

在两条单独序列的 pairwise alignment 中，无法判断某条序列中的 gap 是由该序列中的 deletion（缺失）造成，还是由另一条序列中的 insertion（插入）造成。然而，在 MSA 中，这一区分可能变得重要，尤其是在 phylogenetic analysis（系统发育分析）中。大多数 progressive aligner 会低估真实 insertion 事件数量，并可能产生人为偏短的比对。PRANK（Löytynoja and Goldman 2005）尝试通过执行 phylogeny-aware gap placement（系统发育感知的 gap 放置）来处理这一问题。因此，如果研究者关心对所有 gap 位置进行谨慎估计，PRANK 可能会有用。本节所述这类基于结构的 benchmark 无法恰当地检验 PRANK；它在这些 benchmark 上表现较低，并不意味着它在其他情形中没有用。

PRANK 的最小命令行如下：

prank -d=infile.fa -o=outfile -f=fasta

使用 BAliBASE3 benchmark 时，PRANK 是最慢的 aligner；除 ClustalW2 外，它获得的 TC score 也是最低的（图 8.3）。这并不奇怪，因为传统的基于结构的 benchmark 奖励 compact alignment（紧凑比对），并且可能没有充分惩罚 over-alignment（过度比对）。需要注意的是，PRANK 只读取标准 IUPAC codes（每种氨基酸或碱基对应唯一字母），并将所有非 IUPAC 字符（例如 ambiguity codes）替换为 N 或 X。因此，把比对结果与未比对数据或 reference alignment 比较时，可能会出现差异。

Scalability benchmark 表明，对于少量序列，PRANK 是较慢的 aligner。不过，在所有 aligner 中，PRANK 的 time complexity（时间复杂度）是最低的一类：超过 100 条序列后，PRANK 会超过 T-Coffee；超过 1000 条序列后，会超过 MAFFT L-INS-i（图 8.4）。它的内存需求也呈现类似趋势，并预计在 5000 条序列后超过本测试平台可用内存。

T-Coffee

T-Coffee 最初是一种 progressive alignment heuristic method，用于优化 MSA 的 Coffee objective function（目标函数；Notredame et al. 1998）。该函数会寻找一个 MSA，使不同序列残基之间的加权成对匹配之和最大。这些 pairwise match（成对匹配）可以来自 pairwise alignment、已有 MSA、蛋白质结构叠合中的对应残基，或 RNA 结构比对中的已对齐残基。因此，T-Coffee 能够合并来自未比对序列、不同 MSA 软件包、结构比对或这些来源混合的信息。Notredame 等（2000）首次描述了 MSA consistency（一致性）：若序列之间的 pairwise residue match 与其他序列对中的 pairwise match 一致，则会被赋予更高权重。这有助于绕开 progressive alignment 内在的贪心性质，并被证明能产生非常准确的比对。后来，Consistency 被纳入 Probcons（Do et al. 2005）和 MAFFT（Katoh et al. 2005a,b）软件包。它会增加比对的计算复杂度，主要适用于少于 1000 条序列的比对，但能显著提高比对准确度。

T-Coffee 的最小命令行如下：

t_coffee -in infile.fa -output fasta

该命令会生成一个名为 infile.fasta_aln 的 FASTA 格式比对文件。

使用 BAliBASE3 benchmark 时，T-Coffee 是仅次于 PRANK 的第二慢 aligner。不过，如图 8.3 所示，它的平均 TC score 属于最高的一组，优于 PASTA、Kalign 和 MUSCLE。T-Coffee 的平均内存消耗最高。由于 T-Coffee 基于 consistency 原理，其相对于序列数量的时间复杂度预期较高。我们无法把序列数量范围扩展到 1000 以上，因为 T-Coffee 用尽了可用的 8GB RAM。在并行化方面，T-Coffee 是完全 thread-safe 的。这意味着比对结果不依赖处理器数量；处理器数量可通过指定 -n_core flag 设置。比对结果也可复现。因此，T-Coffee 是在仍保持 thread-safe 的前提下并行加速效果最好的 aligner。

第 8 章 多序列比对 / 常用比对软件包 — Part 1：Clustal Omega

本节介绍如何使用一系列常用软件包构建多序列比对。关于源代码下载或在线使用的汇总信息，见本章“Internet Resources”。

Clustal Omega

Clustal Omega（Sievers et al. 2011）是 Clustal MSA 软件套件的最新成员，可用于氨基酸序列和核苷酸序列。它几乎是对前代 ClustalW2（Larkin et al. 2007）的彻底重写。与 ClustalW2 相比，Clustal Omega 的主要改进包括：能够在更短时间内比对数量远多于 ClustalW2 的序列；根据基于晶体结构的 benchmark 衡量，通常能产生更准确的比对；并且能够把关于最终比对总体结构的先验知识纳入计算。Clustal Omega 是一个命令行驱动程序，已经成功编译到 Linux、Mac 和 Windows 平台。与前代不同，Clustal Omega 没有 graphical user interface（GUI，图形用户界面）；不过，许多优秀的比对可视化程序（如 SeaView；Gouy et al. 2010；Jalview；Waterhouse et al. 2009），以及 European Molecular Biology Laboratory（EMBL）-EBI bioinformatic web and programmatic tools framework、Max Planck Bioinformatics Toolkit、Pasteur Institute 的 Galaxy server 等在线服务器，可以弥补这一不足。

Clustal Omega 是一种 progressive aligner（渐进式比对程序）。它使用 guide tree（引导树）来指导多序列比对；这个 guide tree 由序列之间的成对距离矩阵计算得到。对于 N 条序列，这需要进行 N × N 次序列比较，并存储一个 N × N 距离矩阵。过去，这一步通常是阻止传统 aligner 比对大量序列的瓶颈。实际限制大约在 10000 条序列或更少。不过，Clustal Omega 默认并不计算全对全距离矩阵，而是使用 mBed 算法（Blackshields et al. 2010）。mBed 会计算所有序列相对于少量随机选择的“seed”（种子）序列的距离矩阵。因此，mBed 算法的计算需求并不随 N 呈平方增长，而是按 N × log(N) 增长。

Clustal Omega 使用 mBed 距离矩阵对序列进行 k-means 聚类。默认情况下，每个 cluster（簇）的大小上限为 100 条序列。程序会为各个 cluster 生成小的 guide tree，并为这些 cluster 构建一个总的 guide tree。默认 cluster 大小上限设为 100，是因为当时典型比对规模通常不超过 10000 条序列，这样最多会有 100 个大小为 100 的 cluster；对于更大的比对，可以通过设置 --cluster-size flag 调整 cluster 大小。尽管较小的距离矩阵看似减少了信息量，但使用 mBed guide tree 生成的比对，质量通常与基于全对全距离矩阵的比对相当，甚至更高。若需要完整距离矩阵计算，可以用 --full flag 关闭 mBed 模式。

在 progressive alignment 启发式策略的主比对步骤中，单条序列先被比对形成 subalignment（子比对），较小的 subalignment 再彼此比对，逐步形成越来越大的 subalignment。在 Clustal Omega 中，这些成对比对由 hhalign（Söding 2005）执行。该程序会把单条序列和小的 subalignment 转换成 hidden Markov models（HMMs，隐马尔可夫模型），然后以成对方式比对这些 HMM。

Clustal Omega 的文件输入/输出过程使用 Sean Eddy 的 squid library，因此能够读写多种常用序列格式，如 a2m/FASTA、Clustal、msf、PHYLIP、selex、Stockholm 和 Vienna。默认输出格式为 FASTA。最小 Clustal Omega 命令行如下：

clustalo -i <infile> -o <outfile>

其中，<infile> 是包含待比对序列的文件占位符，文件格式应为程序可识别的格式之一；<outfile> 是保存已比对序列的输出文件占位符，输出为 FASTA 格式。

Iteration

Clustal Omega 能够对比对进行 iterative refinement（迭代优化）。在初始比对阶段，距离基于未比对序列的 k-mer 计算。在迭代优化过程中，距离则基于完整比对计算。这样做的期望是，完整比对距离能更好地反映序列之间的相似性，因此会生成“更好”的 guide tree，并进一步产生更好的比对。Clustal Omega 还会把初始比对转换为一个 HMM，然后在后台将该 HMM 与单条序列和 subprofile（子 profile）比对，使 Clustal Omega 能够“预判”其他序列将如何、在何处与其对齐。这里所谓“预判”的具体方法，是把初始比对 HMM 中的 pseudocount（伪计数）信息转移到需要重新比对的序列和 subalignment 中；Sievers 等（2011）对此过程有更详细说明。

序列比对在 progressive alignment 的早期阶段尤其容易发生错配，因此转移到单条序列和小 subalignment 的 pseudocount 信息可能较大。随着 progressive alignment 后期 subalignment 逐渐增大，应该已经积累了足够多的“真实”信息，因此 pseudocount 转移可以相应缩小。对于包含 100 条或更多序列的 subprofile，实际上不会发生 pseudocount 转移。比对原则上可以被无限次优化；不过，经验表明，一到两轮迭代通常能明显提高比对质量。超过两轮迭代很少有用，应根据具体情况决定是否使用。执行迭代比对的最小命令如下：

clustalo -i infile.fa -o outfile1.fa --iter=1

其中，infile.fa 和 outfile1.fa 分别是 FASTA 格式输入文件和输出文件的名称。

需要注意，迭代会带来性能代价。每一轮迭代都需要额外执行三次比对：第一和第二个 subalignment 需要分别与背景 HMM 比对；随后，两个加入了 pseudocount 背景信息的 subalignment 还需要彼此比对。一轮迭代比对大约需要初始比对四倍的时间；两轮迭代比对大约需要原始比对七倍的时间。

迭代过程中，初步比对会被转换为 HMM，随后用这个 HMM 生成质量更高的比对。HMM 信息也可以从外部生成。如果已知待比对序列的类型，可能已经存在预先计算好的 HMM。例如，Pfam（Finn et al. 2016）包含大量蛋白质家族、比对及其 HMM。如果已知待比对序列与 Pfam 中某个家族同源，就可以从 Pfam 下载相应 HMM，并将其作为额外命令行参数使用：

clustalo -i infile.fa -o outfile4.fa --hmm-in=pfam.hmm

其中，pfam.hmm 是从 Pfam 下载的 HMM，包含与 infile.fa 中序列同源的蛋白质家族的比对信息。另一种做法是，使用 HMMER（Finn et al. 2011）从本地产生的比对生成 HMM。

Benchmarking Clustal Omega

评估一个多序列比对程序的性能时，需要考虑几个问题。比对软件能否处理输入序列的数量？比对过程需要多长时间？这种比对能否扩展到更多序列，或更长序列？与已知三维结构序列的标准比对相比，这些比对有多准确？不同 aligner 在这些方面表现各不相同。有些 aligner 在小规模序列集合上非常快，但当序列数超过几百时，会需要不切实际的运行时间。不过，这些较慢 aligner 中有些在 benchmark 上可能非常准确。相反，有些 aligner 能够处理极大数据集，但会牺牲一定准确度。本节将从计算时间、比对准确度，以及处理长序列或大量序列的能力等方面，把 Clustal Omega 与若干常用比对软件包进行比较。后续小节会详细说明这些比对软件包及其使用方法。

图 8.3 和表 8.1 给出了使用成熟 BAliBASE3 benchmark（Thompson et al. 2005）得到的结果。在这里，准确度用 218 个 benchmark 比对中的比对列比例来衡量，并在表中表示为 TC score。Clustal Omega 既不是最快的比对软件包，也不是最准确的比对软件包；但它比所有更快的 aligner 都更准确。唯一获得更高 TC score 的 aligner，是 MAFFT 软件包中的 L-INS-i（Katoh et al. 2005a,b）（图 8.3）。图 8.3 给出了 BAliBASE3 的总运行时间和整体准确度分数。BAliBASE3 被划分为若干比对类型子类别，其各自结果见表 8.1。

图 8.3

使用 BAliBASE3 benchmark 比较 aligner 准确度与单线程总运行时间。时间为所有 218 个测试比对的总和，total column（TC）score 为平均值。x 轴（时间）为对数尺度，y 轴（TC Score）为线性尺度。数据点对应 aligner 默认设置。额外数据点包括 Clustal Omega（i1：更准确模式）、MUSCLE（i2：快速模式）和 PASTA（m 表示以 MUSCLE 为 subaligner；w 表示以 ClustalW2 为 subaligner）。数据点对应表 8.1 的第 8 和第 9 列。

表 8.1 BAliBASE3 benchmark 上的 aligner 性能

第 2–7 列（BB11–BB5）为各层级参考集合的平均 total column（TC）score；第 8 列（all）为全部 218 个测试比对的平均 TC score。第 9 列（time）为所有 218 个测试比对的总单线程运行时间。第 10 列（RSS）为最大内存需求；第 11 列（rss）为平均内存需求。第 8/9 列（all/time）对应图 8.4。最后一行给出每个层级集合中的测试比对数量。

表 8.1 的性能度量基于固定大小的数据集。图 8.4 则绘制了多种 MSA 算法在待比对序列数量增加时的运行时间；所用数据来自 Pfam（Finn et al. 2014）的三组不同长度序列。柱形对应一个很短的蛋白结构域（zf-CCHH，平均长度 23 个氨基酸）、一个中等长度结构域（rvp，平均序列长度 93），以及一个长蛋白结构域（RuBisCO_large，长度 248）。图 8.4 使用双对数图展示结果。较平缓的曲线代表扩展性较好，也就是说，待比对序列数增加时，计算时间只会适度增加。陡峭曲线则代表扩展性较差，使用越来越大的序列集合时，计算时间会快速增加。Clustal Omega 的结果用红色柱（底部为 zf-CCHH，顶部为 RuBisCO_large）和圆点（rvp）表示。对于 20–1000 条序列的数据集，Clustal Omega 慢于 Kalign（品红色圆点）、默认 MAFFT（深蓝色圆点）或快速 MUSCLE（绿色方块）。由于扩展性更好，Clustal Omega 在 N = 2000 时超过快速 MUSCLE 和 Kalign，并在 N = 20000 时超过默认 MAFFT。MAFFT PartTree（深蓝色方块）在所有数据集上都始终快于 Clustal Omega。

图 8.4

随着序列数量（x 轴）增加，不同 aligner 的总单线程执行时间（y 轴）。两个坐标轴均为对数尺度。须状线表示从短序列（下须：zf-CCHH/PF00096，长度 23–34 个残基）到长序列（上须：RuBisCO_large/PF00016，长度 295–329 个残基）的时间范围。实线连接中等长度序列的时间点（rvp/PF00077，长度 94–124）。

Clustal Omega 中，progressive alignment 启发式策略的两个主要阶段（即距离计算和成对比对）都已经并行化。一个比对可以分配到同一台计算机的不同核心上，但不能分配到不同计算机之间。距离矩阵计算是一项容易并行化的任务。相比之下，成对比对阶段很难有效并行化。如图 8.5 所示，Clustal Omega 在使用 2、3 或 4 个线程时可以获得较好的加速；但只有当序列数量非常大时，更多线程才有用。Clustal Omega 的并行化是“thread-safe”（线程安全）的：使用一个线程生成的比对，保证与使用多个线程生成的比对相同。

图 8.5

使用不同线程数（x 轴）时，总运行时间相对于单线程执行的比值（y 轴）：(a) 100 条序列；(b) 500 条序列；(c) 1000 条序列；(d) 10000 条序列。Def 表示程序默认设置。L-INS-i (t) 表示该程序的非线程设置。

第 8 章 多序列比对 / 查看多序列比对

如果不借助可视化软件来突出比对的某些特征，查看一个 MSA 会非常困难。例如，可以使用不同字体、颜色或阴影来强调 conserved columns（保守列）或 motifs（基序）。此外，还可以通过在不同区域显示结构或功能特征来为比对添加 annotation（注释）。有一些专门的 alignment viewing package，也有一些软件包本身包含很好的查看功能；下面介绍其中一些常用工具（见 Internet Resources）。其中两个软件包（SeaView 和 Jalview）还包含非常强大的 MSA 编辑能力。

Clustal X

Clustal X（Thompson et al. 1997）是在已有 Clustal W 软件包（Thompson et al. 1994）的基础上加入 GUI 而创建的，并且这个 GUI 可移植到所有广泛使用的操作系统。两个软件包使用相同的 alignment engine（比对引擎），之后也并行开发和维护。未比对或已比对的序列会显示在一个可滚动窗口中，默认配色方案会突出显示各列中高度保守的残基。Clustal X 包含用于调整比对显示的工具，例如用户可调的配色方案、字体大小，以及用于突出显示低保守 blocks、columns 或 sequences 的选项。比对也可以导出为适合发表的高质量 PostScript 文件。这些着色功能最适合氨基酸序列，但也可以查看核苷酸序列。Clustal X 不再处于活跃开发状态，但由于其可移植性、稳健性和易用性，它仍然可以免费获得并被广泛使用。它可作为桌面应用运行在所有广泛使用的操作系统上。

Jalview

Jalview 是一个 open-source MSA editor and analysis workbench（开源 MSA 编辑器与分析工作台），可运行在 Windows、Mac 和 Linux 平台上（Waterhouse et al. 2009）。Jalview 关注基因、蛋白质或 RNA 家族层面的多序列比对和功能分析，而不是全基因组层面的分析。除了面向 DNA、RNA 和蛋白质序列的复杂交互式多序列比对编辑功能——包括 “undo”（撤销）、多个 “views”（视图），以及对比对中的序列和列进行 subset（取子集）与 “hide”（隐藏）的能力——Jalview 还提供 linked views（联动视图），可联动显示树、DNA 和蛋白质序列、通过 Jmol 或 Chimera（Pettersen et al. 2004）显示的蛋白质三维结构，以及通过 VARNA（Darty et al. 2009）显示的 RNA 二级结构。图 8.6 展示了两个例子：一个蛋白质比对，与蛋白质结构显示联动；一个 RNA 比对，与 RNA 二级结构显示联动。

Jalview 可连接到主要公共数据库，访问序列、比对和三维结构，从而便于获取这些资源和 sequence annotation（序列注释，例如 active site descriptions，活性位点描述）。Jalview 支持多种 annotation 方法，既可以作用于单条序列，也可以根据比对列计算，并显示在比对上方或下方。它还包含一个分屏 DNA/RNA/protein view，可将 DNA 比对与相关蛋白质序列比对联动起来，一起编辑和分析；图 8.7 展示了一个例子。这个视图还允许将 population variation data（群体变异数据）、single-nucleotide polymorphisms（SNPs，单核苷酸多态性）以及 gene exons 等其他基因组特征映射到蛋白质序列和三维结构上。例如，Jalview 用户可以在 UniProt 中查找蛋白质，然后反向交叉引用到 Ensembl 中的完整基因和转录本，以查看比对中任何已知 SNP；随后，只需点击几次鼠标，就可以查看蛋白质三维结构和 SNP 位置（如果可用）。

为了生成比对，Jalview 提供对八种常用多序列比对算法的直接访问，并允许用户修改每种方法的参数（Troshin et al. 2011）。因此，用户可以交互式地进行比对、重新比对，并比较不同方法和参数组合生成的比对。Jalview 还提供对 JPred protein secondary structure prediction algorithm（蛋白质二级结构预测算法；Drozdetskiy et al. 2015）的直接访问，可从单条序列或多序列比对预测蛋白质二级结构和 solvent accessibility（溶剂可及性）。Jalview 包含四种 protein disorder prediction algorithms（蛋白质无序预测算法），还包括 RNAalifold 程序（Bernhart et al. 2008），该程序可通过 JABAWS2.2 从 RNA 多序列比对预测 RNA 二级结构。对于 conservation analysis（保守性分析），Jalview 中通过 AACon package 提供 17 种不同的氨基酸保守性评分方法，以及 SMERFS functional site prediction algorithm（功能位点预测算法）。Jalview 网站包含培训材料和手册，在线培训 YouTube 频道还提供 20 多个关于 Jalview 基础和高级功能的短视频教程。

SeaView

SeaView（Galtier et al. 1996）是一个 MSA editor，尤其适合把比对视图与 MSA 和 phylogenetic package（系统发育软件包）连接起来。它既可处理核苷酸比对，也可处理氨基酸比对。SeaView 能够读写多种 MSA 文件格式，并可直接调用 MUSCLE 或 Clustal Omega 来创建 MSA。随后，用户可以编辑比对，并调用 Gblocks filter program 去除比对较差的区域。该软件包可使用多种方法计算系统发育树，包括 maximum parsimony（最大简约法；使用 PHYLIP 软件包中的 Protpars；Felsenstein 1981）、neighbor joining（邻接法；Saitou and Nei 1987），或使用 Phyml（Guindon and Gascuel 2003）进行 ML 分析。SeaView 是一种非常直接且稳健的方式，可以在单一框架下从未比对序列进入完整系统发育分析。

图 8.6

使用 Jalview 可视化的蛋白质和 RNA 多序列比对。左侧窗格展示蛋白质多序列比对，并包含不同 feature coloring（特征着色）、tree 和 Jmol 分子结构视图。所有窗口均相互联动，因此在一个窗口中点击某个残基或序列，会在所有其他窗口中高亮对应残基或序列。右侧展示 RNA 多序列比对，并在 VARNA 中显示相应二级结构信息。

图 8.7

在 Jalview 中可视化的 linked coding sequence（CDS，编码序列）、蛋白质和三维结构视图，显示已知 single-nucleotide polymorphisms（SNPs，单核苷酸多态性）的位置。Jalview 中使用文本搜索在 UniProt 中找到一组相关蛋白质序列。随后，Jalview 将这些序列交叉引用到 Ensembl 中的 CDS 数据。蛋白质序列由 Clustal Omega 进行多序列比对。最后，其中一个蛋白质的三维结构显示在联动的 Chimera 应用中。比对中的红色和绿色位置突出显示从 Ensembl 获取的已知 SNP 位置。

ProViz

ProViz（Jehl et al. 2016）是一个近期重新发布的软件包，用于查看预先制作好的蛋白质序列比对，并叠加 feature annotation（特征注释），尤其是 functional domains（功能结构域）。这些比对以及指向功能信息数据库的链接已经预先计算，查看器会以整合方式显示来自多种来源的序列信息。ProViz 可以在线运行，也可以下载后在本地运行。最简单的查看入口，是使用感兴趣蛋白质或基因的 ID、名称或关键词；随后查看器会显示包含该蛋白质的比对。用户也可以输入自己的蛋白质序列或多序列比对。ProViz 使用的数据来源列在 Internet Resources 中。

第8章 多序列比对

8.6 总结、网络资源与参考文献

总结（Summary）

即使是包含数千条序列的较大型数据集，也可以很快通过在线服务，或在基于 Linux 的笔记本和台式机上完成 multiple sequence alignment（MSA，多序列比对）。MSA 会被用于大量后续分析，几乎出现在所有系统发育分析、许多结构分析以及序列相似性研究中。

目前可用的软件包很多，但没有哪一个可以说在所有情况下都能给出“最佳”比对；为了让计算可处理，它们都会采用各种 computational shortcuts（计算捷径）。不同软件包各有优势和弱点，因此更好的做法是使用 alignment viewer（比对查看器）直接检查比对结果，并尝试不同程序。有些网站和 alignment-viewing package 支持多个最常用程序，同时保持一致的界面，这会让试用和比较变得更容易。

最重要的考虑因素，始终是输入序列本身的性质和质量。输入序列必须足够相似，才有可能被可靠地比对。还要记住：纳入的片段化序列或离群序列越多，比对结果就会越碎片化。干净的数据集通常会产生干净的比对；这样的比对既容易人工查看，也容易进一步分析。

网络资源（Internet Resources）

多序列比对软件版本

在线可用性标记说明：三类站点分别为 EBI（E，www.ebi.ac.uk/services`）、Tübingen 的 MPI for Genetics（M，toolkit.tuebingen.mpg.de）以及 Pasteur Institute Galaxy server（P，galaxy.pasteur.fr`）。

多序列比对可视化软件包

ProViz 用于蛋白质比对可视化的数据来源

多序列比对

蛋白质模块性

结构信息

基因组数据

其他人工审查数据

预测

参考文献（References）

以下参考文献题录按原书英文原文保留：

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第9章 分子进化与系统发育分析

9.1 引言（Introduction）

> “离开进化之光，生物学中的一切都将失去意义。”

>

> ——Theodosius Dobzhansky

宇宙已经存在了很长时间。根据计算，它的年龄超过 130 亿年（Planck Collaboration 2015）。太阳系被认为大约有 46 亿年历史（Bouvier and Wadhwa 2010），地球则在稍晚一点的时间形成，约为 45 亿年前（Wilde et al. 2001）。长期以来，地球上最早的生命证据被认为是西澳大利亚发现的 fossilized microbial mats（化石化微生物席），即 stromatolites（叠层石），其年代可追溯到 34 亿年前（Wacey et al. 2011）。不过，来自加拿大 hydrothermal vent precipitates（热液喷口沉淀物）中 biogenic carbon（生物成因碳）的新证据，把生命起源的时间进一步推到距今约 41 亿年前（Dodd et al. 2017）。对于生物而言，这是一段极其漫长的时间：它们在其中生存、繁殖、相互作用、争夺资源，并且不可避免地死亡。在这段时间里，地球经历了大量气候、大气和地质变化，改变了地球的化学组成和温度（Allegre and Schneider 2005）。

由于细胞生命在 metabolism（代谢）、physiology（生理）和 architecture（结构组织）上具有相似性，人们知道地球上所有生命都共享一个共同祖先，即 last universal common ancestor（LUCA，最后 universal common ancestor），时间早于 38 亿年前（Doolittle 2000; Weiss et al. 2016）。Charles Darwin 在《On the Origin of Species》（1859）中提出的 natural selection（自然选择）进化理论认为，evolution（进化）是生物种群中可遗传特征在连续世代中的变化，并且“所有生物都由共同祖先经分支过程而来”（Darwin 1859）。Darwin 的奠基性著作首次描述了这种进化变化机制，也支持了进化过程产生 biodiversity（生物多样性）的理论。地球生物多样性的早期估计范围很宽，从 300 万到 1 亿个物种不等；而较新的数字提示，现存物种可能接近一万亿种，其中真正被命名的只有 190 万种，收录于数据库的只有 160 万种（Mora et al. 2011; Ruggiero et al. 2015; Locey and Lennon 2016）。

Systematics（系统学）研究生物之间的相互关系。如何命名所有这些物种，并把它们归入更高阶的类群，是一门称为 taxonomy（分类学）的科学分支。过去曾使用过许多不同方式来归类生物，后文会继续讨论。本章的重点是 phylogenetics（系统发育学）：它是系统学中专门研究生物、若干生物群体（例如物种或种群），甚至生物体内基因和蛋白质之间 evolutionary relationships（进化关系）的领域。所谓物种、基因或蛋白质等实体之间的“phylogenetic relationship（系统发育关系）”，是指这些实体在过去某个时间点如何共享共同祖先。系统发育分析总是使研究者能够推断关系。

现在的系统发育分析通常使用 cladistics（分支分类学），这是一种针对生物、基因或蛋白质之间关系提出假设的方法。这类分析基于 branching patterns（分支模式）：这些模式用类似人类家谱的树状表示来呈现，并依据 traits 或 characters（性状或字符）的相似性构建。传统上，这类分析使用的 characters 是生物的 morphological features（形态特征）；但随着 genomics（基因组学）的兴起，以及来自多种生物的大量 whole genome sequencing（WGS，全基因组测序）数据可用，这一领域已经转向以基因或蛋白质序列作为分析基础。在这种语境下，每一个核苷酸或氨基酸残基都非常字面意义地成为一个“character”。

基因传统上被视为可遗传单位，会随着时间积累突变。具有共同进化历史的生物，会共享某些突变；这些突变可以通过不同算法和软件进行追踪与比较。因此，cladistics 的三个核心原则可以概括如下：

• 任何一组生物、基因或蛋白质，都通过共同祖先的传承而相关联。
• cladogenesis（clade formation，支系形成）呈现 bifurcating pattern（二分分支模式）。
• 特征变化会随着时间在 lineage（谱系）中发生。

除了基础生物学研究，理解基因、蛋白质和物种彼此之间如何相关，也有许多实际应用，例如 bioprospecting（生物勘探）、控制疾病暴发、法医学、药物治疗的选择与监测、生态退化追踪、食品与农业研究，以及更多其他场景。为此，本章将回顾早期分类方案，以及把分子序列作为 molecular clocks（分子钟）的用法；解释系统发育学的基础，以及如何解释系统发育树（包括必要的警示）；描述常见系统发育方法和软件之间的差异及其适当用法；并提供系统发育分析在真实世界中的应用示例。

Early Classification Schemes｜早期分类方案

纵观历史，早期用于命名和组织 taxa（分类单元）的分类方案，传统上主要建立在一系列生理、生物形态以及生物化学特征之上。

希腊哲学家 Aristotle（亚里士多德，384–322 BC）提出了两个关键概念：按生物类型进行分类，以及 binomial nomenclature（二名命名法）（Archibald 2014）。Aristotle 会根据生物之间的相似性来分组，例如“有血动物”和“无血动物”，然后再把这些组组织成层级结构。然而，Aristotle 的“ladder of nature（自然阶梯，scala naturae）”或其分类系统，并不是建立在共同进化历史之上的；阶梯上的不同物种彼此之间也不存在明确的遗传关系（Archibald 2014）。Aristotle 的 binomial definition scheme（二名定义方案）会为每种动物或植物赋予一个名称，这个名称由“genus and difference（属加区别特征）”构成，用以按照独特特征区分家族内部的不同亚群。

不过，正式的 binomial nomenclature（二名命名法）直到两千年后才被系统性采用，其标志是著名瑞典医师兼植物学家 Carolus Linnaeus（1707–1778）出版《Systema Naturae》（1735）。Linnaeus 常被视为 taxonomy（分类学）之父（Linnaeus 1735）。到二十世纪后期，Robert Whittaker 提出的 five-kingdom classification system（五界分类系统）已经成为生物学教材中的标准内容。该系统主要依据代谢差异进行划分（Whittaker 1969），将生物分为 Protista（原生生物界，单细胞真核生物）、Animalia（动物界）、Plantae（植物界）、Fungi（真菌界）和 Monera（原核生物界，单细胞原核生物，包括绝大多数细菌）。在这一阶段之前，分类方案大多仍依赖形态特征或代谢特征，或者依赖某位科学家主观赋予较大权重的 character（性状）；而不是去考察不同生物共享了多少总体特征。

一种更客观的生物分类方法，是依据共同祖先所导致的 shared derived characteristics（共享衍生特征）来对生物进行归类，这就是 cladistics（支序分类学）所提供的路径。在 cladistics 中，共享较多 derived characters（衍生性状）的 taxa，会被归为彼此关系更近的一组；而共享较少者则距离更远。这样一来，这些特征集合（即 characters，性状）就可以被科学家用来推断 phylogenetic（系统发育）或 evolutionary（进化）关系。

德国昆虫学家 Willi Hennig 在第二次世界大战期间身为战俘时，起草了 cladistics 的奠基性著作《Basic Outline of a Theory of Phylogenetic Systematics》（1950）（Schmitt 2003）。Hennig 说明，推断出的关系应当以一种分支式层级树状结构来表示，这种图称为 cladogram（支序图）。构建 cladogram 时，应尽量使一个 character state（性状状态）到下一个 character state（即下一个 branch 或 clade）之间所需的变化次数最少。cladistics 的这些原则，构成了现代 phylogenetic analysis（系统发育分析）的基础。

Sequences As Molecular Clocks｜作为分子钟的序列

基因以及调控区域中的 nucleic acid sequences（核酸序列）会随着时间推移，通过多种机制积累不同类型的 mutation（突变）。这些突变包括 DNA 复制过程中产生的 missense（错义）、nonsense（无义）或 frameshift（移码）错误；DNA 片段的 insertion（插入）和 deletion（缺失）；重复序列的扩增；甚至还包括基因乃至整条染色体的 duplication（重复）（Griffiths et al. 2000）。遗传序列的化学性质会影响其结构，也会影响它们与其他分子相互作用的能力。遗传物质中的突变可以影响细胞功能；同时，遗传变化的下游后果也会影响蛋白质的结构、理化性质和催化能力（Griffiths et al. 2000）。

蛋白质序列和结构与功能紧密相连。由于蛋白质是细胞的“工作主力”，其 primary sequence（一级序列）的变化可能改变细胞表型，甚至改变整个生物体的表型。分子序列中的某些区域对功能至关重要。如果生物在这些区域积累突变，往往会导致有害的功能扰动，从而降低 fitness（适合度）。因此，selection pressure（选择压力）会倾向于保守这些区域；相比之下，其他不那么关键的区域则更能容忍变化。不同分子序列位置的变化速率并不相同；不同基因和蛋白质类型之间、不同物种之间，以及不同环境条件下，变化速率也会不同。一般来说，生物之间的序列差异越多，它们独立积累突变的时间就可能越长；因此，它们之间的进化关系也通常越远。

20 世纪 60 年代和 70 年代，蛋白质与核酸测序技术的发展，极大推进了科学家认识和研究生物的方式。1965 年，Emile Zuckerkandl 和 Linus Pauling 借一篇受邀撰写、但未经过同行评议的手稿之机，试图就使用分子序列推断进化历史中的变化速率“说一些惊人之语”。这个想法后来被称为 molecular clock hypothesis（分子钟假说）（Zuckerkandl and Pauling 1965）。molecular clock（分子钟）的概念，是利用生物分子的突变速率来推断两个或多个生命形式、基因或蛋白质发生分化的时间点。Zuckerkandl 和 Pauling 利用古生物学信息，对人和马的血红蛋白链中的氨基酸变化速率进行校准，从而推断许多动物物种的 last common ancestor（最近共同祖先）。尽管该研究假设一个序列中所有位置的变化速率都是均一的——而现实中这种情况很少成立——但“molecules as documents of evolutionary history（作为进化历史文献的分子）”这一观点，打开了用 DNA 与蛋白质序列追踪进化事件的大门（Zuckerkandl and Pauling 1965）。

这一概念对 microbiology（微生物学）产生了深远影响。传统上，微生物分类常常基于表型性状，而这些性状往往带有主观性。相比之下，序列比较可以提供更客观、可量化的指标。事实上，1977 年 Carl Woese 使用 16S ribosomal RNA（16S rRNA，16S 核糖体 RNA）序列比较，构建了现代意义上的 Tree of Life（生命之树），进一步革新了微生物学领域。Tree of Life 将生物划分为三个 domain（域）：Eukarya（真核生物，也称 eukaryotes）、Bacteria（细菌；Woese 最初称其为 eubacteria）以及 Archaea（古菌；最初称为 archaebacteria）（Woese and Fox 1977; Woese et al. 1990）。16S rRNA 基因（在 Eukarya 中对应 18S）看起来是一种理想的分子钟，因为它不受 coding sequence（编码序列）的约束或偏倚影响，并且序列中的不同部分会以不同速度发生突变（Woese and Fox 1977）。变化较快的区域可用于分类亲缘关系较近的生物，而进化较慢的区域则可用于识别亲缘关系较远的生物。

Woese 使用 16S rRNA 基因构建 Tree of Life 的思路，后来被扩展到多种其他单基因和蛋白质，用于构建 phylogenetic trees（系统发育树）。其中还包括利用某个基因内部、发生在三大生命域形成之前的 duplication（重复）事件，来为 Tree of Life 定根（Lawson et al. 1996）。由于 selection pressure、环境影响、复制机制准确性差异以及其他因素不同，由这些不同序列构建出的树，其 topology（拓扑结构）并不总是一致；这反映了不同生物中的基因序列会随着时间积累各自的变化。换言之，一个生物体的进化历史，很少能完全由单个基因的进化历史来代表。

这一认识促成了 concatenated gene and protein sequence datasets（串联的基因与蛋白质序列数据集）的使用。所谓串联数据集，是指把一系列不同序列首尾相接地连接起来；这种方法通过在多个基因历史之间获得共识，增强 phylogenetic signal（系统发育信号）的解析度（Gadagkar et al. 2005）。随着 genome sequencing（基因组测序）的化学方法和技术不断改进，WGS（whole-genome sequencing，全基因组测序）已经成为理解 biodiversity（生物多样性）的有力工具。如今，成千上万个基因的序列都可以被解析，并用于系统发育分析以及许多其他应用。

9 分子进化与系统发育分析

背景术语与基础概念

如前所述，系统发育分析（phylogenetic analysis）是推断或估计进化关系的方法。所有系统发育分析都基于特征（characters）或性状（traits）的分析。对于形态学数据，特征可以是毛发是否存在或骨骼的某种特定形状。分子系统发育学（Molecular phylogenetics）是通过比较序列中的核苷酸或氨基酸来研究进化关系的学科。在序列数据分析中，比对中的每一列都被视为一个特征或性状，列中的每个氨基酸残基或 DNA 碱基代表该特征的特定状态。

最终的关系通常以各种类型的层级树（hierarchical trees）表示。树的绘制方式可以有多种，但都包含相同的基本元素：由分支（branches）连接节点（nodes）和叶子（leaves），将祖先与后代联系起来。分类单元（taxon）代表任意分类级别的分类群，如物种、科或目。单一共同祖先衍生的所有后代组成一个单系分支（monophyletic branch），称为支系（clade）。系统发育图（cladogram）是一种以树的形式呈现进化关系的图，其中分支的长度是任意的；相比之下，系统发育树（phylogenetic tree）中的分支长度通常表示所发生的特征变化量。树的形状，或者说节点和分支如何连接不同分类单元的方式，称为树的拓扑结构（tree topology）。这些系统发育树的基本组成元素如图 9.1 所示。

构建系统发育树的基本步骤包括：定义生物学问题、来源与选择具有同源性（homologous）的序列（即拥有共同祖先）、比较保守与可变特征、量化序列间的变化，以及用树的形式呈现数据。以下将逐一讨论这些步骤。

定义所提出的生物学问题对于确定分析方法以及采样程度（sampling，即应包含的序列和物种的范围与类型）至关重要。值得注意的是，并非所有基因都存在于所有物种中。序列可以在实验室中生成，也可以从 GenBank（美国国家生物技术信息中心，NCBI）等私人或公共数据库中获取（见第 1 章）。无论序列是新测得还是从数据库下载，都应确保其质量高、错误少，并经过仔细筛选以保证其同源性。在报告方法时，同样重要的是要注明序列数据的来源。公共数据库常使用基于自动化序列相似性的算法来为基因组注释基因/蛋白质名称。然而，不同的研究人员和不同的物种往往有不同的命名惯例，因此不应仅凭名称来选择序列，而应基于序列相似性来选择。

序列一致性（sequence identity）是一种可量化的度量，描述被比较的序列之间相同的字符数量。序列相似性（sequence similarity）也是一种可量化的度量，描述序列之间相同或化学相似的字符数量；须记住，这种度量并不一定反映亲缘关系（见第 3 章）。例如，同一化学基团的氨基酸共享电荷、极性和疏水性等特性。丙氨酸和缬氨酸都具有疏水性侧链，因此两条序列在相同位置分别含有这两种不同氨基酸时，应被视为相似而不一致（图 9.2）。因编码这些序列的基因遗传自共同祖先而具有匹配字符（核苷酸或氨基酸）和相似结构的序列称为同源序列（homologs）。同源序列因遗传而具有序列相似性。不同物种中由物种分化事件产生的同源序列称为直系同源物（orthologs）。然而，某些物种由于基因复制（gene duplication）过程会包含一个基因（或蛋白质）的多个拷贝。一旦一个基因在生物体内被复制，系统就会有一定的冗余，使选择过程可以在基因的不同拷贝上以不同方式发挥作用。不同的拷贝以不同方式和速率积累变化，导致分歧，并常常使一个或两个拷贝产生新功能。因基因复制而相关的序列称为旁系同源物（paralogs）。有时生物体会通过水平基因转移（horizontal gene transfer / lateral gene transfer）从其他物种获得基因。这些基因的不同拷贝称为异源序列（xenologs）。

在选择比较序列或进行后续分析时，识别和区分这些关系类型非常重要（图 9.3）。选择比较序列的最佳方法是通过 BLAST 搜索等计算方法进行相似性搜索（见第 3 章）。

为了测量不同核苷酸或氨基酸序列之间的变化量，必须首先进行序列比对。这样做是为了确保正在比较的是基因或蛋白质中相同的位置。有不同类型的比对适用于不同的目的，也有许多工具可以执行成对比对和多重序列比对（见第 8 章）。成对比对（pairwise alignment）是将两条序列的字符对齐以实现最大一致性（对于氨基酸序列还考虑保守性）的过程，使人们能够评估相似程度及同源性的可能性。多重序列比对（multiple sequence alignments）对系统发育分析特别有用，可以聚焦于序列的一部分（称为局部比对，local alignment），也可以涉及完整序列（称为全局比对，global alignment）。识别具有许多完全相同或高度相似字符以及一些可变字符的位置，可以指示序列的保守区域。这些保守区域更容易比对，包含了最有信息量的系统发育信号（phylogenetic signal）。高度分化的位置往往难以比对，因此被认为是系统发育噪声（phylogenetic noise），通常不包含在大多数分析中（图 9.4）。关于不同类型软件以及初学者进行系统发育分析所需的各种比对考虑的概述，将在下面的树构建部分讨论（见"多重序列比对与比对编辑"）。

分歧路径，或者说序列通过积累突变随时间变化的方式，将影响所描绘推断进化过程的系统发育树的形状。量化比对序列间的变化并确定序列间的分歧路径需要一些假设，这些假设基于所研究的明确定义的生物学问题。替换模型（substitution models）估计一个碱基或氨基酸变为另一个的似然率；同时估计序列中不同位点的总体变化相对速率。一般来说，在生化性质更相似的碱基或氨基酸残基之间，替换更为频繁。对于 DNA，四种转换（transition）类型（A → G、G → A、C → T 和 T → C）通常比八种颠换（transversion）类型（A → C、A → T、C → G、G → T 及其反向）更为频繁。这种偏差会影响两条序列之间估计的分歧程度。

相对替换速率的具体规定通常以一个方阵的形式呈现（称为替换矩阵，substitution matrix；见第 3 章）。不太可能的替换的替换成本高于更可能的替换。矩阵的非对角线元素对应于从一个碱基到另一个碱基的相对成本。对角线元素代表不同序列中相同碱基的"成本"。不同的 DNA 和蛋白质替换模型将在下面的树构建部分回顾（见"确定替换模型"）。一个值得注意的因素是基因如何将遗传变化从基因传播到蛋白质再到表型表达。非同义替换（non-synonymous substitution）是改变蛋白质氨基酸序列的核苷酸突变。相比之下，不改变氨基酸序列的核苷酸变化称为同义替换（synonymous substitution）。由于非同义替换导致生物体的生物学变化，它们更容易受到选择。

随着测序技术的发展，人们已开发了多种统计检验方法来量化作用于蛋白质编码区的选择压力。其中，dN/dS 比值是最广泛使用的指标之一，部分原因是其简单性和稳健性。该指标通过比较假定为中性的静默位点的替换率（同义替换率，即 dS）与可能受选择影响的非静默位点的替换率（非同义替换率，或 dN）来量化选择压力。dN/dS > 1 仅在选择促进蛋白质序列变化时才会出现，而 dS/dN 比值 < 1 则仅在选择抑制蛋白质变化时期望出现。因此，除了替换类型的变异外，不同位点之间替换速率的变异已被证明会深刻影响树的构建结果——这被称为速率异质性（rate heterogeneity）（Swofford et al. 1996）。

最明显的位点间速率变异（或异质性）例子是编码序列中密码子的三个位点。由于遗传密码的简并性，第三个密码子位点的变化能够在不影响最终蛋白质序列的情况下发生得多。因此，这个第三密码子位点往往变化大得多。出于这个原因，许多编码 DNA 的系统发育分析会排除第三密码子位点。然而，在某些情况下，速率变异模式更为微妙，特别是对应于蛋白质保守区域或 rRNA 的那些。因此，在执行任何系统发育分析之前，应尽可能多地了解给定基因或序列的相关信息；包括所提议的结构域、整体保守程度、编码和非编码区域，以及如果是分析非蛋白质编码基因则应了解其 RNA 结构。为了校正生物分子中各位点突变率的异质性，可以采用 Gamma 分布来建模变异（Yang 1994）。Gamma 分布是一种概率分布（类似于更为人所知的泊松分布），描述变化速率的统计概率，取决于某些参数。Gamma 分布的不同形式（例如峰值振幅和曲线宽度）由一个称为"形状参数"的单一 alpha 参数高度控制。alpha 值越高，异质性或位点变异越低。

树构建方法在细节上有所不同，但本质上都是基于进化模型将物种放入相关分支和节点。树构建方法可以分为基于距离的方法（distance-based methods）和基于特征的方法（character-based methods）。基于特征的方法在树构建过程中直接使用比对序列。基于距离的方法则先将序列数据转换为成对距离（calculated values，将最相似的序列连接在一起的计算值），然后使用这些派生值而非直接使用特征来构建树（图 9.5）。虽然基于距离的方法计算量远小于基于特征的方法，但基于距离的方法会校正各位点的突变饱和。换言之，在发散对的一条序列的某个位点发生突变后，任一序列中的后续突变都无法再使该位点变得更"不同"。事实上，后续突变可以使它们再次相同——例如，如果缬氨酸突变为异亮氨酸但又突变为缬氨酸，这将导致一次"看不见的"替换。这些方法还计算分支长度，表示节点之间或节点与叶子之间发生的变化次数。长分支长度表示更多变化；短分支长度表示更少变化。不同的基于距离和基于特征的方法将在下面的树构建部分讨论（见"树构建"）。

将代表物种的数据拟合到一个树中有许多不同的方法，这通常随所用序列数量的增加而增加。有多种程序可用于评估数据中的系统发育信号和树拓扑结构的稳健性。最流行的方法是统计重采样，称为自展法（bootstrapping）。自展法基于这样的前提：如果系统发育信号均匀分布在整个序列中，不同位点应足以提供相同的树拓扑结构（Efron 1979; Felsenstein 1985）。判断这一前提是否成立很重要，因为某些序列区域可能错误地影响树。例如，具有序列相似性但存在于功能非常不同的蛋白质中的结构域（如结合盒，binding cassettes）可能对系统发育树产生不利影响。因此，自展法可被视为一个两步过程：第一步是从原始数据集中通过随机有放回抽样生成许多新的扰动数据集；第二步是像原始系统发育分析一样处理这些数据集。根据产生的树集合（通常为 100 或 1000 棵树），计算特定分支（例如某个分类单元）在树中出现的比例，并将该值放在共识树（consensus tree）的相应分支上。该值通常称为自展值（bootstrap value）。

需要注意的是，这些新数据集是通过从原始数据集随机抽样字符列创建的。这种随机抽样意味着每个位点与其他位点被抽中的概率相同。因此，每个新创建的数据集与原始数据集具有相同数量的总位点，但有些位置被重复或三倍复制，有些则缺失。因此，某些新创建的数据集可能与原始数据集完全相同——或者在极端情况下，可能只有一个位点被复制了 500 次，而原始数据集中剩余的 499 个位点都丢失了。因此，自展分析允许人们识别给定的分支顺序对序列的某些修改是否稳健，特别是关于某些位点的移除和替换。简而言之，每个自展值都作为对节点置信度的度量。

系统发育树可以表示为有根树或无根树。树的根代表祖先谱系，分支的顶端代表该祖先的后代。随着从根移动到顶端，时间向前推进。通过定义树中（假定的）祖先的位置来对树进行加根，通常通过引入一个"外群"（outgroup）来实现。外群可以是任何未从正在分析的生物体或序列的最近共同祖先衍生的生物体或序列。例如，选择外群的一个例子是用沙门氏菌（Salmonella）序列作为大肠杆菌（Escherichia coli）序列集合分析的外群。Salmonella 序列适合作为外群，因为它足够相似以识别所有分类单元之间的系统发育信号，但又在大肠杆菌属之外（"内群"，ingroup；图 9.6）。

同样，由于已知爬行动物是哺乳动物物种的祖先，爬行动物序列可用于哺乳动物序列分析的外群。外群序列必须在系统发育分析开始时选择，并且必须包含在所有后续步骤中：比对、替换和进化建模，以及树评估。然而，外群加根可能会有问题。接近内群的外群可能只是被错误排除的内群成员。明显较远的外群（例如植物分析中的真菌）可能具有高度分化的序列，其与内群的连接会受到"长枝吸引"（long branch attraction）问题的影响（见下文"树构建"）。明智的做法是检查有外群和无外群两种情况下产生的树拓扑结构。另一种加根方法涉及重复基因或具有内部重复的基因分析（Lawson et al. 1996）。如果所有生物体的旁系同源物都包含在分析中，那么假设没有长枝问题，可以逻辑地将树在旁系同源物基因树汇聚的节点处加根。

树查看软件以不同的格式或"视图"呈现节点、分支和叶子，可以包括加根、自展值和其他置信度指标、分支长度以及叶子标注（例如分类单元、基因或蛋白质的名称；序列 ID 及其他信息），根据需要或喜好设置。在下一节中，我们将概述树构建方法和常用的系统发育分析软件。

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图 9.1 树的两种可视化方式。 本例中同一棵树以（a）和（b）两种方式呈现。分类单元被组织成由一系列分支和节点组成的支系，节点标记分支中的分叉点。在（a）中，注意分支长度没有意义——它们不表示分歧程度，树仅提供分支顺序。判断树仅说明分支顺序的线索是分支长度相等且与每个分类单元名称平齐。（b）同一棵树，但分支长度表示从分析中推断的分歧程度。通过相加每个分类单元之间的分支，可以估计它们之间的分歧程度。在本例中，将分支 1、2 和 3 长度相加表示果蝇和小鼠之间的分歧程度。将分支 1、2 和 4 长度相加表示果蝇和人类之间的分歧程度。在这个人为的示例中，分支长度的差异推断果蝇和小鼠彼此之间比果蝇和人类更近。需要注意的是，在像（b）所示的情况下，仅水平分支有意义。垂直分支仅用于分隔分类单元，便于观察。

图 9.2 说明序列相似性与序列一致性之间差异的比对。 展示了两个比对，比较序列 1 与序列 2 和序列 3。比对 1 比较序列 1 和序列 2，含有四个替换（高亮）。这些替换在同一化学基团内，因此被认为是相似的；A → V、I → V 和 A → L 都是疏水性氨基酸组内的变化，N → T 都是极性不带电氨基酸。有 16 个相同位置，因此一致性为 80%；而相似位置为 20 个（16 个相同加 4 个相似），总相似性为 100%。比对 2 比较序列 1 和序列 3，含有五个替换（高亮）。其中三个替换发生在同一化学基团内，因此被认为是相似的：H 和 R 都是碱性氨基酸，S 和 T 都是极性不带电氨基酸，D 和 E 都是酸性氨基酸。然而，两个替换发生在化学无关的氨基酸之间，因此不被认为是相似的：P 和 V 来自不同基团，R 和 E 也来自不同基团。有 15 个相同位置，因此一致性为 75%；而相似位置为 18 个（15 个相同加 3 个相似），总相似性为 80%。

图 9.3 直系同源物、旁系同源物和异源序列之间的差异。 右边的祖先生物体含有某一特定基因的单一拷贝（以白色矩形表示）。蓝色谱系（带有灰色基因的后代）积累了许多不同的突变，在第一次物种形成事件中形成了一个新的独特物种。每个谱系都有自己的基因拷贝，通过突变和选择分化，这些不同版本称为直系同源物。基因复制事件在同一生物体中产生两个不同的基因拷贝（重复基因以黑色显示），这些拷贝被传递给后代并独立积累突变。仅因基因复制而分化的基因称为旁系同源物。水平基因转移（HGT）事件（也称为侧向基因转移）将基因拷贝传递给新谱系（以虚线轮廓显示），导致不同支系或分类单元共享更近缘的基因，尽管这些谱系本身并非通过垂直传递紧密相关。通过 HGT 过程共享基因产生了异源序列。

图 9.4 系统发育信号与系统发育噪声之间的差异。 系统发育信号由序列保守区域提供，在这些区域中不同位置可以被比对并包含一些变异。这些位置包含有关进化过程或速率的信息（本图中为位置 1–22 和 35–40）。系统发育噪声由更快进化的位点产生，这些位点通常难以比对，可能包含多个空位。这种噪声可能误导系统发育推断，导致弱支持或对错误假设的支持。

图 9.5 基于特征的方法与基于距离的方法。 基于特征的方法（如最大简约法和最大似然法）在树推断过程中直接使用比对序列，而基于距离的方法（如邻接法）首先将序列数据转换为成对距离。

图 9.6 用外群对树加根。 大肠杆菌通常存在于温血动物的下肠道。大多数大肠杆菌菌株是无害的，但某些类型（称为血清型）是有致病性的，可导致人类严重的食物中毒。本例中，将大肠杆菌致病谱系（O157:H7 EDL933 和 APEC01）与野生型实验室菌株进行比较，构建了一个小型大肠杆菌系统发育树。虽然可以从无根树推断序列之间的关系，但除非对树加根，否则无法推断祖先序列。通过用外群（此处为 Salmonella 序列，已知更远缘并是该研究群组的祖先）对树加根，可以确定哪些谱系是祖先的，哪些是后代的。

How to Construct a Tree — 中文翻译

原文信息

• 来源：Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Sequences, 4th Edition
• 范围：PDF page 280-288；印刷页码 260-268；止于 Marker-Based Evolution Studies 标题前
• 版权声明：

翻译说明

• 术语统一采用项目术语库（bioinformatics_glossary.xlsx）
• 工具名、数据库名、URL、文献题录保留英文原文
• 内部子标题（Multiple Sequence Alignment and Alignment Editing / Determining the Substitution Model / Tree Building / Tree Visualization）作为 ### 处理，不作为 peer entries 暴露

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正文

如何构建一棵树

究竟是使用核苷酸数据集还是氨基酸数据集进行系统发育分析，这一问题一直存在争议，焦点集中在系统发育信号的强度与总体使用的便捷性之间。使用氨基酸序列推断系统发育的主要论据在于，氨基酸具有比核苷酸（4个）更多的可能特征状态（20个）。因此，特征状态数目的增加可以提高比对过程中的分辨率。然而，核苷酸序列中特征数目的增加往往能够更好地解析树的拓扑结构，尤其在研究亲缘关系较近的序列时。当然，有些序列（如16S rRNA序列）本身没有相应的蛋白质编码序列。在这种情况下，分析者需要综合考虑生物学问题、所研究序列的分化程度、可用于采样的序列以及现有工具，做出最终判断。

一个简洁的系统发育分析包含四个步骤：多序列比对、替换模型确定、构建系统树，以及系统树评估。每个步骤对分析都至关重要，理应得到相应的重视。一棵树的优劣完全取决于它所基于的数据质量。

多序列比对与比对编辑

系统发育序列分析始终从多序列比对开始。在系统发育分析中，比对步骤的重要性不亚于甚至超过后续步骤，因为它决定了后续进化模型所依据的数据集。在比对过程中，被纳入系统发育分析的比对位置代表了先验的系统发育结论，因为这些位点本身（而非实际碱基）实际上被假定为具有谱系关系或同源关系。典型的比对流程是：先应用 Clustal（ClustalW、ClustalX 或 Clustal Omega）等程序进行比对，再进行手工比对编辑，最后提交给树构建程序（Chenna et al. 2003）。许多现有方法（包括 Clustal、PileUp 和 ProPack 中的 ALIGN）按照明确的系统发育标准（即基于初始成对序列比对生成的"引导树"）来比对序列。执行全局成对比对最广泛使用的算法是 Needleman–Wunsch 算法，该算法同时在 Clustal 和 MUSCLE 比对程序包中实现；该算法在输入数据集的所有序列对之间尽可能多地匹配字符（无论序列长度如何），以获得成对评分（Needleman and Wunsch 1970）。不同程序的具体实现方法略有不同：Clustal 使用实际序列进行比对，而 MUSCLE 在比对的第一阶段仅通过调查序列中的 k-mer（即长度为 k 的短序列）来节省时间（Needleman and Wunsch 1970）。这些评分随后被用于构建引导树，引导树再用于生成多序列比对。

顾名思义，引导树实际上引导构建更稳健的比对。其原理是：亲缘关系更近的序列应优先比对，然后产生的序列组虽然在组间同源性较低，但仍有共同祖先，因此可以更准确地进行彼此之间的比对。多序列比对方法和常用比对软件的示例详见第8章。

比对软件中有许多参数控制比较的速度和敏感性，如空位罚分和打分矩阵的选择，第3章有更全面的介绍。在一种比对方法中，最重要的参数是那些决定长度可变序列比对中插入和缺失（indels 或 gaps）放置的参数。比对的参数应随估计的进化分歧程度增加或减少，因为当序列分歧程度增大时，碱基错配的可能性也随之增大（Thompson et al. 1994）。偏斜的采样（例如近缘序列过度代表）会影响引导树中的成对评分和算法 entrainment，对代表性不足的序列的比对产生不利影响（Thompson et al. 1994; Hughey et al. 1996）。在这种情况下，比对参数也应动态调整。Clustal 等部分软件包提供了动态参数调整功能。然而，除非事先知道系统发育关系，否则没有明确的方法来确定给定系统发育分析的最佳比对程序。

一般来说，不建议简单地将计算机生成的比对直接提交给树构建程序，因为后者无法识别前者的错误。然而，只要在整个比对过程中结合独立系统发育证据进行审视，Clustal 等利用一定程度系统发育标准的方法就是目前最好的选择。例如，如果比对中有几个彼此非常接近的空位，应将它们合并为一个包含所有空位的单一 indel，因为从进化角度来看，一次插入或缺失比多次更合理。同样，Clustal 鼓励在亲水性氨基酸序列中形成空位，这与在球状蛋白表面或膜蛋白的亲水环区域发生插入或缺失一致，而在疏水蛋白核心中则不然。然而，必须强调的是，目前没有任何方法能够依据系统发育模型来判断一个多序列比对是否显著优于另一个。

远缘序列的比对可能存在问题。如前所述，生物大分子结构与功能之间存在重要联系。远缘分子之间的序列分歧往往导致比对不确定，要么"间隙过多"，要么在许多位置高度可变。有时，使用二级或三级结构信息来指导比对被认为在系统发育上比纯序列比对更可靠。这是因为当比较复杂特征（如结构）时，同源性评估的信心更高，而比较简单特征（如可能已高度分化的核苷酸和氨基酸）时则会产生系统发育"噪音"。16S rRNA 基因的情况即是如此（见第6章）。此外，有时需要进行比对"手术"或比对编辑，以确保保留系统发育信号并移除模糊信息；这涉及手动删除数据集中的列。手动解决歧义时，应考虑系统发育关系、替换过程和碱基组成。根据系统发育证据解决歧义是完全合理的，在某些情况下，删除比对中的模糊或噪声区域（图9.4）是可取的。根据一系列稍作修改的比对进行系统发育分析是有用的，这可以观察比对的模糊区域如何影响结果，以及结果的哪些方面更为可靠。

替换模型确定

替换模型的选择应与比对和树构建给予同等重视。如前文所述，替换模型同时影响比对和树构建。虽然替换模型中的任何参数在特定数据集中都可能是关键的，但具有最多参数的模型并不总是最好的——恰恰相反，参数越少越好。这是因为每个参数估计都有关联的方差或不确定性。不幸的是，目前没有一种明确的方法优于其他方法，每种方法都有其自身的优缺点，具体取决于所执行的分析类型和研究者秉持的哲学理念。

过去50年间，不同的科学家提出了许多不同的核苷酸替换模型。这些模型对核苷酸碱基频率（即某特定核苷酸在序列中出现的频率估计）和替换率（即进化过程中一个核苷酸被另一个替换的速率）的估计方式各不相同。JC69 模型（Jukes and Cantor 1969）是最简单的替换模型。JC69 假设碱基频率相等且替换率相同。该模型唯一需要估计的参数是总体替换率。K80 模型（Kimura 1980）假设所有碱基出现频率相等，但区分转换与颠换事件并对其赋予不同的权重，从而影响替换率。Felsenstein 1981年的模型（F81 模型）是 JC69 模型的扩展，允许碱基频率变化（即 A ≠ G ≠ C ≠ T 的频率；Felsenstein 1981）。Hasegawa 等人（1985）的 HKY85 模型可以看作是 K80 和 F81 模型扩展的组合。具体而言，HKY85 区分转换与颠换的不同速率，同时也允许不等的碱基频率。T92 模型将 Kimura 的两参数 K80 方法扩展到存在 GC 含量偏差的情况（Tamura 1992）。

在所有条件相等的情况下，生物体的 GC 含量应等于 50%，相应的 AT 含量应占另外 50%。然而，GC 含量在不同物种间存在差异，这些差异的原因被认为是多因素的，且常常存在争议。例如，分析表明，在某些生物体的某些基因组区域中，GC 含量与最优生长温度之间存在相关性，但并非对所有情况都成立。具体而言，已证明原核生物较高的最优生长温度与结构化 RNA（如 rRNA、tRNA 和许多其他非编码 RNA）较高的 GC 含量之间存在强相关性（Galtier and Lobry 1997; Dutta and Chaudhuri 2010）。TN93 模型（Tamura and Nei 1993）区分两类碱基转换（即 A ↔ G 的速率可以与 C ↔ T 的速率不同）。颠换被认为以相同的速率发生，但该速率允许与转换的两种速率均不同。当存在强转换-颠换和 GC 含量偏差时（如 Tavaré 1986 的通用时间可逆模型的情况），此方法很有用。该模型假设六个替换率参数（C ↔ G、C ↔ T、C ↔ A、A ↔ T、A ↔ G 和 G ↔ T）以及四个不同的碱基频率参数（Tavaré 1986）。

除了核苷酸替换模型外，还有许多氨基酸替换模型。最广泛使用的氨基酸替换模型是 PAM（接受点突变）系列矩阵和 BLOSUM（块替换矩阵）系列矩阵（Dayhoff et al. 1978; Henikoff and Henikoff 1992）。这些替换模型的细节在第3章有进一步讨论。对于系统发育分析，PAM 矩阵被认为适合比较近缘物种，而 BLOSUM 矩阵通常被认为更适合进化上较远缘的序列（Henikoff and Henikoff 1992）。对于精细调整的分析，可能需要使用多种打分矩阵分析一组序列，以确定每个矩阵对结果的影响。由于 BLOSUM62 矩阵在检测远缘序列相似性方面取得的成功，该替换模型被许多序列搜索算法（如 NCBI 的 BLAST）作为默认参数。

树构建

树构建过程始于比对。有时，比对程序的输出格式与树构建程序不兼容，需要对比对进行重新格式化；例如，分类群或分子名称标签可能有字符限制，以及关于序列是否必须以交叉格式排列的规范。因此，在尝试进一步分析之前，数据输入说明尤为重要。系统发育程序包需要输入：比对结果、所选替换模型及其伴随的模型参数（默认设置是一个好的起点），以及关于 bootstrapping 和根化的规格说明。

如前所述，树构建算法分为基于距离的方法（通常计算量较小）和基于特征的方法。基于距离的常用算法包括邻接法（Neighbor-Joining, NJ）、非加权组对法算术平均法（UPGMA）、Fitch–Margoliash（FM）法和最小进化（ME）法。NJ 算法通过多次迭代步骤将一棵未解析的"星形"树逐步分解（Saitou and Nei 1987）。该算法首先根据所选替换模型，识别出彼此距离最短的一对不同序列（标注为分类群、基因或蛋白质）。然后将这些分类群、基因或蛋白质连接到一个新创建的节点上，该节点再与中心节点相连。计算每个分类群到该节点的距离，并使用该值识别下一个亲缘关系最近的序列，然后用于创建一个新节点（因此称为"邻居的连接"）。重复此迭代过程，直到所有分类群都被解析到树中的各个节点。

考虑到替换模型之间的差异以及 bootstrapped 数据集之间的差异，此过程可能生成不同拓扑结构的树，且各节点的 bootstrap 支持度也不同。在这种情况下，会识别一棵共识树，即一棵包含所有可能树中具有最多共识节点的树。有些研究者认为 bootstrap 值超过 70% 的节点是良好支持的，而另一些研究者则认为只有超过 95% 才算良好支持——bootstrap 值越高越好。需要记住的是，节点的高 bootstrap 值并不意味着这些分类群（或基因或蛋白质）之间的关系实际上是真实存在的。它仅仅表明该节点在所选数据和分析方法下是得到支持的。对比对的修改（如包含或排除编辑区域、添加或移除物种，或更改所使用的计算参数）可能以不同方式影响所得的系统发育树。此外，在比对中包含一个严重错排的序列可能导致非常高的 bootstrap 值来支持其作为一个独特分支的分离，但这仅仅是因为错排所致。在系统发育分析之前始终建议手动检查比对。一棵得到良好支持的树增强了分析的信心，但如果没有时间机器回到数百万年前检查实际发生了什么，研究者必须记住，系统发育分析的结果仅仅代表一个非常好的假设。人们始终是在推断一种关系。这就是为什么经常使用"系统发育推断"这一术语的原因。

UPGMA 是另一种聚类算法，它计算所有最近的邻居（Sokal and Michener 1958）。该方法与 NJ 的不同之处在于，NJ 会考虑所有其他叶子到其他叶子的平均距离。UPGMA 隐含假设所有谱系以相同的速率进化（依据分子钟假说），因为它生成的树中所有叶子到根的距离相等。如果各谱系以不同速率进化（事实上它们确实如此），UPGMA 树可能不太适合距离数据。因此，UPGMA 通常不被认为是构建基于距离树的理想方法。ME 和 FM 系统发育推断方法基于以下假设：分支长度估计总和最小的树最可能是真实的树（Fitch and Margoliash 1967; Rzhetsky and Nei 1992）。在基于距离的方法组中，FM 和 ME 方法表现最佳，但它们比 NJ 慢得多，而 NJ 通常会生成与这些方法非常相似的树。

常用的基于特征的方法算法包括最大简约法（Maximum Parsimony, MP）和最大似然法（Maximum Likelihood, ML）。简约原则是所有科学的基础，其观点是：在其他条件相同的情况下，最简单的可能解释是最好的。就树构建而言，MP 方法需要最少的进化变化或最少的特征状态变化（Swofford et al. 1996）。分析中使用所有特征数据；但在确定序列之间的关系时不计算分支长度。虽然通过计数特征状态变化来对系统发育树进行评分很容易，但没有算法能够快速生成最简约的树。相反，最简约的树必须在通常所说的"树空间"中寻找，即在所有可能的树中寻找。MP 分析往往产生大量树（常常数以千计），它们得分相同但拓扑结构不同。在这种情况下，拓扑结构与所有等可能树中最多节点一致的树被认为是最好地支持数据的树。

当考虑的分类群数量较少时，可以进行穷举搜索，对每棵可能的树进行评分并选择最佳的一棵。对于更多的分类群，则必须执行启发式搜索，即在无法获得精确解时找到一个近似解。应当指出，MP 方法在存在大量位点间速率异质性时表现不佳（Huelsenbeck 1995）。此外，最优 MP 树会最小化同塑性（convergent evolution，即特征的独立趋同进化）。因此，MP 方法有时会受到长枝吸引的影响（Bergsten 2005）。长枝吸引发生在不同快速进化的谱系被误判为亲缘关系较近的情况下，无论其真实关系如何。通常，这种情况的出现是因为分析中包含的一个或多个特征在多个分类群中发生了趋同进化。MP 程序可能错误地将这种同塑性解释为在两个谱系共同祖先中进化一次的共裔性（synapomorphy）。

相比之下，ML 方法寻找在给定用户指定的序列进化模型下最好地解释数据的树（由用户指定的参数和分布设置）。四分法（quartet puzzling）是一种相对快速的树搜索算法，用于 ML 树构建（Strimmer and von Haeseler 1996）。使用 ML 时，如果已知数据集的其他信息（例如跨位点的高变化速率），最简单的解释可能不被认为是最正确的。虽然 ML 方法非常慢且计算量大，但据认为它能产生进化过程的最佳表征。因此，ML 方法一直是被称为贝叶斯推断的强大统计方法的基础（Huelsenbeck et al. 2002）。

贝叶斯推断是一种统计推断方法，在算法进行过程中，随着更多证据或信息的获得，进化假设的概率会得到更新。结果的更新概率由先验概率和似然函数确定。先验概率是在检查任何数据之前就确定的一组结果的参数和分布。先验概率有助于在了解实际发生了什么之前确定可能结果的机会。"似然函数"由一组结果的参数和分布组成，当已知可能发生的情况时使用。在分析过程中，通过使用马尔可夫链蒙特卡洛算法来更新结果的概率，该算法迭代地将结果的似然度（及其参数和分布的集合）与数据进行比较，并解析出最可能的结果；然后告知进一步采样的似然度范围（Yang and Rannala 1997）。此过程按研究者指定的次数重复进行。贝叶斯方法与 ML 方法使用相同的方法，即根据进化模型将最好地代表数据的树视为"最佳树"；然而，似然度计算被认为更加"有据可依"。

表 9.1 列出了一些实现不同系统发育分析方法的主流软件包。

表 9.1 实现不同系统发育分析方法的部分常用软件包

实现这些不同方法的流行软件见表 9.1。使用经典 PHYLIP 程序包进行 NJ DNA 序列分析的示例工作流程如图 9.7 所示。

在构建系统发育树时，从尽可能多的角度审视数据是很重要的。由不同方法生成的树拓扑结构的一致性表明，该分析是对真实系统发育的良好估计。不幸的是，不同方法获得的结果之间的一致性并不一定意味着该结果在统计上是显著的或代表了真实的系统发育，因为这种一致性可能有多种原因。外群分类群的选择对分析的影响可能与内群分类群的选择一样大。特别是当外群与一个或多个内群分类群共享异常属性（如组成偏差或分子钟速率）时，会出现复杂情况。因此，建议使用多个外群计算每次分析，并检查内群拓扑结构的一致性。此外，要注意程序可能根据输入文件中序列的排列顺序生成不同的树。PHYLIP、PAUP 和其他系统发育软件提供了一个"jumble"选项，可以以不同的（随机排列的）输入顺序重新运行分析。

如果无论出于什么原因必须单次运行计算树，应将怀疑有"问题"的序列放在输入文件的末尾，以降低树重排方法受到任何问题序列导致的较差初始拓扑负面影响的可能性。一般来说，当生物信息学分析基于进化假设时，应始终将其置于进化背景下进行考虑。例如，如果执行了 BLAST 分析，应该提出以下问题：BLAST 分析中的哪些命中可能是直系同源物而非旁系同源物？在搜索中识别出的哪些跨膜蛋白可能是同源物（祖先相关）还是因跨膜 α 螺旋序列相似性而偶然相似？在比对序列中，哪些结构域似乎是保守的？是否有与某个进化支相关而与其他进化支无关的 indels，表明它们可能具有功能性意义？

树可视化

系统发育树由多个部分组成。树的骨架由节点（nodes）、分支（branches）、叶片（leaves）以及（如果有的话）根（root）构成。叶片的标签通常对应基因、蛋白质或物种名称，但也可以包括生物体的俗名、物种名称可以采用粗体、斜体或彩色字符格式化。典型的系统发育树还会在各自节点旁边标注 bootstrap 值，以及分支长度比例尺。这是一个位于图底部的刻度条，旁边有一个数字（通常是一个分数），用于校准给定字符数下的变化次数。分支长度也可以被量化并标注在树上。一般而言，如果不从比对中移除这些序列，就无法从树可视化中移除分支、节点和叶片并重新进行分析。

系统发育树可以用不同的方式可视化。例如，树可以绘制为水平、垂直、圆形或放射状视图（图 9.8）。叶片和分支可以绕节点旋转而不改变推定的关系。目前有多种树绘制程序可在各种计算平台上使用，包括 TreeTool、TreeDraw、PHYLODENDRON、TREEVIEW、FigTree 以及 PAUP 内的树绘制工具；所有这些程序都处理标准的树文件。这些程序不仅便于生成适合发表或其他演示的树，也便于一般性地查看数据。例如，免费的 TREEVIEW 等程序使用户能够操作分支顺序视图、对树进行重根化，以及执行其他有助于用户的图形操作。

更全面的系统发育树可视化软件列表（包括预计算树的基于网络的视图）可通过互联网资源部分中的"系统发育树可视化软件"链接找到。树图像/文件也可以经常导出到 PowerPoint 或 Photoshop 等其他常用演示和图形软件中，并叠加其他生物学相关特征，例如在疫情调查中涉及的与疾病相关的系统发育相关分离株的聚类，这些可与散发病例区分开来。

Marker-Based Evolution Studies — 中文翻译

原文信息

• 来源：Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Sequences, 4th Edition
• 范围：PDF page 288-289；印刷页码 268-269；止于 Phylogenetic Analysis and Data Integration 标题前
• 版权声明：

翻译说明

• 术语统一采用项目术语库（bioinformatics_glossary.xlsx）
• 工具名、数据库名、URL、文献题录保留英文原文
• Figure 9.9 归属本节；下一节 Phylogenetic Analysis and Data Integration 未纳入本文件

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正文

基于标记的进化研究

遗传分子标记是与基因组中特定位置相关联的 DNA 片段。分子标记已被用于诊断囊性纤维化等疾病，利用 16S rRNA 基因解析分类亲缘关系，也在分子生物学中作为 DNA 条形码使用，从而能够在未知 DNA 混合池中识别特定序列。可用于建立生物体之间关系层级，或建立诸如疾病易感性等性状层级的分子标记类型很多。如前所述，这些标记可以是基因中的 single-nucleotide variants（SNVs），也可以是不同蛋白中的氨基酸替换。虽然 indels 可以是任意的插入或缺失，但 conserved signature indels 特指那些位于蛋白保守区域内、并且仅限于某一特定进化支或某一类物种中的蛋白 indels（Gupta and Griffiths 2002）。Conserved signature indels 是推断进化关系的有用分子标记，因为同一个插入或缺失事件不太可能在两个彼此独立的进化谱系中的同一位置重复发生。

SNVs 也可以在整个基因组之间被追踪和比较，从而以多种方式对序列进行分组。SNV 标记包括序列 motif，或 DNA 中反复出现的短模式，这些模式通常被认为具有生物学功能，例如转录因子结合位点中的模式。当 SNV 出现在酶切限制性位点中时，它们会影响基因组 DNA 的酶切图谱，而这种图谱可以通过 pulsed-field gel electrophoresis（PFGE；Gerner-Smidt et al. 2006）检测到。具有相同酶切片段图谱的不同分离株被认为彼此亲缘关系最近。PFGE 方法已用于微生物分子分型；它也被用于临床或环境样本中分离株的分类（达到亚种水平），例如用于暴发调查中的食源性病原体。另一种微生物分型技术称为 multi-locus sequence typing（MLST），它根据特定遗传位点上 SNV 模式的差异来为微生物分离株分配“sequence types”；其依据是 DNA 片段测序结果，而不是像 PFGE 那样依据电泳迁移率。MLST 可以在一组标准 housekeeping genes 上实施，并通过其独特的等位基因谱来表征菌株（Margos et al. 2008）。或者，也可以在 whole genome 或 core genome 层面实施 MLST；此时，该方法产生的大量等位基因将通过成对差异矩阵进行比较，并以树的形式展示（Achtman et al. 2012）。MLST 关系通常用 minimum spanning trees 可视化；这类树以最短可能路径连接全部节点。Minimum spanning trees 将 sequence types 聚类在一起，并试图识别每一组的 founding（或 ancestral）sequence type（Salipante and Hall 2011）。随后，这些祖先类型会在径向视图中连接起来（Figure 9.9）。

不同微生物的分子分型依赖不同的 MLST schema（即 loci 与 alleles 的集合），因为不同谱系中的不同位点由于变化速率和选择压力不同，其信息量也不同。有些 schema 甚至能够在 in silico 层面表示某些生物学现象，例如 serotypes - 即细胞表面的免疫学性质，可用于区分不同菌株。一个基于 core genome MLST schema 进行 Salmonella 血清型预测的 Web 可访问工具是 SISTR（Salmonella In Silico Typing Resource；Yoshida et al. 2016）。这类工具使得研究者能够快速识别 Salmonella 污染，从而支持食品安全与公共卫生调查。随着流行病学中基因组分析被越来越广泛地用于理解感染的分布与传播，eBURST（Feil et al. 2004）和 SISTR 等软件，以及存放 schema 与分离株数据的数据库，将在减少可预防传染病病例数量方面发挥关键作用。

尽管大多数真核生物 DNA 被包装在细胞核内的染色体中，线粒体也拥有少量自身的 DNA。Mitochondrial DNA（mtDNA）是存在于大多数真核生物中的一类小型双链 DNA（例如，人类 mtDNA 仅包含 37 个基因），并且遵循母系遗传（Anderson et al. 1981）。由于动物 mtDNA 的进化速度快于核基因（Brown et al. 1979），它携带的 SNVs 因而成为法医学、群体遗传学和医学遗传学中的有价值工具（Kundu and Ghosh 2015; Sturk-Andreaggi et al. 2017; Theurey and Pizzo 2018）。用于考察 mtDNA 序列间关系的工具之一是 mtDNAprofiler（Yang et al. 2013）。

植物分子标记研究已被用于作物改良。研究者已经开发出大量功能性分子标记，这些标记可以在小麦、水稻、玉米、高粱、黍类及其他作物中通过遗传序列分析直接识别（Kage et al. 2016）。例如，在小麦 30 个不同基因中识别出的等位基因，已被证明与食品品质、农艺性状和抗病性状相关，并已成功用于育种计划（Liu et al. 2012）。众所周知，植物分子标记研究推动了 20 世纪 60 年代全球粮食生产力的提升，这场进步被称为“Green Revolution”（Hedden 2003）。小麦 Rht1 和 Rht2 基因中的点突变使植株发生“矮秆化”，从而增强了茎秆强度，并最终提高了籽粒产量（Hedden 2003）。基于这类分析开发出的检测方法，至今仍使农民和科学家能够筛查新品种基因型中是否具有目标性状。

Phylogenetic Analysis and Data Integration

翻译

范围：PDF page 289-292；从 Phylogenetic Analysis and Data Integration 标题起，到 Future Challenges 标题前。

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Phylogenetic Analysis and Data Integration

系统发育和进化分析可用于回答多种类型的生物学问题。例如，当所研究的蛋白质与注释完整的序列紧密聚类时，可通过分支模式推断假设蛋白的功能，这一过程称为功能预测（function prediction）。类似地，旁系同源蛋白与直系同源蛋白之间由于序列分化而产生的分支模式差异，可能提示功能的分化。目前已有多种基于系统发育的蛋白质功能预测工具，例如 SIFTER（Statistical Inference of Function Through Evolutionary Relationships；Sahraeian 等，2015），但许多功能预测算法实际上是建立在基于比对的相似性之上的——其中包括 BLAST 和 PredictProtein。在许多情况下，必须将来自多个来源的不同类型数据与系统发育信息整合，才能回答生物学问题。SNV 的频率可以在群体中进行评估，而 SNV 在地理区域间的传播则可通过系统地理学（phylogeography）这一学科来理解。GenGIS 是一个将地理、生态和系统发育生物多样性数据整合在一起的软件平台，用于在多种环境中可视化系统发育关系。GenGIS 曾被用于评估"全球海洋采样考察"（Global Ocean Sampling expedition）的分类多样性（Parks 等，2009）以及 HIV-1 亚型在非洲的传播（Parks 等，2013）。类似地，MicroReact 将基因组学数据与时间、地理和其他元数据整合，以创建与健康相关的可视化图表（Argimón 等，2016）。该平台曾用于重建西非埃博拉疫情以及全球多种耐药微生物的传播事件研究。除了研究工具之外，23andMe 等个人基因组学公司（见网络资源）也利用标记基因和系统地理学分析来识别健康风险并追溯全球家族谱系。

基因组流行病学（genomic epidemiology）是将全基因组测序（WGS）数据应用于理解微生物种群（无论微生物还是病毒）的基因组变异如何影响疾病的发病率、分布及可能防控措施的学科，同时也涉及与公共卫生相关的其他因素。微生物分离株的基因组数据以及临床、暴露、地理和人口统计学数据，通过系统基因组树和其他比较工具进行比较（Tang 等，2017）。感染了被认定与疫情相关的聚集菌株的患者，将被追踪调查其共同的感染来源和传播方式，进而用于控制疾病传播（Robinson 等，2013）。基因组流行病学技术已在全球范围内用于控制多种传染病，包括结核病、沙门氏菌、大肠杆菌及各种病毒性疾病（Gardy 等，2011；Croxen 等，2017；Moran-Gilad 等，2017）。例如，参与 2016 年新加坡寨卡疫情的科学家利用基因组流行病学技术，通过贝叶斯分析将医院和蚊子病毒株进行匹配；这些结果随后被用于指导后续防控措施，例如在哪些区域增加幼虫杀灭剂的投放，以及在哪些区域启动公共卫生宣传活动（Singapore Zika Study Group，2017）。

系统发育学在新兴的微生物取证（microbial forensics）领域也已被证明具有重要价值，该领域旨在将生物恐怖主义行为或无意中释放的微生物/毒素的微生物 DNA 证据与潜在来源进行关联，以支持溯源（Schmedes 等，2016）。例如，2001 年，美国邮政局遭受了炭疽生物恐怖袭击。通过精确的菌株分型鉴定和系统发育分析，来自康涅狄格州、纽约州、佛罗里达州和华盛顿特区的看似互无关联的感染病例被聚类到单一作案者，同时排除了自然原因导致的病例（Yang 和 Keim，2012）。当美国卫生和执法官员追踪作案者时，准确知道炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）的精确菌株类型对于缩小潜在来源范围、确定犯罪现场本身都极具价值（Yang 和 Keim，2012）。测序技术和生物信息学分析的持续进步，继续影响着生物防御、刑事调查和情报获取方面的政策和实践（Schmedes 等，2016）。

癌症是一种遗传疾病，当正常细胞功能被 DNA 突变破坏时就会发生。癌症研究涉及范围广泛的临床和流行病学数据，以及分子和进化分析方法。突变发生在单个细胞水平，随后在细胞分裂过程中传播到亚群。亚群之间生长率的差异产生了复杂的肿瘤微环境，其中包含许多相互作用且不断进化的细胞（Beerenwinkel 等，2016）。由此产生的肿瘤内遗传多样性（intratumor genetic diversity）为肿瘤的正确诊断和治疗带来了巨大挑战，尤其是活检样本可能无法代表整个肿瘤（Beerenwinkel 等，2016）。肿瘤系统发育学（tumor phylogenetics）可揭示导致疾病的进化机制，同时也正在为癌症进展、转移和治疗反应的预测与控制提供新见解（Box 9.1）。

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Box 9.1 Using Phylogenetic Approaches to Predict Cancer Progression and Drug Response

利用系统发育方法预测癌症进展和药物反应

肿瘤系统发育学为揭示导致疾病的进化机制提供了重要视角。癌症是一种遗传性疾病，现已认识到突变的积累、多样化和选择会促进肿瘤细胞增殖，并根据复杂的进化机制影响存活率。图示展示了肿瘤如何包含积累了不同类型突变的混合细胞群。一些突变使癌细胞能够发生转移，而另一些突变则使癌细胞对治疗不那么敏感。系统发育分析已被应用于理解和预测癌症进展、转移及治疗反应的控制。肿瘤系统发育学的目标是利用可能的树空间探索从基因组变异中重建肿瘤进化过程，以解释数据集。特别是在肿瘤细胞异质性判断方面——尤其是与不同临床结局相关的突变类型——已经发展出了相应的进化论和分析方法；这些突变类型包括拷贝数变异（copy number variants）、微卫星（microsatellites，即某些 DNA 模体重复的重复 DNA 序列）以及"突变特征"（mutation signatures），如与环境触发因素相关的核苷酸偏好。突变率以及选择压力的程度和强度极大地影响着治疗方案的选择和预后。不同的治疗方案会导致选择作用，进而改变肿瘤内占主导地位的克隆。单药治疗可能通过选择不应答克隆和提高突变率（肿瘤内异质性）而导致复发，并且与抵抗不同类型治疗的能力相关。这些肿瘤多样性研究高度依赖于适当的参数估计和对不同突变过程的建模，这些过程已通过观察数据得到验证。迄今为止，大多数肿瘤系统发育研究都沿用了为不同物种系统发育树构建而开发的经典算法（Schwartz and Schaffer，2017）。

肿瘤细胞进化导致混合肺细胞群

正常肺细胞 → 肿瘤细胞 → 可治疗性肿瘤 / 导致转移的突变 / 耐治疗的突变

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系统发育学也正在通过新兴的药物基因组学（pharmacophylogenomics）领域推动药物开发（Searls，2003）。药物基因组学是一门结合基因、蛋白质定位、基因/蛋白质相关性、药物和药物靶点知识来识别新型治疗来源的研究领域（Searls，2003）。最著名的药物基因组学发现之一是"可成药基因组"（druggable genome）——即人类基因组中约 3000 个能够表达可与类药物分子结合的蛋白质的基因（Hopkins and Groom，2002；Sakharkar 等，2007）。对于既有相互作用又不断进化的蛋白质——如受体和肽配体（即趋化因子及其 G 蛋白偶联受体）——它们的共同进化反映在其系统发育树拓扑结构的相似性上（Searls，2003）。识别进化趋势的研究可用于创建分子相互作用的从新（de novo）预测算法。由于通路和网络经常与其相互作用伙伴平行共同进化，这些研究也将系统发育分析从单个基因和蛋白质扩展到了整个代谢和生理网络，从而拓宽了新型药物来源的搜索范围（Searls，2003）。

宏基因组学（metagenomics）和代谢组学（metabolomics）（见第 14 章）也正在迅速扩展我们探索陆地和水生环境遗传多样性的能力。宏基因组学是直接从环境样本中回收遗传物质进行研究的方法，用于探索复杂微生物生态系统的多样性，包括无法培养的菌株（Handelsman，2004）。NCBI 公共库提供了来自多种环境群落的序列访问，包括沉没的鲸鱼尸体、活性污泥、农田土壤、酸性矿山排水点、亚热带环流和深海沉积物等（NCBI Resource Coordinators，2016）。对这些基因谱系的系统发育分析（phylogenetic profiling）提供了一种计算机内（in silico）分析形式，可帮助确定体外实验的方向。例如，针对 β-内酰胺类以及 A 和 B 型链阳性菌素的细菌耐药基因产物的多样性和流行率，最初是在人类病原体中发现的（D'Costa 等，2007）。通过宏基因组系统发育分析，在许多环境物种中也发现了这些序列，表明土壤耐药基因组（soil resistome）的规模被严重低估，这也得到了体外研究的支持（D'Costa 等，2007）。这些发现为更好的抗生素管理和在临床上审慎使用抗生素提供了重要动力。

第9章 分子进化与系统发育分析

9.8 Future Challenges、Internet Resources 与 References

范围：PDF page 292 Future Challenges 标题起 - PDF page 298；合并 Future Challenges、Internet Resources、References。

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Future Challenges

系统发育分析是回答多种生物学问题的有力工具。不过，系统发育树本质上是一种推断出来的动态结构：它依赖于所采用的方法、纳入或排除的序列区域、物种取样方式、参数设定、定根方式以及其他因素。听起来似乎有些悖论，但在构建系统发育关系时，最重要的因素并不是具体采用哪一种系统发育推断方法，而是原始数据本身的质量。数据选择与序列比对过程的重要性怎么强调都不过分。即便是最复杂的系统发育推断方法，也无法自动纠正带有偏差或错误的输入数据。因此，研究者始终都应从尽可能多的角度检查原始数据和分析结果，确认结论在一般生物学意义上说得通。

随着 DNA 测序技术的成本持续下降，而速度、读长和准确性不断提升，我们对序列数据进行人工审查、分析、存储和共享的能力也必须同步提升。用于开展系统发育分析和其他生物信息学分析的工具与整合平台仍在不断涌现，因为科学家正在持续开发序列信息的新用途与新应用。在“big data”时代，系统发育学和生物信息学面临的障碍，已经不再是能否产生数据，而是是否有足够多具备专业能力的人来完成分析，以及是否有足够的基础设施来支撑这些计算（Muir et al. 2016）。因此，能够对基因、基因组、蛋白质以及其他分子与系统层面信息开展系统发育分析的分析人员和生物信息学家，今后仍会持续保持高需求。

此外，工具和算法的accuracy、sensitivity 和 specificity（见 Box 5.4）必须以系统化、定量化的方式进行评估，才能明确各自的优势与局限。只有这样，研究共同体才能判断哪些工具和算法最适合特定任务，以及不同方法得到的结果应如何进行比较与整合。

展望未来，针对海量可用数据开展的各种整合式生物信息学与系统发育分析，将为我们理解世界提供新的路径，也会帮助我们学习如何适应不断变化的环境。系统发育学的发展，以及地球生命本身的演化，都可以借用一条广为流传的 Charles Darwin 名言变体来概括——这句话被镌刻在 California Academy of Sciences 总部石地板上：

> “It is not the strongest of the species that survive, nor the most intelligent, but the one most responsive to change.”

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Internet Resources

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References

以下参考文献题录按原书英文原文保留：

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第10章 Expression Analysis

10.1 Introduction

范围：PDF page 299；对应印刷页码 279。下一小节 Step 0: Choose an Expression Analysis Technology 已排除。

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2003 年人类基因组完成测序，使我们第一次获得了一个相对完整的人类全部基因初步目录（Lander et al. 2001；Venter et al. 2001）。尽管自第一版草图序列发布以来，基因组本身以及其中编码的基因集合又经历了大量演化，但围绕基因表达如何被调控、以及这些表达数据如何用于刻画不同表型状态并探索其性质的问题，至今仍有许多尚未解决。事实上，我们已经知道：即便在同一个个体体内，同一套基因组也会在不同细胞类型中呈现出截然不同的表现形式，而这些基因表达谱还会随着不同条件而变化，包括健康状态与疾病状态之间的变化。

科学家在基因组完成测序之前就已经意识到这些问题的重要性，并发展出多种方法来检测不同表型之间 RNA 表达的差异。早期技术一次只能检测一个或少数几个基因，但 DNA microarray 技术的出现，使研究者能够同时检测大量基因，从而把表达分析扩展到全基因组尺度（Schena et al. 1995）。此后，DNA microarray 被广泛用于探索模式生物和人类疾病中的基因表达模式（DeRisi et al. 1996；Spellman et al. 1998；Golub et al. 1999；Perou et al. 1999；Callow et al. 2000；Konstantinopoulos et al. 2011）。

不过，基于 microarray 的早期基因表达分析也带来了明显挑战，许多早期研究都受到可重复性不足问题的困扰（Ioannidis et al. 2009；Ishmael et al. 2009）。随后，计算生物学家与实验生物学家在实验流程和分析方法上投入了大量工作，逐步建立起更加稳定的实验室操作规范和分析流程，使 DNA microarray 研究结果的一致性显著提高，同时也进一步凸显出严谨实验设计与重复设置的重要性（Hegde et al. 2000；Simon et al. 2002；Irizarry et al. 2003, 2005；Bolstad et al. 2004；Larkin et al. 2005；Quackenbush 2005）。

随后，ultra-high-throughput sequencing 技术的引入，又推动了 RNA sequencing (RNA-seq) 的发展。这类实验不再像 microarray 那样强烈依赖预先设定“要测哪些分子”的假设，而是能够以更开放的方式检测转录本（Kahvejian et al. 2008；Nagalakshmi et al. 2008）。虽然 RNA-seq 在表达测定的技术路径上与 microarray 明显不同，但稳健 RNA-seq 分析方法的建立，实际上仍然继承了许多在 DNA microarray 发展过程中总结出来的基本经验教训。

本章的目标，是按步骤介绍开展基因表达评估时需要考虑的问题与常用方法：从实验设计出发，逐步进入数据标准化、样本比较与结果解释等核心环节。虽然本章属于入门性介绍，但作者希望这里提供的内容能够成为读者后续深入研究的起点，并引导读者进一步系统学习本章涉及的各种方法。

Ch10 Step 0: Choose an Expression Analysis Technology

第10章 表达分析 / 第0步：选择表达分析技术

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引言

尽管 RNA-seq 目前是主流技术，看似从这个角度切入不太寻常，但 DNA microarray（DNA 微阵列）至今仍被广泛使用，并且在开发实验和分析方案时，它相对于 RNA-seq 的一些优势值得纳入考量。这两种技术的应用流程都始于从感兴趣样本中提取和纯化 RNA，并利用来自逆转录病毒的逆转录酶（reverse transcriptase）将这些 RNA 逆转录为互补 DNA（cDNA）。随后，通过测序或杂交的方式测定基因组中各基因的相对丰度。这些丰度数据再被用于下游分析，以理解不同生物状态之间基因表达模式的变化规律，并揭示这些变化如何帮助我们认识所研究系统的生物学特性。尽管现有技术在原理上存在共性，但它们之间也确有值得关注的差异。

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DNA 微阵列（DNA Microarrays）

DNA 微阵列是首个实现全基因组层面基因表达分析的技术。DNA 微阵列的工作原理是检测溶液中标记的 cDNA 靶分子与固定在固相载体表面单链基因特异性 DNA 探针之间的杂交事件。尽管 DNA 微阵列在早期曾受到噪声问题的困扰，经常出现结果不可重复的情况，但技术的进步和分析方法的完善已大幅提升了其所产生数据的质量。DNA 微阵列还具有其他多项值得考虑的优势。

第一，DNA 微阵列的基因内容（gene content）是明确已知的，即每个被检测表达情况的基因或转录本都由一个或多个探针（或探针组）来代表。这种设计的一个好处是，我们事先就知道哪些基因会被检测；因此，通常可以相当有把握地判断某个特定基因是否表达以及其相对表达水平。虽然可能存在交叉杂交或其他伪影（如不同的杂交效率），但商业化阵列的质量和当今实验室操作流程的稳健性已经使检测质量和可重复性大幅提升。

第二，由于该技术已经相当成熟，几乎在微阵列分析的各个环节都有经过充分验证的分析方法可用。DNA 微阵列分析工具最核心的单一资源库是 Bioconductor，其中拥有大量、成熟的微阵列分析全流程方法。

第三，通过 Gene Expression Omnibus（GEO）和 ArrayExpress 数据库，可以获取海量的 DNA 微阵列数据资源。这些数据库提供了额外的独立数据集，可用于估算验证单个实验结果所需的样本量。

值得注意的是，尽管 Bioconductor 也包含许多 RNA-seq 数据分析方法，但在最佳实践的共识形成方面，RNA-seq 远不如微阵列分析成熟。此外，虽然 GEO 和 ArrayExpress 中也包含 RNA-seq 数据，但这些数据仅占这两个资源库总数据量的一小部分。虽然可以通过比较微阵列数据与 RNA-seq 数据来判断大致趋势，但无法直接将微阵列的杂交信号强度与 RNA-seq 的 reads 计数进行对比。

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RNA-seq

RNA-seq 的历史可以追溯到 1990 年代的 cDNA 测序，以及 2000 年代初的基因表达系列分析（Serial Analysis of Gene Expression, SAGE）——一种允许对短 cDNA 片段进行测序的技术。然而，RNA-seq 真正发展成为独具特色的方法，是在过去十年间随着超高通量测序（ultra-high-throughput sequencing）的出现而实现的：从极少量的 RNA 出发，即可产生数千万条（甚至更多）序列 reads。

RNA-seq 之所以迅速成为基因表达谱分析的主流技术，原因有以下几点。

第一，RNA-seq 不仅能够测量"基因"的表达水平，还能提供单个等位基因（allele）和转录变体（transcript variant）表达水平的信息。尽管这种灵活性使得该技术具有独特性和开放性，但实际上很少有研究真正利用了这一能力，大多数分析仍回归到考察转录本的总表达水平。此规律的最显著例外是在癌症中利用 RNA-seq 识别融合转录本（fusion transcripts）——这是 DNA 微阵列完全无法实现的应用。

第二，RNA-seq 方法随着时间推移已显著改进，如今只需更少量的 RNA 即可作为起始材料。RNA-seq 的应用还包括来自单个细胞的转录组分析，这需要专门的分析方法来应对数据的稀疏性（见 Single-Cell Sequencing）。使用少量起始材料还意味着可以从单个生物样本中采集小型活检样本，或获取多种不同类型的数据（如 RNA-seq 和 DNA 甲基化数据），从而使整合分析变得可行。

第三，RNA-seq 不受预定义转录本集合的限制。RNA-seq 实验能够揭示尚未被描述的"新"基因的表达情况，包括非编码 RNA（non-coding RNA）的转录水平。RNA-seq 数据也可用于检测聚腺苷酸化病毒转录本序列（polyadenylated viral transcript sequences）。

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选择权在你手中（The Choice is Yours）

尽管微阵列仍是一种可行的替代方案，但微阵列与 RNA-seq 之间的成本差距已降至使 RNA-seq 通常成为默认选择的程度。有鉴于此，本章将重点介绍 RNA-seq 分析，并在读者有兴趣了解微阵列表达分析方法时，引用本书的前版内容。然而，表达分析的许多通用原则是相通的，可以作为思考各类大规模基因组研究的通用模板，因此在下面的讨论中也会包含一些相关案例。

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> 边界说明：PDF page 301 底部出现的 "Step 1: Design the Experiment" 及后续正文已排除，不属于本节范围；下一节将处理实验设计相关内容。

Ch10 Step 1: Design the Experiment

第10章 表达分析 / 第1步：设计实验

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实验设计的基本逻辑

在生物学中，大多数成功的实验都建立在成熟的假设检验（hypothesis testing）思想之上。我们首先识别一个问题，并提出一个可能的机制。随后，设计一种能够检验该假设的扰动方式，对系统施加干预，并收集数据，以观察是否出现与所提出机制一致的变化。我们在系统中观察到的响应，将支持或否定原先的假设。

在这类实验中，我们通常会尽量严格控制变量，从而精确测量它们的影响，并且一次只扰动一个参数。良好的实验设计还要求有足够的重复，以便估计我们希望测量的效应大小。

全基因组基因表达技术改变了我们处理生物学问题的方式。过去我们常常只关注单个基因，而现在可以同时考察某个系统中数千个基因的响应，并寻找与表型变化相关的表达模式改变。我们既可以利用这类大规模实验来检验既有假设，也可以根据基因表达模式的变化生成新的假设，再在后续实验中进一步验证。不过，基因组尺度技术所带来的观察范围和数据规模，并不意味着我们可以忽视实验设计与数据分析的严谨性。

像所有实验一样，一个基因表达谱实验应当始于一个定义明确的问题，并且实验必须收集足以回答该问题的数据。最常见的实验设计，是比较两组实验组别（groups 或 cohorts），例如处理组与对照组，或患病人群与健康人群。设计这类研究时，一个关键要素是确保实验具有足够数量的独立生物学重复（independent biological replicates），从而使处理组和对照组在样本规模上足以支持合理比较。

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功效、验证与样本量

在大规模转录表达谱实验中，功效与样本量（power size）计算 notoriously difficult，也就是出了名地难做，原因很大程度上在于：表达水平本身波动很大，而相对效应大小在实验开展前通常并不清楚。一个可行策略，是先做一个小规模预实验（pilot experiment），从中识别潜在信号，用来估计效应大小，然后据此进行更严格的统计功效计算，并设计完整实验。

另一种策略，则是把视野放到原始实验之外，在整体方案中预先纳入验证阶段（validation stage）。例如，可以使用一种独立技术——如 reverse transcription polymerase chain reaction（逆转录聚合酶链式反应，RT-PCR）——去验证一个较小的“显著基因集”（significant gene set）；更理想的做法，是纳入一个独立的验证人群（validation population），再对其单独进行表达谱分析，以评估原始结果是否成立。

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混杂因素、批次效应与元数据

另一个重要考虑，是设计一种能够避免混杂（confounding）并消除批次效应（batch effects）的实验策略。这既包括样本采集的实验安排，也包括基因表达数据采集的实施策略。具体而言，应尽量确保“处理组”和“对照组”样本在同一时间、相同条件下被采集；并且在 RNA 提取、文库构建以及测序数据生成等环节中，对样本进行合理混合（mixing）。

一个重要却常被忽视的问题是：待分析样本是否具有充分的元数据（metadata）。例如，如果分析的是乳腺癌样本，就必须了解每个样本的疾病亚型（disease subtype），并在实验设计阶段考虑各亚型的分布情况。如果缺少这些信息，再考虑到 RNA-seq 实验中样本数相对于被检测基因数往往很少，就很容易出现这样的情况：观察到的表达差异，其实只是样本被分配到不同组别时某种偏倚的结果。

作者举了一个具体例子：他们曾分析过一个据称能够根据原发肿瘤表达谱预测乳腺癌肺转移（lung metastasis）的基因特征（gene signature），后来却发现，用于识别该特征的所有发生转移的样本都属于 basal subtype（而这正是最容易向肺转移的亚型）。换句话说，这个特征实际上预测的是 basal subtype，而不一定是真正预测转移本身。因此，在分析数据之前，必须考虑处理组与对照组之间是否存在人口统计学差异（demographic differences），不同亚群患者所接受的治疗是否不同，患者是否来自不同医院或国家，以及样本是否以不同方式采集和处理。

信不信由你，这些混杂因素都曾在已发表研究中真实出现过，而且几乎都本可以事先避免。与其在数据分析阶段再费力解释这些问题，不如在实验开始之前就主动识别潜在混杂因素，这样更值得投入精力。

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从分析策略反推实验设计

作者提出了一种非常实用的方法：先从你在数据收集完成后打算采用的分析策略（analytical strategy）出发，再反向推导实验设计。这样可以确保你拥有足够数量的样本，以及恰当且完整的元数据，从而保证所获得的数据和信息真正能够回答你的实验问题。

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> 边界说明：本节止于 PDF page 302 中 Step 2 标题前；Step 2: Collect and Manage the Data – and Metadata 及其正文已排除，不属于本节范围。

Ch10 Step 2: Collect and Manage the Data – and Metadata

第10章 表达分析 / 第2步：收集并管理数据——以及元数据

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为什么这一步不能被忽视

一次转录表达谱实验，通常包括对对照系统施加某种扰动、采集生物学样本，然后生成最终要被分析的数据。乍看之下，收集并管理这些相关数据似乎是理所当然的事情，但现实中，这恰恰是一个经常被忽视、并且日后很容易“反噬”研究者的环节。

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数据存在哪里不是最关键，关键是要有组织

处理这类问题的方法有很多。最简单的做法，是把数据存放在共享硬盘的某个文件夹中；更系统的做法，则是建立数据库，把最终数据统一纳入其中。无论采用哪一种策略，最重要的一点始终不变：必须保持组织有序，并清楚记录每一份数据分别对应哪个项目。

换句话说，这一步的核心并不在于你选用了多复杂的存储平台，而在于数据管理是否可追踪、可核对、可复现。如果样本、文件、项目和后续分析之间的对应关系没有被明确记录，那么即便前面的实验做得再认真，后面的分析也会很容易陷入混乱。

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> 边界说明：本节从 PDF page 302 底部真实标题 Step 2: Collect and Manage the Data – and Metadata 开始，包含其在 PDF page 303 顶部延续的正文；PDF page 303 中部再次出现的 Step 3: Data Pre-Processing 标题及其后正文均已排除，不属于本节范围。

第 10 章 表达分析

第 3 步：数据预处理（Step 3: Data Pre-Processing）

在数据分析的初始阶段，人们可以采用多种策略来管理数据：既可以将数据简单地存放在共享磁盘的某个文件夹中，也可以创建一个数据库来统一存放所有数据。无论选择哪种策略，最重要的是保持有序的组织习惯，并清楚地记录每份数据对应哪个项目。

在数据能够用于实验组之间的比较或其他任何用途之前，必须首先将原始数据映射到具体的基因或基因转录本。尽管这一步看起来相当简单，但实际上可以采用多种不同的方法——而这些不同的方法，自然也可能导致不同的最终结果。虽然存在许多公认的进行数据预处理的方法，但研究者应当注意并仔细记录自己在从原始数据中识别基因转录本时所做的选择。

DNA 微阵列

对于 DNA 微阵列而言，原始数据的映射似乎很简单，因为人们通常认为微阵列不过是由一系列针对每个目标基因设计的固定探针组成的阵列。然而，许多微阵列——最著名的是 Affymetrix GeneChip——实际上使用成组的探针（即"探针组"）来共同定义一个基因的表达。事实上，Affymetrix 芯片的设计不仅包含利用参考基因序列设计的"完全匹配"（perfect match, PM）探针组，还包含了"错配"（mismatch, MM）探针——这些探针的序列中央仅有一个碱基与参考序列不同。PM 探针用于提供杂交信号的估计值，而 MM 探针则用于估计由非特异性杂交和背景荧光造成的背景信号。

探针到基因的映射信息通常包含在"芯片设计文件"（chip design file, CDF）中，该文件作为输入进入任何分析流程的早期阶段，用于建立荧光强度与基因表达水平之间的映射。研究界对于究竟应该使用哪些数据来进行探针映射，存在相当大的争议：有人主张仅使用 PM 探针，有人开发了非标准的 CDF 文件，而大多数研究者则使用 Affymetrix 提供的 CDF 文件。与基因表达分析的许多其他方面一样，这里没有绝对正确的答案——只需要做出一个合理的选择，并记录下这一决定，以便他人能够重现分析。然而，研究者必须始终清楚探针映射到的是哪些基因标识符（以及这些标识符的哪个版本）——无论这些标识符是官方基因名、RefSeq ID、Ensembl ID 还是其他类型，因为这些决策都会影响后续涉及将表达数据映射到生物通路或功能分类系统（如 Gene Ontology, GO）以及使用基因集富集分析等技术时的分析结果。

RNA-seq

RNA-seq 面临着类似的一系列挑战，不过其映射过程的神秘性要低一些。RNA-seq 的原始输出是一组序列 reads，这些 reads 被映射到一组基因或基因转录本上。为此，最常用的方法是"基于参考序列的组装"（assembly on reference）：先将 reads 映射到基因转录本，然后进行组装，最后量化每个基因的整体代表性。在此过程中，参考数据库的选择决定了映射结果。研究者可以选择 RefSeq、Ensembl 基因或其他任何合适的参考序列。目前已开发出大量用于 reads 映射、组装和量化的算法，包括 Burrows-Wheeler aligner（BWA）（Li and Durbin, 2009）、Bowtie/Bowtie2（Langmead et al., 2009; Langmead and Salzberg, 2012）以及 STAR aligner（Dobin et al., 2013）。

近年来，为了应对日益庞大的 RNA-seq 数据集，研究者开发了伪比对（pseudo-alignment）和拟映射（quasi-mapping）方法，包括 Salmon（Patro et al., 2017）、Sailfish（Patro et al., 2014）和 Kallisto（Bray et al., 2016）。这些方法专门设计用于削弱大数据带来的计算复杂性，包括内存限制问题。伪比对和拟映射绕过了全比对的过程，其核心思想是用 k-mer 来表示转录组，然后通过哈希表将 k-mer 映射到 de Bruijn 图表示（一种表示 k-mer 之间重叠关系和映射路径的图形化方法）或后缀数组（suffix array，即一个 k-mer 的所有扩展或后缀的有序数组）。通过合理定义哈希函数，可以忽略参考序列的大部分内容，从而将 reads 查询映射到有限的潜在目标上。

小结

与基因组数据分析的许多方面一样，对于最优方法的选择目前尚无明确共识，而且方法本身也在不断演进。重要的是从标准方法中进行选择，对希望分析的数据始终如一地应用同一方法，并以确保分析可被重现的方式记录自己的选择——包括记录所使用的软件版本和数据库版本。

Step 4: Quality Control

作为科学家进行的任何测量都包含误差。有些误差是随机的，分析所用的统计方法正是用来在自然变异中估计真实信号；有些误差是系统性的，同样可以用统计方法进行估计和处理。然而，有些误差源于失败的实验，最佳处理方式是识别并剔除这些失败实验产生的数据。在基因表达分析实验过程中，这类误差可能来自 RNA 样本中的污染物、劣质的实验试剂，或者简单的实验室操作失误。

一旦获得原始数据，最重要的问题之一就是判断这些数据是否具有足够的质量，能够进入后续的分析流程。尽管生物变异是任何数据集中都希望体现的特征，但毫无疑问，失败的实验应当从待分析数据集中剔除。实验室中的表达分析涉及许多复杂步骤，从降解的输入 RNA 到劣质试剂再到简单的操作失误，任何环节出问题都可能产生噪声水平极高的数据，使任何有意义的分析都无法进行。幸运的是，现已有一系列工具可用于分析微阵列表达分析和 RNA-seq 实验产生的数据，为微阵列和基于测序的数据提供了成熟的指标体系。与该领域的所有内容一样，用于分析这些数据的工具也在快速发展，因此建议读者关注相关文献综述或向正在进行基因表达分析的同行了解可能出现的新方法。

Quality Control Tools

Bioconductor 软件包 arrayQualityMetrics 提供了一套广泛的工具（包括许多从其他 Bioconductor 软件包整合而来），用于评估单色和双色微阵列数据的质量。作为 arrayQualityMetrics 包的输入，用户需提供一个微阵列强度矩阵，并可选地提供样本和探针信息，这些信息以 Bioconductor 对象形式组织，如 AffyBatch、ExpressionSet、NChannelSet 或 BeadLevelList 对象——这些对象将不同技术的表达数据与表型信息相关联。arrayQualityMetrics 的输出包括每个阵列的伪彩色图像和 MA 图，用于评估数据质量。在 MA 图中，M 值是两个强度的对数比，A 值是强度的对数平均值。对于双色阵列，这些图使用每个通道的强度；对于单色阵列，M 值使用每个样本的中位强度作为比值的分母。图 10.1 展示了一个在标准化前后 MA 图的示例，其中可见标准化过程消除了水平轴以下的系统性曲率。

还有其他多种诊断图可用于识别单个劣质阵列或整体较差的数据集。这些包括来自 affy 包的 RNA 降解图（Gautier et al. 2004）、来自 affyPLM 包的相对对数表达（RLE）箱线图和归一化未缩放标准误差（NUSE）箱线图（Brettschneider et al. 2008），以及来自 simpleaffy 包的 QC 统计图（Wilson and Miller 2005）。这些质量控制工具的结果被整合到一个 HTML 文档中，为理解已收集的原始数据提供了宝贵的资源。

对于 RNA-seq，FastQC 是一个广泛使用的软件包，以与微阵列 arrayQualityMetrics 包非常相似的方式，为原始高通量测序数据提供了一系列简单的质量控制检查。FastQC 包含多个分析模块，允许用户探索序列质量的各个方面，提供多个汇总图和表格，并将结果导出为基于 HTML 的报告。FastQC 中的模块可提供基本统计信息，包括 reads 数量、读长和 GC 含量。用户还可以查看箱线图，显示沿所有 reads 每个位置上序列质量分数的逐位评估，以及每个序列质量分数的分布图。这两种图都可以对测序运行的整体质量提供良好的评估。

另一个用于评估整体序列质量的有用图是 per base sequence content（逐碱基序列组成）。对于任何基因组，GC 含量应沿任意随机序列 reads 的长度保持一致，即 %A = %T 且 %G = %C。然而，文库制备方案通常会在待测 DNA 的 5' 端连接短的引物和接头序列，而这正是预期看到 GC 分布显著偏离的位置。相关的度量是 per base N content（逐碱基 N 含量），用于量化因无法以足够置信度调用碱基而将定义核苷酸替换为 N 的频率；该信息有助于识别测序反应中的失败循环。

图 10.2 展示了一组 RNA-seq 样本相对于参考序列的碱基错配（MM）率直方图示例。虽然大多数样本的 MM 率较低，但仍有一些离群值可从下游分析中移除。还有其他工具可识别异常的序列重复水平、过度代表的序列、未检出的接头和过度代表的 k-mers。FastQC 还包含用于分析 microRNA、宏基因组序列和表观遗传学检测（如甲基-seq）的工具。

提供研究整体质量概览的一个令人兴奋的新工具是 MultiQC。该工具将多个样本的质量控制报告（来自 FastQC 以及其他工具）聚合在一起，在单个易于阅读和理解的 HTML 报告中呈现，可帮助识别并随后从分析中移除低质量样本。

Screening for Misidentified Samples: PCA on Y Chromosome Expression

我们尚未触及的一个要素是与每个样本关联的注释质量。任何分析最终都依赖于将样本分配到不同组别、比较组间表达水平，以及确保没有可能扭曲分析的混杂因素。分析的质量（以及我们对结论的信心）取决于个体被分配到特定组的可靠性；这反过来又取决于我们是否能准确地将每个样本与适当的注释元数据（如个体的性别、年龄、治疗状态和其他表型数据）相关联。虽然这看起来相对简单，但样本的错误注释是一个比人们预期更常见的问题。例如，发现 GEO 中 46% 的研究存在劣质或错误的注释——这些错误在提交前通过简单的验证步骤就可以很容易地识别出来（Toker et al. 2016）。

通常很难测试样本注释的准确性，因为大多数实验的目的通常是发现组间差异，而不是利用已知差异将样本分配到组别。不过，对于几乎任何数据集都可以运行一项测试来了解样本注释的质量：男性和女性的注释是否正确。如果简单地查看 Y 染色体基因的表达并进行主成分分析（PCA；见 Principal Component Analysis），则预期会发现两个明显不同的组，因为女性不表达 Y 染色体基因（Paulson et al. 2017）。

作为一个示例，我们分析了来自 The Cancer Genome Atlas（TCGA；来自 Genomic Data Commons [GDC] Data Portal）的结直肠癌基因表达数据，以及来自 GEO 的五个结直肠癌数据集（GSE14333、GSE17538、GSE33113、GSE37892 和 GSE39582）。当我们使用 PCA（见 Principal Component Analysis）分析 Y 染色体基因的表达时，发现了两组明显不同的样本——一组表达这些基因（因此可能是男性），另一组仅有背景噪声水平的表达（因此可能是女性）。然而，我们发现 TCGA 的 456 个样本中有 11 个（2%）存在性别错标：有些样本虽标注为女性，却与男性样本聚类（因此表达 Y 染色体基因）；另一些则应为相反情况。相比之下，在 GEO 数据集中，我们发现 1376 个样本中有 85 个（6%）按性别错误聚类。虽然我们可以从下游分析中移除这些错标样本，但我们放弃了其中一个 GEO 研究，因为其错标率接近 15%，这让我们对其余样本注释的真实性也产生了怀疑。

Step 5: Normalization and Batch Effects

The Importance of Normalizing and Batch-Correcting Data

任何基因表达分析的输出，都可以表示为一个由正值填充的表达矩阵，这些数值代表每个样本中每个探针或基因的观测表达水平。对于 RNA-seq 数据，这类数据也可表示为“计数矩阵（count matrix）”C：其中每一行对应一个基因，每一列对应一个样本，而矩阵中每个位置的条目则表示在该特定样本中比对到该基因的 reads 数目。

可将其形式化写为：C = [c11 c12 … c1n; c21 c22 … c2n; … ; cm1 cm2 … cmn]。

如果世界足够完美，我们只需逐基因比较不同样本组之间的表达值或 read counts，就能直接比较它们的表达水平。但现实中有许多因素会扭曲这些数据，例如起始 RNA 量不相等、文库制备中的伪差、杂交或测序效率差异，以及其他各种问题。

标准化（normalization）是数据分析中的常规步骤，它使我们能够在不同样本或不同数据集之间进行可比的比较。比如在 northern blot 分析中，常会使用 actin 或 GAPDH 这类 housekeeping genes 来校正每个样本中其他基因的杂交信号，以补偿实验中样本量的变化。这里隐含的假设是：一个或多个基因在所有样本中的表达水平保持一致，因此可以把这种“基线”用作校正其他基因测量值的参照。总体而言，存在若干类标准化过程，可用于实现样本间或基因间的比较。

FPKM and Count Data

在 DNA microarray 中，每个基因通常由一组大体等价的探针表示。例如，在 Affymetrix 芯片上，基因由 probe sets 表示。每个 probe set 中的探针长度均为 25 bp，并包含一一对应的 PM 和 MM probes，它们只在一个碱基上不同（而且恰好位于探针正中间）。此外，每个 probe set 所含探针数相同，并定位于其目标转录本的 3' 端附近，以尽量保证从 RNA 制备杂交文库时具有近似一致的效率。

但在 RNA-seq 数据分析中，按基因进行标准化时考虑的问题会有所不同。RNA-seq 需要先制备文库并测序；如果只是简单统计每个基因获得的 reads 数，那么较长的基因天然更可能获得比短基因更多的 reads。因此，原始计数数据通常会被转换为 reads per kilobase million（RPKM）、fragments per kilobase million（FPKM）或 transcripts per million（TPM）等数值。三者的计算方式略有差别，但都以将 reads 比对到转录本并对结果进行缩放为起点。

RPKM 的计算方式是：先统计比对到某个转录本的 reads 数目，再除以“每百万比对到基因组的 reads 数”，并进一步按该基因长度进行标准化。最后这一步是为了校正这样一个事实：一个 2 kb 的基因天然会比一个 1 kb 的基因多获得大约两倍的 reads。例如，若有 400 万条 reads 比对到某个基因组，其中 5000 条比对到一个长度为 2 kb 的特定基因，则该基因的 RPKM 值为 625（[5000/2]/4）。FPKM 是 RPKM 的扩展形式，适用于 paired-end sequencing，因为在这种情形下，一个 RNA-seq 文库片段的两端都会被测序。FPKM 的基本思想与 RPKM 相同，只是额外考虑到两条 reads 可能来自同一个片段。

TPM 与上述指标相似，但它被标准化到统一的“每百万”尺度上，因此更便于样本间比较。TPM 的计算方法是：先对每个基因，用 reads（或转录本数）除以该基因的长度（单位为 kb），得到每个基因的 reads per kilobase（RPK）值；然后将基因组中所有基因的 RPK 值求和，得到累计 RPK；再将该累计值除以 100 万，得到一个“scaling value”；最后，再用每个基因的 RPK 除以这个 scaling value，即得到每个基因的 TPM。概念上，TPM 与 microarray 的测量值最为接近，因为它既考虑了每个基因的长度，也比较了标准化后的转录本计数。

Sample and Quantile Normalization

随着使用 DNA microarrays 产生的高通量基因表达数据分析越来越多，人们很快发现，所谓存在“恒定不变”的 housekeeping genes 这一假设并不成立；事实上，所有基因的表达水平都会发生变化。在缺乏可靠参照的情况下，新一代标准化方法的重点转向：考察一个样本中所有基因表达水平的分布，再将不同样本的分布调整得彼此相似。

最初，人们曾采用对单个样本的平均表达水平或中位表达水平进行校正的方法，但这类方法无法补偿由实验伪差导致的分布差异。如果我们假设一个细胞所能产生的 RNA 总量是有限的，那么当某些基因表达升高时，其他基因的表达就应相应降低，从而使相关样本的整体表达分布保持一致。

从概念上讲，一种简单做法是观察基因表达值的分布，并将其切分为更小的区间，也就是 quantiles（分位区间）。随后，可以按 quantile 逐段调整数据，使实验中的所有样本都具有相同的分布，从而能够比较任意特定基因在不同样本之间的表达变化。这个思路听起来相对简单，但仍值得更细致地看一看它的具体过程。

图 10.3 用一个包含 4 个样本和 6 个基因的例子展示了 quantile normalization 的过程。我们把这些测量值表示为一个 genes-by-samples 矩阵，并用三个简单步骤实现标准化。第一步，按照图中的蓝色箭头，对每个基因计算其在所有样本中的中位值，并将这些中位值从低到高排序。第二步，按照绿色箭头，对每个待分析样本，将每个基因的表达值替换为它在该样本内从低到高的秩（rank），从而得到一个 rank matrix。第三步，按照金色箭头，将 rank matrix 与上述排序后的中位值集合结合起来，用对应秩次的中位值替换 rank matrix 中的秩值。

在该图示例中，所有 rank 1 的基因都被赋予表达值 6，所有 rank 2 的基因都被赋予表达值 9，依此类推，于是原始数值就被这些按秩排序后的中位值所替代。这种方法背后的一个重要假设是：所选参考对于所有样本都适用；但在底层生物学差异较大的情况下（例如同时分析多种组织类型），这一假设未必成立。尽管这一过程乍看之下有些反直觉，但研究表明，这种方法能产生稳健且具有可重复性的表达值，从而可在样本间进行比较（Bolstad et al. 2003）。

Figure 10.3 展示了 quantile normalization 的总体思路：左上角方框中给出了 4 个样本、6 个基因的表达数据；首先计算每个基因的中位表达值并从低到高排序（蓝色箭头）；然后根据各样本中的表达高低对基因排序（绿色箭头）；最后，用排序后中位值中对应秩次的数值替换 rank matrix 中的秩（黄色箭头）。

Additional Methods of Sample Normalization

标准化方法的选择几乎是任何基因表达分析讨论中最容易引发争议的问题之一，因为每种方法都依赖一组特定假设，而这些假设对具体数据集而言，可能有人认为合理，也可能有人认为并不充分。下面介绍 4 种已被广泛使用的补充标准化方法（Li et al. 2015）。

Counts per Million

counts per million（CPM）缩放方法与 TPM 相似，都是把计数值标准化到统一的“每百万”尺度上，以便更容易在样本之间进行比较。CPM 及其他缩放方法的基本假设是：每个细胞产生的 RNA 总量大致相同，因此总 reads 数或总 counts 应该保持恒定。计算 CPM 时，只需先汇总每个样本的 reads 总数，再对所有样本的 read counts 做缩放，使其总量相等。CPM、TPM 以及按基因长度标准化后的数值，都是 RNA-seq 早期基因表达分析中最常见的标准化方法。

Upper Quantile Normalization

这种缩放方法假定：在低到中等表达水平范围内，各样本的计数分布彼此相似，但在高于第 75 个分位点后开始出现偏离。该方法的做法很直接：将各样本中低于第 75 分位点的 counts 规模调整为彼此一致，并令标准化后的计数 yij 按如下方式缩放：yij = cij / q75j。

Relative Log Expression

这种方法假设：各样本中的计数值与跨样本的基因表达几何均值高度一致，并且 read count 的频率会随着测序深度呈指数增长。RLE 使用每个样本的几何均值，并对样本中的 reads 进行缩放，使所有样本的几何均值相同。对于每个样本，其标准化因子被定义为：特征 read counts 与所有样本对应 read counts 几何均值之比的中位数。DESeq（Anders and Huber 2010）和 DESeq2（Love et al. 2014）都采用该方法作为默认标准化策略，后文还会继续介绍这两个框架。

Trimmed Mean of M Values

trimmed mean of M values（TMM）方法建立在“绝大多数基因并不存在差异表达”这一假设之上。TMM 选取一个样本作为参考，然后将其余每个样本与该参考进行比较，计算 log fold-change（在 microarray 分析中通常称为 “M” 值），去掉最外侧 30% 的 M 值，再计算平均 M0 值，并将其缩放到所有样本之间相等。TMM 被用于 edgeR（Robinson et al. 2010）的检验框架中，后文也会进一步讨论 edgeR。

Batch Correction

batch correction（批次校正）是任何大规模基因组学分析中的另一个关键环节；更广泛地说，凡是以分组方式采集测量值、或者在不同时间采集不同样本的科学研究，都会面临这一问题。所谓 batch effects，是指由系统性误差带来的偏差来源，例如使用了不同批次的试剂、处于不同实验室条件、处理了不同时间采集但相似的样本，或者仅仅因为不同实验人员执行同一实验时存在内在差异。由于每个样本通常都会产生大量测量值，因此在高通量实验中，batch effects 尤其明显。

抵御 batch effects 的第一道防线，是良好的实验设计。理想情况下，应尽量在同一时间采集所有样本，并在同一时间、同样条件下、使用同一批试剂完成检测。对于样本量很大的研究，这通常并不现实；这时次优但非常重要的策略，是在实验的每个环节都混合安排 cases 和 controls，避免样本分组与批次效应发生混杂。举例来说，如果周一测 controls、周二测 cases，那么任何可能出现的 batch effect 都会与 case/control 状态完全纠缠在一起，使得差异根本无法分辨。而若将 cases 与 controls 混合处理，就能在很大程度上抵消潜在的批次影响。

检测 batch effects 的一个非常简便的方法，是基于基因表达数据绘制 PCA 图（见 Principal Component Analysis），其中图中的每个点代表一个样本。首先，可以按实验条件给点着色（例如 cases 与 controls）。在理想情况下，我们希望看到不同条件之间有清晰分离；但现实中看到的结果，会取决于信号、噪声以及潜在 batch effects 的共同作用。接着，还可以根据其他相关变量重新给这些点着色，比如样本采集日期、RNA 提取日期、标记或文库构建日期、芯片批次或测序运行批次等，以观察是否出现某种模式。理想状态下，PCA 图中除条件分离外不应出现其他结构；但事实上，经常会看到同一批次的样本聚在一起，或不同批次彼此分离。批次效应校正试图控制的，正是这些差异。若希望更高通量地识别问题，则突出显示 PCA 成分与表型变量、批次变量之间的相关性，通常是一种很有用的技术。图 10.4 就给出了一个逐步展示这一过程的示例。

需要指出的是，尽管 PCA 非常有用，但它通常只能捕捉较大的 batch effects。实际上，单个基因或某些基因子集也可能受到实验条件的不利影响，从而改变任何下游分析的结论。

幸运的是，目前已经发展出一些方法，能够处理 batch artifacts：它们通过识别与批次相关的实验信号，并对这些信号进行校正，从而更好地识别真正与实验分组相关的差异表达基因。

两种广泛使用的批次校正方法是 COMBAT（Johnson et al. 2007）和 surrogate variable analysis（SVA；Leek et al. 2012）。这两种方法都会检查表达数据，寻找那些与 batch 相关的基因；而在 SVA 中，相关对象还可以是其他非生物学变量。然而，正如前文所述，只有在相关生物学变量没有与这些非生物学变量发生混杂时，才能识别并纠正这些关联。例如，如果所有 cases 都在一个批次中运行，而所有 controls 都在下一个批次中运行，那么 batch effects 就会与表型完全混杂；这样一来，某些本来由非生物学因素导致的差异，就会被误判为真实的生物学差异。要发现并消除 batch effects，就必须尽可能让每一个实验组都在每一个实验室批次中得到代表。

Figure 10.4 展示了一个 batch effects 的 PCA 示例。图中使用 BatchQC 软件及其 vignette 所模拟的数据：(a) 为前两个主成分的 PCA 散点图，点代表样本，并按 phenotype condition 着色；(b) 为模拟基因表达数据在各样本中的箱线图，同样按 phenotype condition 着色；(c, d) 则展示了相同数据，但按测序“batch”着色，此时可以看到第一主成分以及基因表达值都出现了显著的批次差异。

第六步：探索性数据分析

在大规模基因组数据的分析过程中，一个常见的问题是：某一群体中是否存在由独特基因表达模式所定义的亚群？这个问题只有在拥有足够数据来搜索可用于识别和区分群体的模式时，才能得到合理的回答。这类无偏倚搜索所使用的方法称为无监督方法（unsupervised methods），因为它们是去发现模式，而非去验证是否能区分预先定义的组别。在这一大类方法中，最常用的三种是：层次聚类、主成分分析（PCA）和非负矩阵分解（NMF）。

如前所述，表达数据的一种便捷表示方式是表达矩阵（expression matrix）——一个基因×样本矩阵，其中每一行是一个"基因向量"（gene vector），代表某一基因在所有样本中的表达水平；每一列是一个"样本向量"（sample vector），代表单个样本中所有基因的表达水平；矩阵中的每个元素代表某一基因在某一样本中的表达值。热图（heatmap）是该矩阵的一种可视化形式，其中每个单元格的着色取决于其信号的强度。层次聚类与 NMF 都根据共有的表达模式对样本和/或基因的子集进行分组，并在热图背景下可视化结果。PCA 则对样本或基因的表达向量（即矩阵的行或列）进行运算。

层次聚类

层次聚类（Hierarchical Clustering）已成为基因表达数据分析中应用最广泛的技术之一，其优势在于方法简单、结果易于可视化（Eisen et al. 1998; Michaels et al. 1998; Wen et al. 1998）。初始时，以 N 个聚类开始，其中 N 为目标数据集中的样本数（或基因数）。层次聚类是一种聚合式方法（agglomerative approach）：单个表达谱被逐步连接形成节点，这些节点又进一步连接，直到过程完成，最终形成一棵层次树。

层次聚类的核心逻辑是：找出彼此最接近的向量，然后根据它们之间的距离将样本归为一组。当然，根据表达谱来测量样本（或基因）之间的距离有多种方式，其中最常用的两种是：欧氏距离（Euclidean distance measure，适用于基因表达的绝对水平重要的情况）和皮尔逊相关系数距离（Pearson correlation distance measure，适用于关注相关性模式的情况）。

选择好距离度量方法后（图 10.5），算法以直接的方式推进。以下说明假设是对样本进行分组，但聚类过程同样适用于基因。

1. 计算所有待聚类样本之间的成对距离矩阵。
2. 在距离矩阵中搜索最相似的两个样本或两个聚类。初始时，每个聚类仅包含一个样本。如果若干对样本恰好具有完全相同的相似度得分，通常随机选择其中一对，但也可以用其他方法来决定选择哪一对。
3. 将选中的两个聚类合并，生成一个新的聚类，该聚类现在包含两个或更多对象。
4. 计算这个新聚类与所有其他聚类之间的距离。无需重新计算所有距离，因为只有涉及新聚类的距离发生了变化。
5. 重复步骤 2–4，直到所有对象归入一个聚类。

图 10.5 展示了层次聚类过程的简化示意。(a) 反复搜索彼此"接近"的样本或样本组，并将它们逐步合并形成更大的聚类。(b) 对应的层次聚类树状图（dendrogram），根据评估得到的相似性将样本连接在一起。

层次聚类方法有多种变体，反映了计算新定义聚类与其他基因或聚类之间距离的不同策略（即所谓的聚合方法，agglomeration methods）：

• 单连锁聚类（single linkage clustering）：使用一个聚类与另一聚类之间的最短距离。
• 完全连锁聚类（complete linkage clustering）：取任意两个聚类之间的最大距离。
• 平均连锁聚类（average linkage clustering）：使用两个聚类之间的平均距离。

通常，样本之间的关系使用树状图（dendrogram）来表示，树中的分支根据聚类过程中的连接关系构建。为了可视化样本之间的关系，用树状图重新排列表达矩阵热图中的行（或列，视情况而定），以显示数据集中的模式（图 10.6）。

图 10.6 热图展示了三个不同心脏组织中 100 个变异性最高基因的基因表达聚类。该热图中的表达水平经过行 Z-score 标准化，以最佳呈现表达差异。低表达用蓝色表示，高表达用红色表示。顶部的树状图使用欧氏距离进行层次聚类，表明三个组织（顶部颜色条）的样本聚为三组。左侧组织（绿色）对这组基因的表达较低，而中间组织（灰色）和右侧组织（橙色）的表达较高。基因集中有一小部分在右侧组织高表达，而在其他两个组织中低表达。

树状图的树形结构使其有助于识别在外观上可以将样本分成若干聚类的位置。然而，与其使用"肉眼检验"，不如使用客观方法来确定聚类的数量及其成员——幸运的是，有多种方式可以搜索这样的分组。

一种方法是直接利用构建聚类时计算的距离，作为每个单独聚类连通性的度量。当从单个元素沿着树状图向上移动时，聚类之间的距离增加；因此，随着距离阈值的增加，有效聚类数减少。另一种方法是使用自助法（bootstrapping）或刀切法（jack-knife）来测量树状图中关系的稳定性，并以此作为聚类数的度量。有多种自助法可以使用，但最简单的一种是：带放回地对数据集进行抽样，每次计算一棵新的层次聚类树状图，然后简单地统计树状图中每个分支被恢复的频率；以树状图上的百分比截断值来设定聚类数。在对基因聚类稳定性进行自助法估计时，应对生物样本集合进行重抽样；而在估计生物样本中的聚类数时，则应对基因表达向量进行自助法。刀切法类似，但并非重抽样，而是依次留出相应的向量，计算新的树状图，直到所有向量都被考虑过。同样，根据每个分支关系在树状图中被恢复的频率来估计每个聚类的稳定性。

许多层次聚类方法存在一个潜在问题：随着聚类的增长，用于计算距离的聚类表达向量可能不再准确地代表聚类内部的任何元素。例如，在对基因进行聚类时，每个聚类的"中心"通常是该聚类中所有基因的平均值；由此产生的基因表达向量的线性组合有时被称为元基因（metagene）。因此，随着聚类的推进，基因本身的实际表达模式变得不那么相关。此外，如果在过程早期做出了错误的聚类分配，该错误将被固定下来且无法纠正。一种可以避免这些问题的替代方案是使用分裂式聚类方法（如 k-means），将数据（基因或样本）划分为具有相似表达模式的组。

尽管聚类方法适用于任何数据集，但在实践中，对于其中许多基因在样本间并不变异的大型数据集，聚类往往效果不佳。因此，可以首先对数据应用统计过滤，选择在实验组之间变异性最大的基因。然而，这种过滤可能会给聚类带来偏差。如果选择能够区分两个实验组的基因，那么过滤最可能产生的结果将是两个聚类恰好落入预先定义的两个实验组中。更无偏的方法是：直接计算每个基因在样本群体中的方差，然后删除在数据集中变化不显著的基因——因为这些基因最不可能揭示样本收集中存在的亚类。但这种方法依赖于各实验组之间有良好的样本平衡。

主成分分析

如果我们观察一个样本×基因的表达矩阵，可以想象每个样本在每个被评估的约 25 000 个基因上都有其独特的表达水平。那么，每个样本都可以表示为该 25 000 维"基因表达状态空间"中的一个点。不难想象，样本集合可以可视化为该 25 000 维空间中的一团点云。然而，许多基因的表达水平可能是相关的，因此它们并不能提供太多可用于分离样本和区分点云中不同样本组的信息。

PCA（图 10.7）是一种降维方法（dimensionality reduction method），它搜索表达水平（即基因表达水平）变量的线性组合，以最佳解释样本之间的方差，然后将数据转换，使基因表达的特征向量（eigenvector。线性变换的特征向量是指当该变换作用于该非零向量时，所有值按相同的标量因子发生变化）按最佳分离数据的顺序排列。这样，数据被转换后，第一个"主成分"解释了数据集中最大的变异量，第二个主成分解释次大的变异量，依此类推。使用这些特征向量坐标来绘制数据，通常更容易可视化样本分离为不同组的情况。这反过来有助于理解表达数据集中的样本是否聚为具有基因表达巨大差异的特定子集。PCA 也是一个良好的质量控制工具，因为技术变异（如批次效应）可以通过直观检查 PCA 图来轻松检测。

图 10.7 对来自 GTEx（Genotype-Tissue Expression）项目 v6 版本的皮肤、全血及由这些组织衍生的细胞系的归一化基因表达矩阵进行主成分分析（PCA）得到的前两个主成分散点图。每个点代表一个样本，并根据其来源着色。第一主成分（PC1）分离了组织类型，第二主成分（PC2）将组织与细胞系分开。

PCA 建立在底层基因×样本表达矩阵的一系列简单线性代数变换之上。PCA 的工作流程示意图如图 10.8 所示。

1. 首先对矩阵（这里是矩阵的行，即基因）进行标准化，使每个基因的表达范围处于相同的尺度。
2. 计算协方差矩阵（covariance matrix），其中条目 ij 是基因 i 与基因 j 之间的协方差。两个基因之间的协方差基本上衡量的是它们在群体中所有样本的表达偏差是否相关。
3. 计算协方差矩阵的特征向量和特征值。特征向量是与协方差矩阵相乘后返回相同向量的向量，其中每个值乘以一个标量因子（即相应的特征值）。特征向量（或主成分）是矩阵的不变量，是基因的线性组合（因此有时被称为"特征基因"，eigengenes）。
4. 用特征向量来重新表述原始数据。这通过将原始表达矩阵乘以特征向量矩阵来实现。
5. 在新特征向量（彼此正交，类似于 x–y–z 轴）的基上绘制结果。

图 10.8 主成分分析（PCA）是一种降维方法，用于识别数据中捕获最大变异的变量组合，然后在主成分空间中绘制数据。此处，点代表在更高维"表达空间"中的实验，每个样本都有自己独特的表达谱（因此有独特的坐标）。PCA 识别数据变异最大的正交轴，并计算作为各基因线性组合的新坐标轴。然后将样本投影到"PC 空间"，通常只绘制前几个主成分。从数学上讲，PCA 将基因×样本矩阵分解为基因×模式矩阵（其列为各主成分）和模式×样本矩阵。在这种情况下，主成分有时被称为"元基因"（metagenes），因为它们是基因的线性组合。

在这一框架下，第一个特征向量解释了数据中最大的变异量；第二个特征向量解释次大的变异量，依此类推。在二维或三维图中，通常会检查样本的分布，按批次、受试者性别或处理组等着色，观察各种系统性因素和生物因素如何影响数据中的变异。

非负矩阵分解

NMF 是另一种降维方法。它将基因表达数据建模为两个非负矩阵的乘积，通过将基因汇总为更少数量的所谓"元基因"（meta-genes）。在 NMF 中，我们从一个 n × m（基因×样本）的表达矩阵 R 开始。我们使用一个 n × k 的特征矩阵 P，它包含每个基因在 k 个聚类中的质心值。用一个 n × k 的权重矩阵 Q 乘以 P，Q 提供了将 R 的列表示为 P 列的非负线性组合的权重。得到的乘积 R̂ 是原始矩阵 R 的近似：

R ≈ P × Q^T = R̂

上述说明中隐藏了一个关键点：NMF 需要事先了解数据中可能存在多少个实验组（k）。

在实践中，往往并不知道数据集中预期有多少个实验组，因此常见的做法是用多个 k 值运行该方法，然后选择最能解释所研究系统生物学的划分方式。在此探索性分析中，一个有用的定量指标是共表型系数（cophenetic coefficient），它衡量的是基因必须有多相似才能被归入同一聚类——本质上是组内距离与组间距离之比。一种广泛使用的方法是绘制共表型系数图，然后寻找其值的急剧下降（表明真正的聚类正在被过度分割），以此来选择最优的 k 值。这种图的示例如图 10.9 所示。

图 10.9 NMF 共表型系数图——见 PDF 第 296/297 页。

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第六步 完

（下一节：第七步：差异表达分析——PDF 第 316 页）

第七步：差异表达分析

虽然探索性数据分析非常有用，但大多数基因表达实验的设计目的，仍然是检验这样一个假设：表型差异是否与功能相关基因的表达差异有关。检验这一假设最直接的方法，是判断是否存在一批基因在不同样本组之间表现出显著不同的表达水平。

在基因表达分析的早期应用中，人们常常先施加一个生物学过滤条件（biological filter），即寻找在不同条件之间平均变化达到 2 倍或以上的基因，这就是所谓的倍数变化过滤（fold-change filter）。这种做法对很多生物学家来说较为直观，但它忽略了基因表达的变化幅度与波动性。因此，差异表达的统计学评估很快就成为判断转录差异的标准方法。

然而，基因表达统计分析面临的最大问题在于：我们通常同时测量的是成千上万个基因，而样本数往往只有几十到几百个。这就带来了多重检验（multiple testing）问题——当测量项目远多于样本数时，即便完全出于随机波动，也很可能会出现一些看似在组间不同的基因。幸运的是，针对这一问题已经发展出了多种校正方法。为了理解如何更可靠地识别显著差异，首先需要了解常用差异检验方法及其背后的基本假设。

Student's t-Test: The Father of Them All

Student's t-test，通常简称 t 检验，是各学科中最常用的两组差异检验方法之一。它本质上可以看作一种信号与噪声的比较：先比较两组样本的平均表达水平，再利用标准差来判断两组均值差异是否足够显著。换句话说，t 检验衡量的是：均值差异相对于数据波动是否足够大，并据此估计观察到的差异由随机因素造成的概率。

根据具体问题不同，t 检验有多种形式：

• 双侧 t 检验（two-sided t-test）：检验某基因在两组之间是否存在高低任一方向的差异；
• 单侧 t 检验（one-sided t-test）：检验某基因在一组中是否显著高于另一组；
• 配对 t 检验（paired t-test）：用于配对样本设计，判断组间表达差异是否超过随机预期。

对于多于两组的比较，t 检验可以推广为 F-test 或 方差分析（analysis of variance, ANOVA）。

在表达分析中，如果实验具有配对设计（例如患者与匹配对照），配对 t 检验尤其常用。传统 t 检验默认数据近似服从正态分布，因此它不能直接修正基因表达研究中常见的均值—方差依赖关系（mean-variance dependency）。一种改进办法是使用经验 t 检验（empirical t-test）：在不同组之间反复置换样本，针对每个基因反复计算 t 统计量，再判断真实数据得到的 t 统计量是否显著高于置换数据的预期水平。

不过，t 检验的所有变体都面临同一个核心困难：多重检验问题。由于被检测的基因数远多于样本数，即便基因在真实生物学上并无差异，也可能仅因偶然而显得显著。因此，人们投入了大量工作来开发更稳健的方法，以识别实验组之间真正存在差异表达的基因。下面概览几类目前仍广泛使用的方法。

Limma

Limma（linear models for microarray and RNA-seq data）最初是为微阵列数据分析开发的，后来也被广泛用于 RNA-seq 数据分析。Limma 的做法是：为每个基因的表达水平拟合一个线性模型，然后使用moderated t-test 来识别显著差异表达基因。

这里的 moderated t-test 建立在一种经验贝叶斯方法（empirical Bayesian method）之上。与标准 t 检验不同，它会根据表达水平对方差进行缩放，并利用合并方差估计（pooled estimate of variance）和自由度（degrees of freedom）来更稳定地估计显著性。因此，即使样本量较小，Limma 也通常能够给出更稳定的统计推断。

此外，Limma 默认倾向于报告假发现率（false discovery rate, FDR）的估计，而不是只给出简单的 p 值。对于高维基因表达数据来说，这一点尤其重要，因为 FDR 比单个检验的 p 值更能反映整体显著结果中的错误发现风险。

Voom

负二项模型（negative binomial model）是处理计数型数据的重要方法之一，但在样本量较大时，直接计算负二项分布的代价可能较高，这会使一些方法（如 DESeq 和 edgeR）在某些场景下显得较为笨重。虽然对 RNA-seq 原始计数做对数转换（log transformation）有助于标准化数据，但这样做往往又会进一步扭曲方差估计。

Voom（variance modeling at the observational level）的核心思想，是为每个基因经验性建模其均值—方差关系：它把每个基因的 counts per million 的对数值（log-cpm）的标准差，建模为平均对数计数的函数。随后，Voom 将这一均值—方差趋势转化为每个观测值的精度权重（precision weight），并把这些权重纳入 Limma 的分析流程中。

这样做的好处在于：RNA-seq 数据仍然可以放进一个经验贝叶斯的线性建模框架中分析，同时又能无缝接入许多既有的 Limma 工作流。因此，Voom 因其兼容性和实用性，已经成为 RNA-seq 差异表达分析中最常用的方法之一。

Negative Binomial Models

DESeq（Anders and Huber 2010; Love et al. 2014）和 edgeR（Robinson et al. 2010）是两种广泛使用的 RNA-seq 差异表达分析方法。它们都直接处理 RNA-seq 的计数数据，而这类数据通常具有过度离散（over-dispersion）的特点，也就是其波动程度高于理想无偏计数数据的预期。

DESeq 与 edgeR 都会把一个基因表达水平的方差拆分为两部分：

• 生物学变异（biological variability）
• 技术变异（technical variability）

生物学变异是不同基因或不同条件之间真实差异的来源；技术变异则来自实验流程中的多个环节，例如样本采集、RNA 提取、文库构建、测序误差及其他实验条件，这些因素都会扭曲真实 RNA 计数。

这两类方法都假定：生物学变异的大小与过度离散程度成正比。因此，DESeq/DESeq2 与 edgeR 一般都假定数据服从负二项分布（negative binomial distribution），而不是泊松分布（Poisson distribution），并进一步拟合广义线性模型（generalized linear model），以估计并修正这种过度离散，从而更稳健地识别差异表达基因。

Fold-Change

如前所述，在 DNA 微阵列全基因组表达分析的早期阶段，倍数变化（fold-change）曾被广泛使用。统计学方法能够较为无偏地评估某个基因差异表达的证据强弱，但它们往往不符合许多生物学家的直觉：即某些基因表达水平仅有非常小的变化时，未必足以解释明显的表型差异。

当然，也有人会指出：对于转录因子（transcription factor）、激酶（kinase）等调控节点分子，即便很小的表达变化，也可能带来显著的下游效应。但对于大多数基因而言，绝对变化幅度很小时，其生物学解释通常并不容易。因此，很多研究会把统计显著性与倍数变化阈值结合起来使用：先找出统计学上显著的基因，再进一步筛选其中倍数变化大于 2 倍（或其他阈值）的基因，用于后续分析。

Correcting for Multiple Testing

如前所述，在任何 RNA-seq 实验中，被检测的基因数通常都非常大，而样本数相对较少，因此单纯由于偶然因素而找到“差异表达基因”的概率会显著升高。举例来说，假设我们分析 25 000 个基因，并按某种“组间差异显著性指标”（例如 t 统计量）对它们排序。每个基因对应一次单独检验，因此总共相当于进行了 25 000 次统计检验。

如果我们仅仅取其中“最显著”的前 5%，那么就相当于挑出了 1250 个基因，但我们并不能有把握地说这些基因中任何一个都是真正差异表达的。因此，差异表达分析必须引入多重检验校正。

Family-Wise Error Rate

家族错误率（family-wise error rate, FWER）用于估计：在进行多次统计检验时，出现一个或多个假阳性（false positives，也称 type I errors）的概率。

如果我们总共进行 c 次检验，并为每次检验设定显著性水平 \(\alpha\)，则有：

FWER ≤ 1 − (1 − α)^c

回到前面的 25 000 个基因示例，若显著性水平设为 0.05，那么几乎必然会至少出现一个假阳性，即：

FWER ≤ 1 − (3.8 × 10^-55)

处理多重检验问题的经典 FWER 方法之一是 Bonferroni 校正（Bonferroni correction）。其思路非常直接：把原本的 p 值阈值除以检验次数，即将 \(\alpha\) 替换为 \(\alpha / c\)。

不过，对于基因表达分析来说，Bonferroni 往往过于严格。例如，当检测 25 000 个基因时，原本的 p < 0.05 会被压缩成 p < 2 × 10^-6。如此苛刻的阈值常常会导致：即便比较的是生物学上差异非常明显的样本，也很难找到哪怕一个满足阈值的基因。虽然也有一些 Bonferroni 的修正版本试图缓和这种过严问题，但实际使用中，更常见的是基于 FDR 的方法。

False Discovery Rate

Benjamini and Hochberg (1995) 提出了假发现率（false discovery rate, FDR）的概念，用于处理多重检验带来的统计问题；这一思想后来又由 Benjamini and Yekutieli (2001) 进一步扩展。与 FWER 试图估计“是否至少会出现一个假阳性”不同，FDR 承认假阳性不可避免，并进一步估计：在一组被判定为显著的结果中，有多大比例可能是假阳性。

换句话说，FDR 本质上是在回答：显著结果中预计有多少比例是错误发现。因此，研究者可以根据研究目的自行设定一个可接受的错误比例阈值。这里讨论的 FDR 专指多重检验中的 FDR-controlling procedure，它与二分类任务中其他语境下的 FDR 含义相似，但并不相同（参见 Box 5.4）。

在最简单的实现中，从任意统计检验的 p 值出发计算 FDR 并不困难。设我们有 N 次检验，并为每次检验都得到了一个 p 值，则可以按如下步骤计算：

1. 将所有 p 值按从小到大排序：p1, p2, …, pk, …, pN。
2. 对于给定的 FDR 水平 q，寻找满足下式的第 k 个 p 值：

pk ≤ (i/N)(q/c(N))，其中

c(N) = Σ(i=1 到 N) (1/i)

然后把排名位于 1 到 k 的那些基因判定为在 FDR = q 水平下显著。

1. 许多计算 FDR 的方法还会为每个基因报告一个 q value，它可以写作：

qi = (piN/i)c(N)

其中 c(N) 的定义同上。

1. 但按此方式直接计算得到的 q 值并不一定是 p 值的单调函数，因此 Benjamini 和 Yekutieli 引入了调整后的 q 值，定义为：

qi = min qk for k ≥ i

理解 FDR 及其正确用法，对于基因表达数据分析极其重要，因为绝大多数差异表达分析方法默认报告的都是 FDR 或 q 值。如果某个方法默认不提供 FDR，研究者也可以使用 R 中 stats 包的 p.adjust 等函数进行计算。

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第七步 完

（下一节：第八步：通过功能富集分析探索机制——PDF 第 320 页）

第八步：通过功能富集分析探索机制

在识别出一组“显著”差异表达基因之后，下一步就是利用这份基因列表来探索研究对象背后的生物学机制。如果你对所研究的系统已经有相当了解，那么直接查看显著基因列表，并挑出一个或几个基因来描述它们可能参与的过程，往往并不困难。然而，这种做法很容易沦为所谓的 "bio-poetry" ——也就是基于零散经验知识拼接出的解释。它虽然听起来合理，却未必能够真正捕捉数据中的整体趋势。

因此，与其逐个讨论单个基因，不如进一步追问：哪些生物学过程在不同状态之间整体上发生了表达模式改变？

幸运的是，我们可以借助多种资源为基因赋予更高层级的功能注释（见第 13 章）。其中最常用的注释体系之一是 GO（Gene Ontology）。GO 是一个建立成熟、人工审查较充分的功能注释系统，它结合生物学文献和其他信息来源，为每个基因在以下三个方面分别赋予分类（见第 7 章）：

1. cellular component (CC)：基因产物所在的细胞区域或细胞外环境；
2. molecular function (MF)：基因产物在分子层面执行的主要功能，例如运输或结合；
3. biological process (BP)：基因产物所参与的整体生物学过程，例如细胞生长、信号传导或能量代谢。

在这三类信息中，GO biological process 往往最具解释力。除了 GO 之外，还有许多 pathway database 和其他 gene set 数据库也可用于类似分类；在分析方法上，它们的核心思想基本一致。我们真正关心的问题是：在区分研究人群的显著基因中，是否有一个或多个生物学过程（或通路）出现了过度代表（over-represented）？

这类方法统称为 gene set enrichment analysis，也常被称作 functional enrichment analysis。目前已有许多不同的分析策略、R packages 和 online tools。最常用的方法大体可分为两类：

• list-based methods：基于预先定义好的差异表达基因列表；
• rank-based methods：不只看显著基因，而是使用按某种显著性指标排序后的完整基因列表，例如 p value 或 q value。

List-Based Methods

当我们得到一组差异表达基因后，一个自然问题是：映射到某个特定功能类别的基因数，是否多于随机情况下的预期？

大多数回答这一问题的方法，都基于 Fisher's exact test。它也常被称为 hypergeometric test，不过这里之所以称为“exact”，是因为它并不依赖对超几何函数的近似。

Fisher's exact test 需要两个集合：

• 一个是被选中的差异表达基因集合；
• 另一个是背景集合（background set）。

对于 microarray，背景集合通常是芯片上所有出现的基因；对于 RNA-seq，背景集合则常常取整个基因组。

该方法的核心是：针对每一个待检验的功能类别（例如每一个 GO BP term），构造一个 contingency table。具体来说，设总共有 n 个基因，其中：

• a：显著且映射到该 BP term 的基因数；
• b：不显著但映射到该 BP term 的基因数；
• c：显著但不映射到该 BP term 的基因数；
• d：既不显著也不映射到该 BP term 的基因数。

此时，就可以用超几何分布来估计观察到这种分布是由随机造成的概率。

直观地说，如果基因组中有 10% 的基因被注释到某个 BP term，那么在显著基因集合中也看到大约 10% 映射到该术语，并不奇怪；但如果显著基因中有 20% 都映射到同一 BP term，那么这就可能具有统计学意义。

这种方法的价值，在于它能帮助我们避免过度解读某些功能类别的出现频率。不过，由于通常会同时检验很多个功能类别，因此这些 p values 仍然必须进行 multiple testing 校正。

基于（修正版）Fisher's exact test 的一个经典 list-based pathway enrichment 工具是 DAVID（Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery；da Huang et al. 2009a,b）。DAVID 的做法是在列联表中把 a 替换为 (a − 1)，从而让检验更保守一些。DAVID 是一个较为友好的 online tool，可以针对给定的输入基因列表和背景基因列表，测试多种 pathway annotation databases，包括 GO terms、Biocarta pathways 以及 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）pathways。它既提供常见 microarray platforms 的背景基因集，也支持 RNA-seq 分析所需的 whole genome 背景集合。

另一类执行相似分析的工具是 R package topGO（Alexa et al. 2006）。除超几何检验外，topGO 还能使用专门设计的算法，显式考虑不同 GO terms 之间的依赖关系。一个典型例子是其中的 elim algorithm：它会把已经注释到某个显著富集节点（即 GO term）的基因，从该节点所有祖先节点中移除。这样做的结果是：分析会减少对笼统、上层细胞功能术语的偏重，而更强调 GO 层级结构中位置更低、功能定义更具体的术语。

Rank-Based Methods

list-based methods 的一个主要问题，是它们对“阈值设在何处”非常敏感。实际分析中常会发现，只要把显著性的 FDR cut-off 稍微调高或调低，结果就可能明显改变，因为在阈值上下附近，也许恰好聚集着一批来自同一功能类别的基因。

rank-based approaches 正是为了解决这一问题。它们不依赖单一显著性阈值，而是先按照某种显著性度量，对实验中所有基因进行排序，例如：

• p value
• q value
• t-statistic
• signal-to-noise metric
• 或其他可反映差异程度的指标

随后，rank-based 方法会检验：某一特定功能类别对应的基因（例如某个 GO BP term 或 KEGG pathway），是否在排序列表的两端出现了过度聚集。

这一思路最早的经典实现是 Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)（Subramanian et al. 2005）。GSEA 既可以作为 online tool 使用，也提供 stand-alone Java program，可被 R 等其他编程语言调用。GSEA 使用 weighted Kolmogorov-Smirnov test 来计算某个 gene signature 的 enrichment score，随后再通过置换（permutations）来判断该富集分数是否显著（见第 13 章）。

另一个相关工具是 R package GSEAlm（Oron et al. 2008）。它通过线性模型先计算 p values，然后检验：映射到某个特定注释类别的基因，其 p value 分布是否不同于背景基因集合的 p value 分布。

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第八步 完

（下一节：第九步：构建分类器——PDF 第 322 页）

Step 9：构建分类器

许多分析的最终目标是识别和探索驱动表型差异的生物学过程。然而，基因表达谱分析还有另一个常见应用，特别是在临床或转化医学场景中——利用数据构建分类模型，将新样本分配到研究中的某一表型组。要构建这样的分类器，首先要选择一组特征（在我们的例子中即基因），以区分不同的生物学类别，然后拟合模型的参数，使分类器能够基于所选特征集的基因表达来准确分类样本。正如本章前述的基因表达分析其他步骤一样，在特征选择、分类器训练与测试方面都有大量可选方案，其中涉及多种可用于分类的统计学和机器学习方法，但该领域尚未就哪种方法最优达成明确共识。也就是说，生物标志物（包括特征集和分类方法）需要使用独立数据集进行仔细验证，这一点是明确的。

成功且可重复的分类器开发的一个关键要素是从良好的实验设计开始。迄今为止已发表了成千上万的基因表达生物标志物，但大多数在首次发表的研究之外再未被使用过。尽管这些问题在前述实验设计讨论中已有部分涉及，但仍有一些额外的标准需要考虑。

首先，所分类的不同组之间应该有良好的平衡。如果研究的是一种罕见疾病，人群中只有 10% 患有该病，那么只需简单地得出"没有人患有该病"的结论，就能构建一个准确率达 90% 的分类器。因此，研究者应认识到这一点，要么尽量平衡各组，要么更明确地阐述成功标准。

其次，需要考虑同时设置训练集和测试集。在标准范式中，先在单个训练集上执行特征选择和参数拟合/算法训练，然后在独立的测试集（即先前未以任何方式用于特征选择或算法训练的样本集）上验证预测模型。

如果研究群体较小（例如处理罕见疾病），交叉验证是一种可接受的方法，但每次"折"的交叉验证都应重新在训练子集上执行特征选择和算法训练，然后重新在独立测试子集上检验方法性能。交叉验证方法面临的挑战在于，其结果不是一个单一的分类器，而是一组分类器，其中任何一个都难以与其他分类器进行直接比较。

开发分类器时还需要注意的另一件事是，训练集和测试集都需要有客观真实值；否则，方法无法得到有效训练，其性能也无法得到客观评估。另一种替代方案是反转测试集和训练集范式——使用多个独立的训练集，在每个训练集上学得一个新的分类器，然后在单个测试集上检验多个分类器之间的一致性和稳定性。在许多方面，这提供了一种更好的分类器成功度量指标，因为它说明了无论算法在何处、以何种方式拟合，对同一患者做出相同分类的可能性有多大。

分类器性能度量

在度量分类器准确率时，两个常用指标是敏感度（sensitivity）和特异度（specificity）（见第 7 章）。假设已开发了一个分类器，要在已知样本类别的独立数据集上对其进行检验。我们可以使用分类方法，对测试数据集中的每个样本做出判定，然后检查效果。假设有病例和对照，并希望对病例进行分类，则将病例视为阳性，对照视为阴性。那么，预测可分为真阳性（TP）和真阴性（TN），表示预测结果与真实分类一致；相应的，假阳性（FP）和假阴性（FN）则表示与真实分类不一致。由此可以定义敏感度，即真阳性率（TPR，有时也称命中率或召回率），为检出的 TP 占实际阳性总数的比例：

TPR = TP / (TP + FN)

进而定义特异度，即真阴性率（TNR），为检出的 TN 占实际阴性总数的比例：

TNR = TN / (TN + FP)

第三个有时有用的指标是精确度，或称阳性预测值（PPV），为检出的 TP 占所有判定为阳性总数的比例：

PPV = TP / (TP + FP)

最后，一个整合了这些概念的有用诊断图是受试者工作特征曲线（ROC 曲线，得名于二战时期的雷达探测研究），它将敏感度对特异度（或 FPR）作图。这一图形表示非常有用，因为大多数分类方法都包含可调节敏感度或特异度的参数，理解两者如何相互影响有助于决定如何调整预测模型。随机分类器的 TPR 和 FPR 相等，在 ROC 曲线上表现为对角线（图 10.10）。

特征选择

如前所述，分类器包含两个组成部分：特征集和分类算法。特征选择的目的是利用训练集中样本组之间的比较，识别一组能够区分这些组、并具有足够判别力来分类新样本的基因。

差异表达检验 或许并不令人意外，特征选择最常用的方法之一是使用第 7 步所述的差异表达分析统计学方法。差异表达分析的统计检验会识别在给定数据集中最能区分实验组的基因。虽然直觉上这很合理，但差异表达分析可能识别出大量高度相关的基因，从而对任何下游分类系统产生偏倚。真正需要的是一组在类间具有最大判别能力的特征，这些特征基于可能需要的多重模式来提供完整的类判别。幸运的是，有多种方法可以用于选择此类特征，包括下面介绍的最小冗余最大相关（mRMR）和预后标志物显著性分析（SAPS）。

特征选择面临的挑战在 Venet 等人（2011）的研究中得到了突出强调，他们将已发表的基因集与随机基因集进行比较，检验其将乳腺癌病例分为具有显著生存差异组的能力。随机基因签名能够胜过"显著"基因集这一发现表明，仅凭统计显著性来选择用于分类的基因集是不够的。

最小冗余最大相关（mRMR） 统计学显著的基因集通常包含大量高度相关的基因，因为这些基因共表达，但都代表相似的生物学过程。如果仅使用最显著的基因构建分类器，就有过度采样大型相关基因集的风险，从而错过可能有助于区分不同表型的生物学过程范围。

考虑这样一种情况：比较不同的类别并按基因的显著性排序，选择最显著的基因，然后将与它高度相关的基因从候选中去除，再选择下一个最显著的基因，继续去除相关基因并重复这一过程。这样得到的一组基因应兼具高预测性和相对独立性。正如你可能已认识到的，衡量相似性的方法有很多，包括使用 Pearson 相关系数和欧氏距离。

一种有助于在衡量相似性时平衡不同生物学过程表示的方法称为最小冗余最大相关（mRMR）（Ding and Peng 2005）。mRMR 使用互信息（一种非线性关联方法）同时识别最能区分类别的基因，并减少基因之间表达谱的潜在重叠。R 中 survcomp 包提供了 mRMRe 的实现（De Jay et al. 2013），mRMRe 包的并行版本可在 mRMRe 包中找到。

预后标志物显著性分析（SAPS） Venet 等人（2011）的研究检验了随机基因集预测生存的能力，其发现对许多基于选定基因集发表的预测方法提出了质疑。造成这一发现的部分原因可能是许多已发表分类器使用了相对大量的基因，以及选定特征集中基因之间（以及与基因组中其他基因之间）的相关性等。SAPS（Beck et al. 2013）是一种启发式方法，可以解决前述问题，适用于确定疾病预后或生存的预测因子，尽管一般流程也可以改编用于其他分类问题。

该方法基于三个独立 p 值——P_pure、P_random 和 P_enrichment——为候选基因集计算 SAPS 分数，每个 p 值通过一系列检验来估算：

1. P_pure 的计算方式是：首先使用 k-means 聚类（k = 2）根据选定基因集将患者分为两组，然后计算 log-rank p 值，以估计两组患者样本在生存方面没有差异的概率。
2. 接下来，选择与候选基因集大小相同的随机基因集，并按本列表步骤 1 所述进行检验，以评估它们将人群分为在生存方面存在差异的两组的效果。P_random 是 log-rank p 值至少与 P_pure 一样显著的随机基因集的比例。
3. P_enrichment 检查候选基因集与随机基因集的相对富集程度，以基于一致性指数确定高度预测性基因的相对富集。基因的一致性指数是指，对于数据集中随机选取的一对患者，表达该基因水平较高的患者的肿瘤比表达水平较低者预后更差（或更好）的概率。P_enrichment 的计算方式是：使用预排序基因集富集分析，确定候选基因集中与随机基因集相比，高或低一致性指数基因的富集程度（见本列表步骤 2 中选择的随机基因集）。富集显著性使用置换分析估算。
4. 最后，将这三个分数与候选基因集和预后之间关联的方向（direction，正向关联为"1"，负向关联为"-1"）结合起来，计算 SAPS 分数：

SAPS score = -log₁₀ max(P_pure, P_random, P_enrichment) × direction

SAPS 分数绝对值越大，三个 p 值共同决定的预后关联就越显著。通过置换基因，可以估算 SAPS 分数的统计显著性：生成 SAPS 分数的零分布，计算零分布中与候选基因集的 SAPS 分数绝对值至少同样大的基因集所占的比例。如果评估了多个候选基因集，则每个基因集的原始 SAPS p 值可用于生成相应的 SAPS q 值，即经多重检验校正后的 SAPS p 值。

mRMR 和 SAPS 等方法的价值在于，它们提供了一种在训练和测试算法之前检验基因集质量的方法。使用最优基因集可以大大增加分类方法表现良好的可能性，尽管对基因集加分类算法的组合进行额外验证仍然必不可少。

分类方法

选定候选基因集后，流程中的下一步是选择、训练和验证一个分类算法，用于将新样本分配到研究中的某一表型亚组。为此目的，存在大量从统计学和机器学习领域借鉴的分类方法，包括最近质心法、压缩最近质心法、高斯亚型分类模型、k 近邻法、支持向量机、随机森林、线性判别分析、二次判别分析、偏最小二乘、逻辑回归、神经网络等（Hastie et al. 2001, 2009; Haibe-Kains et al. 2012）（另见第 18 章）。

虽然每种方法的具体细节可能存在很大差异，但每种分类方法都代表一个数学函数，其参数被"拟合"（统计学中称为"估计"，机器学习中称为"学习"），其输入变量是特定样本的基因表达水平，输出是样本的亚组分配。虽然如果能就最佳分类方法提供指导将非常理想，但对文献的调查将表明，就使用何种最佳方法尚无科学共识（尽管许多论文声称某方法优于其他方法）。然而，有一点是公认的：这些方法的性能应按照下述方式得到严格测试和验证。

训练分类器时需要考虑的一个重要问题是 FP 和 FN 的相对成本。大多数方法优化整体性能，但有时存在对某一类成员的过度或不足识别所带来的真实成本。例如，在临床环境中，识别所有患有某种疾病的患者（提高敏感度）可能要好得多，即使这会冒着有一定水平 FP 识别（降低特异度）的风险。根据具体应用，我们可能认为重要的是最小化 FPR、FN 率、PPV 或其他参数。在大多数情况下，以相同的权重优化 FP 和 TP 以及 FN 和 TN。因此，在拟合模型之前，了解这一假设是否适当，或者是否存在某些识别错误比其他错误成本更高，是有用的。这一决定将有助于指导模型拟合和验证的方法选择。

预测模型的验证

预测分类器只有在准确且可重复的情况下才有用。例如，在乳腺癌中，已发表了成千上万个亚型分类器，但临床中使用的不到 10 个。这些预测模型失败的常见原因之一是其性能往往因方法学错误而被高估，这种现象称为过拟合。导致过拟合的原因有很多，下面将考察三种有助于避免过拟合的策略。

使用独立测试集进行群体水平预测验证 大多数分类器的性能基于其将一组样本划分为由其底层生物学或其他指标（如治疗反应或疾病生存）定义的亚组的能力。如果我们从一个有亚组信息的测试数据集开始，可以执行特征选择，然后训练方法并拟合模型参数。如果将同一分类器应用于该测试数据集，应该得到 100% 的分类准确率，但这不是一个公平的检验。恰当的问题是：该分类器应用于真正独立的测试集时，能否提供足够高的准确率而有实际用途。独立验证需要满足以下条件：

1. 从训练数据集出发，利用已知样本类别执行特征选择并拟合模型参数。
2. 使用一个在先前任何研究中都完全未用过的独立测试数据集，且类别标签保持盲法，然后应用所开发的分类模型将样本分配到各亚组。
3. 解盲样本类别标签，然后比较预测类别与真实类别，计算敏感度和特异度等指标，之后再报告结果。

这是一个相对简单且成熟的协议，但在使用时需要注意一些事项。首先，如果独立数据集是真正独立的，它将提供更可靠的答案。如果使用临床样本，尽量让训练样本和测试样本来自不同医院，由不同人员提取 RNA，在不同设施中测量表达量。如果能够生成与训练集以及彼此之间都独立的多个测试集，就更可能准确地估计性能。

转录组谱分析早期常见的一个错误是，将样本混合以进行特征选择，然后再将混合样本分开用于训练和测试。这种方法的问题在于，某些样本中的偏倚可能在特征选择时被捕获，从而潜在地高估最终的性能估计。需要牢记的重要一点是，训练集和测试集在流程的每一步都必须保持真正独立。

使用交叉验证进行群体水平预测验证 独立训练和测试集范式的一种变体，当可用样本数量有限时经常使用，是交叉验证。n 折交叉验证使用单个数据集，将其分成训练和测试集 n 次，然后对每次 n"折"重复训练和测试过程。没有划分初始数据集的绝对正确方法，也没有执行多少折的正确数量，但鉴于这种方法通常用于相对较小的数据集（如罕见疾病），常见的划分比例是训练集 vs. 测试集 90/10，且至少使用 10 折。该过程与独立验证模型一致：

1. 每折将数据集划分为独立的训练集和测试集。
2. 利用训练集中已知的样本类别，执行特征选择并拟合模型参数。
3. 使用拟合的模型对测试集中的样本进行分类。
4. 计算分类器的性能。
5. 将步骤 1-4 重复 n 折，同时汇总分类器及其方法的总体平均性能。

交叉验证是分类器评估中最常被误用的方法之一。一个常见错误是在特征选择中使用整个数据集，然后使用各折来训练模型并应用。问题在于，某些样本中的偏倚可能在特征选择过程中被捕获，然后膨胀整体方法的性能。因此，在每折中必须保持训练集和测试集独立。此外，应多次运行整个过程，以确保特定的分割不会偏倚结果。

交叉验证的问题是，最终没有单一的分类器可以报告。相反，有 n 个特征集和 n 个分类器，每折一个。有些团队取分类基因集的交集（有时是并集），然后将其报告为生物标志物集。有时，这个共识集被用于在整个数据集上训练算法，但没有坚实的理论支持使用这种方法，而且这个新分类器的整体性能在使用真正独立的测试集之前仍然未知。

使用独立训练集进行个体水平分配稳健性验证 使用训练集和一个或多个独立测试集验证分类器，是理解分类方法在群体水平上表现如何的非常好的方式，敏感度和特异度是群体水平性能的良好指标。然而，如果你是诊所里的患者，负责治疗的医生要用某种检测来确定诊断，那么群体水平的性能对你来说可能远不如该检测能否可靠且一致地将你分配到正确的治疗组重要。

在实践中，这种方法相对简单（Haibe-Kains et al. 2012; Beck et al. 2013）。从一个样本类别已知的多个独立训练集和单个独立测试集出发：

1. 对于每个训练集，识别一个能区分类别的基因集；或者，可以基于某些其他标准（如来自已知通路的代表性基因集或从文献中提取的基因集）从候选基因集出发。
2. 对于每个训练集和适当的基因集，拟合分类模型。
3. 每个分类模型独立用于预测测试集中样本的类别。
4. 不同分类器之间的一致性被用来估计方法的稳健性，衡量使用不同训练集构建的分类器对每个样本给出相同分类的频率。

在许多方面，这种稳健性评估符合我们对好的分类模型应该如何表现的理解。无论模型是在伦敦、巴黎、悉尼、东京还是波士顿学得的，都应该无关紧要。如果基因集和预测模型真正可靠，它们应该给出相同的分类。

在实践中，这种方法可能导致与交叉验证相同的困难——即没有单一的分类器。然而，考虑到一个好的分类器无论使用哪个数据集训练都将是高度一致的，人们希望这些分类器或多或少可以互换。无论如何，这种评估方式应被视为使用独立测试集验证的补充，而不是替代。

单细胞测序

尽管单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）相对较新，但它特别令人兴奋，因为它允许对单个细胞的转录组进行分析。虽然最初的 scRNA-seq 实验分析的是单个或非常少量的细胞，但现在每次实验可以分析数千个细胞。目前使用的已发表方案包括 SMART-Seq（Ramskold et al. 2012）、CEL-Seq（Hashimshony et al. 2012）和 Drop-Seq（Macosko et al. 2015），以及 10x Chromium 系统等成熟的商业产品。

与传统的 DNA 微阵列和 RNA-seq（分析批量组织样本中的基因表达）不同，scRNA-seq 使用条形码从样本中的每个细胞创建测序文库，产生原始样本中单个细胞的表达谱。因此，scRNA-seq 不仅允许在不同表型之间比较表达，还可以定义细胞群，并研究表达变异和细胞异质性与表型的关联。已发表的 scRNA-seq 应用包括细胞类型及其多样性的识别和探索、基因表达随机性分析，以及跨细胞和细胞类型的基因调控网络估计。

scRNA-seq 中使用的处理步骤与 RNA-seq 类似。通常对序列读数执行质量控制，将质量读数比对到适当的参考序列（例如使用 Salmon（Patro et al. 2017）或 Kallisto（Bray et al. 2016）），并进行比对后质量控制。在这个阶段，通常使用 scRNA-seq 特有的方法进行标准化、基于表达识别亚组、差异表达检验和功能分析。这些方法包括用于标准化的 SCONE（Cole et al. 2018）、用于寻找细胞群的 Seurat（Butler et al. 2018）和 GiniClust/GiniClust2（Jiang et al. 2016; Tsoucas and Yuan 2018），以及提供综合分析的基于网络的处理平台如 Falco（Yang et al. 2017）和 ASAP（Chen et al. 2017; Gardeux et al. 2017）。

scRNA-seq 分析路径与批量 RNA-seq 分析分叉的原因是，存在一些 scRNA-seq 特有的技术干扰因素。例如，作为细胞分离和扩增结果产生的批次效应就是一个例子。但更显著的问题是基因"脱落"或稀疏性。据估计，每个细胞在任何给定时间都有多达 300,000 个 RNA 转录本。然而，在 scRNA-seq 中，每个细胞通常只记录几千（或数万）个读数。脱落发生是由于与 mRNA 计数实验相关的统计特性——我们偶然错过了一些转录本。虽然高表达转录本通常在 scRNA-seq 数据中表现良好，但中低表达转录本可能会被遗漏。"脱落"基因的整体模式产生了一个稀疏的细胞×转录本表达矩阵——观察到的计数值远少于预期。幸运的是，微生物组文献中已探讨了这个问题，scRNA-seq 使用的许多方法可以追溯到微生物组分析。

然而，这些问题意味着，截至本文写作时，在 scRNA-seq 分析的许多方面尚无共识。例如，在标准化方面，全局和缩放方法都被频繁使用，TPM 和 CPM 是常用指标。在比较表达方面，正在开发考虑细胞群产生的基因表达多模态性的方法。然而，许多已发表的研究仍然依赖 t 检验等成熟方法进行表型比较。

scRNA-seq 文献中现在广泛使用的一种新型可视化是 t 分布随机邻域嵌入（t-SNE）图（van der Maaten and Hinton 2008）。类似于 PCA 等方法，t-SNE 降维高维数据，但通过求解一个力图保持相似基因或细胞之间距离的目标函数来实现。虽然 t-SNE 已被证明非常有用，但它需要大量内存和计算资源，运行时间与分析的细胞或基因数量的平方成正比。

第10章 表达分析

10.12 Summary、Internet Resources、Further Reading 与 References

范围：PDF page 329 - PDF page 334；合并 Summary、Internet Resources、Further Reading、References。

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Summary

本章为基因表达数据分析提供了一张路线图；而且由于这一领域变化极快，这张路线图天然不可能穷尽所有内容。自 20 世纪 90 年代早期通过 expressed sequence tags 测序开展首次全基因组范围表达分析以来，技术平台的变化、分析方法的进步，以及大量辅助数据的爆发式增长——例如众多物种的基因组序列及其基因注释——共同重塑了这一研究领域。

具体选择哪一种软件工具或分析方法，当然始终可以讨论；今天看来最优的方案，明天也可能被更新的方法取代。但良好的实验设计原则与扎实、可靠的分析实践并不会因此改变。

因此，与其把本章当成一本按步骤照做的 cookbook，不如把它理解为一张 roadmap：它为研究者指明一条更有可能获得成功、也更能增强结果可信度的分析路径。本着这样的初衷，我们希望本章概述的方法，能够成为你进入表达分析领域的一份有用导论与实践指南。

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Internet Resources

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Further Reading

以下保留原书题录英文原文；仅将题录后的说明性文字译为中文：

Brazma, A., Hingamp, P., Quackenbush, J. et al. (2001). Minimum information about a microarray experiment (MIAME) – toward standards for microarray data. Nat. Genet. 29 (4): 365–371. https://doi.org/10.1038/ng1201-365.

这篇奠基性论文确立了公开共享、且具充分注释的基因组数据集的基本原则，直到今天仍然经得起检验。MIAME 标准中提出的报告要求，在设计和撰写所有大规模实验时都应被认真考虑。

Conesa, A., Madrigal, P., Tarazona, S. et al. (2016). A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17:13. https://doi.org/10.1186/s13059-016-0881-8.

Conesa, A., Madrigal, P. et al. (2016). Erratum to: A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17 (1): 181. https://doi.org/10.1186/s13059-016-1047-4.

这篇论文（以及其勘误）很好地综述了 RNA-seq 数据分析方法，并给出了关于 best practices 的指导。尽管该领域仍在快速演进，但所谓“最佳实践”在很大程度上，仍然是建立在 DNA microarray 分析阶段积累下来的那些硬经验之上。

Ching, T., Huang, S., and Garmire, L.X. (2014). Power analysis and sample size estimation for RNA-seq differential expression. RNA 20 (11): 1684–1696. https://doi.org/10.1261/rna.046011.114.

对基因表达分析进行 power calculation 一向非常困难，主要原因在于不同基因之间的表达水平与方差差异都很大。这篇论文为如何估计统计功效，以及 RNA-seq 研究所需的样本量，提供了有价值的方法学指导。

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这篇论文描述了一条简洁的数据质量控制与标准化流程，可用于检查（部分）样本注释信息，并对来自 heterogeneous samples 的数据进行标准化处理。

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基因调控网络推断的方法有很多。作者团队开发这一方法，是基于这样两点认识：其一，transcription factors 会调控基因表达；其二，不同 phenotypes 之间的网络结构本身也会发生变化。

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尽管 gene set enrichment 方法仍在不断演化，这篇综述仍然较好地比较了多种方法，指出了各自的 strengths 和 weaknesses，并对 best practices 提供了富有启发性的建议。

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以下参考文献题录按原书英文原文保留：

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Ch11 Proteomics and Protein Identification by Mass Spectrometry / Introduction

Introduction

什么是蛋白质组？

蛋白质组（proteome）是指一个生物实体（细胞、组织、器官或生物体）在其生命周期中某一时间点所表达的全部蛋白质集合。这个词由 protein（蛋白质）和 genome（基因组）组合而成，最早由 Marc Wilkins 于 1995 年提出，用于指代利用质谱（mass spectrometry, MS）对蛋白质进行功能研究（Wilkins et al. 1996）。蛋白质组学（proteomics）是对蛋白质进行大规模研究的学科，采用系统性、shotgun 或靶向的高通量方法，以阐明蛋白质的身份、定位、丰度、结构、功能或表达谱。

蛋白质组学与其他“组学”（omics）研究相互补充，例如基因组学（genomics）和转录组学（transcriptomics）。它能够进一步明确由基因编码的蛋白质身份，并确定这些蛋白质在细胞中的基本作用。一个生物体的基因组相对静态，而蛋白质组则高度动态：不同细胞之间的蛋白质组不同，并且会响应不同环境刺激而发生变化。这些变化体现在所表达蛋白质异构体的丰度、翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs）、稳定性以及物理相互作用关系等方面。正是这种动态且不断变化的特征，使蛋白质组显著比基因组更加复杂。

例如，人类基因组包含约 20 000 个蛋白质编码开放阅读框（open reading frames）（Gaudet et al. 2017）。另一方面，突变、选择性转录和选择性剪接异构体以及其他机制，可以使单个基因产生多种不同的信使 RNA（messenger RNA, mRNA）转录本（Figure 11.1）。此外，翻译过程中或翻译后发生的位点特异性化学修饰或酶促修饰，还可以产生多种不同的蛋白质形式（proteoforms，即不同形式的蛋白质）。这些蛋白质形式会随时间、亚细胞定位以及生理或疾病状态而变化。这表明，人类蛋白质组实际上可能由数百万种化学上彼此不同的实体组成。

为什么研究蛋白质组？

过去十年中，DNA 测序技术取得了重大进展，使得 8000 多种生物的完整基因组得以确定，并且大约另有 37 000 个物种具备部分草图基因组（draft genomes）（Mukherjee et al. 2017）。由此产生的一个直接结果是，推定蛋白质序列或“虚拟蛋白质组”（virtual proteomes）的数量呈指数级增长。这进一步带来了一个关键需求：确定这些蛋白质在物理、结构和功能层面所发挥的作用。

鉴于蛋白质组具有复杂而动态的性质，研究表达蛋白质时，不仅需要识别该蛋白质来源于哪个对应基因，还需要确定在特定生物学情境下，相应蛋白质以何种形式存在，并与哪些分子或结构发生关联。这通常称为蛋白质表征（protein characterization）。

20 世纪 90 年代，生物质谱（biological MS）作为一种灵活、灵敏且快速的方法出现，能够在复杂生物混合物中识别并定量蛋白质。这一技术进展推动了蛋白质组学时代的到来。

Ch11 Proteomics and Protein Identification by Mass Spectrometry / Mass Spectrometry

Mass Spectrometry

质谱（mass spectrometry，MS）是一种用途广泛的分析技术，能够精确测量样品中化合物的分子质量。分子质量（molecular mass，或 molecular weight，分子量）是所有元素、化学物质和分子的基本性质。如果能够非常准确地测定分子质量，就可以确定某一化合物的分子式，甚至推断其结构。MS 的基本原理是：从样本中的有机或无机化合物产生带电的气相离子，随后根据这些离子的质荷比（mass-to-charge ratio，m/z）和强度（intensity，即丰度 abundance）对其进行分离和检测。质谱仪通常由样品离子化装置（sample ionizer）、质量分析器（mass analyzer）和检测器（detector）组成。离子化装置从待测样本中形成气态离子，例如可通过激光轰击样本实现。离子的质量由质量分析器测定；质量分析器根据离子的 m/z 比值对其进行分离，并将不同离子导向检测器，在检测器中以电子方式感应这些离子；相应信号随后被转换为数字输出，即质谱图（mass spectrum）。

Ionization

自 20 世纪 50 年代以来，MS 一直是挥发性有机化合物分析的标准工具；而其在蛋白质组学领域的应用，则随着 20 世纪 80 年代 ESI（Fenn et al. 1989）和 MALDI（Karas and Hillenkamp 1988）等软电离（soft ionization）技术的发展而迅速兴起。在 ESI 中，液体样品通过针状毛细管喷入离子源。在样品流出口与质量分析器入口之间施加高电压（可采用正离子模式或负离子模式）。液体持续吸收电荷，变得不稳定，并以微小的高电荷液滴形式释放出来。喷雾中的溶剂蒸发会产生带电的分析物离子；这一过程可通过让喷雾通过干燥气流（例如氮气）来促进。

相反，MALDI 在真空中使用紫外激光束轰击位于靶板上的化学基质中包埋的样品分子，使其解吸并离子化。基质通常由高度共轭的有机酸构成，例如常用的 2,5-dihdroxybenzoic acid（DHB）。基质以热的形式吸收能量后升华成气态云，从而引发解吸，同时使分析物保持完整。气态云中分子之间的碰撞使能量从基质转移至分析物。随后，受激基质与分析物之间发生质子转移，引起去溶剂化（de-solvation），形成质子化或去质子化离子。上述温和而有效的 ESI 和 MALDI 方法，使蛋白质或肽分子在离子化过程中能够保持相对完整，显著提高了可检测质量范围的动态上限，从 <1000 Da 提高到 >500 000 Da。因此，MS 对多肽的检测效率大幅提升，也使生物样品中蛋白质组分的常规分析成为可能。

Mass Analyzers

由上述任一离子化方法产生的离子，都可以通过质量分析器进行分选和测量。常规蛋白质分析中使用的质量分析器有多种类型。它们在以下方面各不相同：分离或碎裂离子的基本方式；测定离子质量的准确度（mass precision，质量精度）；区分具有相同名义质量或单位质量组分的能力（resolution，分辨率）；以及质量分析器可测量的 m/z 比值范围（dynamic mass range capability，动态质量范围能力）。四极杆（quadrupole）、飞行时间（time of flight，TOF）、傅里叶变换离子回旋共振（Fourier transform ion cyclotron resonance，FT-ICR）、离子阱（ion trap）和 Orbitrap 都代表了质量分析器的主要类别，尽管每一类内部还存在许多变体。

四极杆质量分析器是一种低分辨率分析器，由四根带电杆以网格方式排列组成，并利用交变的四极电场快速分离并选择（传输）目标离子（Figure 11.2）。通过控制施加电压，可以定性选择具有特定 m/z 比值的离子，并将其转移至检测器。

Figure 11.2 Quadrupole mass analyzer. 四极杆质量分析器示意图。四极杆质量分析器由四根平行圆柱杆组成，每一对相对的杆彼此电连接，并在两对杆之间施加带有直流偏置的射频电压。离子沿四极杆之间的通道运动；在给定电压偏置下，只有在振荡电场中具有稳定轨迹的特定 m/z 比值分子（resonant ions，共振离子）能够到达检测器，从而实现对样品离子的过滤。轨迹不稳定的离子（non-resonant ions，非共振离子）会撞击杆体并丢失。

在 TOF 质量分析器中，离子由已知强度的电场加速。由于离子的初始速度取决于其 m/z 比值，它们会在不同时间到达检测器，其中质量较轻和/或带电荷较多的离子先到达。因此，可以根据离子到达分析器的“飞行时间”（TOF）对其进行区分（Figure 11.3）。

离子阱分析器利用磁场和电场的组合，在隔离环境中捕获离子。离子可通过 Penning trap（FT-ICR）、Paul ion trap（quadrupole ion trap）、Kingdon trap 以及 Orbitrap 捕获；其中 Orbitrap 是对 Kingdon trap 的一种显著改进实现。上述不同质量分析器的多种组合目前已被广泛使用。

Figure 11.3 Time of flight (TOF) mass analyzer. 飞行时间（TOF）质量分析器示意图。在 TOF 质量分析器中，质荷比由离子到达检测器所需的时间确定。离子通过施加已知电压的电场而被加速，并通过飞行时间管。每个离子的速度取决于其质荷比，因此 m/z 较低的离子会先于 m/z 较高的离子到达检测器。

三重四极杆质量分析器（triple quadrupole mass analyzer）是四极杆分析器的一种变体，它使用三个四极杆的线性串联结构（本质上相当于两个质谱仪通过中央四极杆连接在一起），以提高灵敏度和分辨率。中央四极杆可用于碎裂离子，从而实现一种非常有用的技术，称为串联质谱（tandem MS），通常称为 MS/MS 或 MS2。在该技术中，通过第一分析器后检测到的选定目标离子，会在第二单元中发生碎裂，然后在第三单元中被检测（Box 11.1）。因此，在某些配置下，质谱仪可以碎裂选定的离子种类，以推断其相应的分子结构（例如多肽序列），或获得更深层次的结构信息（例如蛋白质 PTM 或折叠状态）。

Box 11.1 Tandem Mass Spectrometry（Figure 11.4）

• 串联质谱（tandem mass spectrometry，MS）是一种包含多轮分析的 MS 技术。通常，在离子源中形成的离子会在第一轮质量分析（MS1）中按照其 m/z 比值分离。随后，离子根据其 m/z 比值（precursor ions，前体离子）和相对强度被依次选择，并通过分子活化增加其内能，使其发生碎裂。所得产物离子（product ions）再在第二阶段质量分析（MS2）中被分离和检测。碎裂来源于第一轮分析中形成的分子离子的解离，是串联 MS 的关键组成部分。用于碎裂离子的活化方法可以是碰撞型、基于电子的，或涉及光活化。常见的离子活化/碎裂方法包括 collision-induced dissociation（CID；Jennings 1968）、electron capture dissociation（ECD；Zubarev et al. 1998）、electron transfer dissociation（ETD；Syka et al. 2004）、higher energy collisional activation dissociation（HCD；Olsen et al. 2007）和 infrared multi-photon dissociation（IRMPD；Little et al. 1994）。

• 碰撞碎裂（collisional fragmentation）。CID 又称 collisional-activated dissociation（CAD），是一种常用的气相离子碎裂技术。CID 涉及目标离子与非反应性气体原子（通常为氦、氮或氩）之间的高能碰撞。在碰撞过程中，分子离子的动能被转化为内能；内能积累会导致键断裂，使前体离子解离为较小片段，随后由 MS2 检测。HCD 是 Orbitrap 特有的一种 CID 技术，其碎裂发生在离子阱外部。大多数碰撞方法具有较高效率，因此几乎在所有 MS2 蛋白质组学研究中都是首选方法。

• 光活化碎裂（photo-activated fragmentation）。IRMPD 是一种利用红外激光束增加被捕获离子内能的方法。激光束中的光子被被捕获离子吸收，产生振动激发态，进而通过键解离释放能量，这一过程与 CID 非常相似。通过碰撞碎裂或光活化碎裂通常产生的离子，是由较弱酰胺键解离形成的 b 离子和 y 离子。这些技术在肽、脂质和小分子分析方面相当高效，但可能去除 PTM。

• 基于电子的碎裂（electron-based fragmentation）。在 ECD 中，目标肽离子受到低能电子（约 0.2 eV）照射，捕获一个电子后形成不稳定的电荷降低物种，该物种随后解离，产生可提供肽序列信息的碎片离子。ETD 与 ECD 类似，但其解离由带相反电荷的离子之间的电子转移诱导。无论是 ECD 还是 ETD，碎裂都发生于 N–Cα 键断裂，从而产生互补的 c 离子和 z 离子。ECD 和 ETD 现已广泛用于全长蛋白质研究，即所谓“自上而下”（top-down）测序，以及带有不稳定 PTM（如磷酸化）的肽段研究。

（续）

Box 11.1（Continued）

使用振动激发的 MS/MS 方法（例如用于肽碎裂的 CID）的一个缺点是，它们可能导致肽主链或侧链中某些较弱键的偏向性断裂。这些较弱键包括 PTM，例如磷酸侧基可能成为优先断裂位点，导致 PTM 位点丢失，并产生复杂度降低、难以在序列层面解释的谱图。这又会导致漏鉴定、错误鉴定或错误的位点归属。相比之下，ETD 是一种更温和的碎裂方法，它利用低能电子转移，并通过一种更全面的非遍历（non-ergodic）过程保留 PTM 的修饰位点，因此成为 PTM 碎裂分析的优选方法。

与四极杆或三重四极杆分析器相比，TOF 质量分析器在分析多肽离子及其片段时提供更高的质量分辨率；而 FT-ICR 和 Orbitrap 质量分析器在所有分析器中提供最高的质量分辨率，但动态范围较为有限。

Figure 11.4 (a) Tandem mass spectrometry (MS). 串联质谱（MS）。用于串联 MS 肽测序的三重四极杆质谱仪示意图。(b) 液相色谱-串联质谱分析的第一阶段以 MS1 前体离子扫描（quadrupole 1）进行。在第二阶段，仪器以 MS2 模式运行，其中选定的前体离子（定义为 m/z）被传递至碰撞室（quadrupole 2）进行碎裂（例如通过与惰性气体相互作用）。所得肽离子片段随后在 quadrupole 3 中根据其表观 m/z 比值被分辨。

Ion Detectors

经过质量分析器后，分离出的（肽）离子撞击检测器（或离子收集系统），随后根据其 m/z 比值和相对强度（与丰度相关）进行鉴定。检测器能够放大信号，其中一些检测器灵敏度足够高，甚至可能检测到单个分子。质谱仪可使用多种类型的检测器。最常规使用的是电子倍增器（electron multiplier），其工作原理是检测带电离子撞击涂层检测器表面时产生的二次电子发射。在串联质谱仪中，离子收集系统还能够计算每一特定质量处所得离子片段的相对丰度。质谱仪连接到基于计算机的软件平台，以数字格式记录这些质谱图。随后的数据分析通过将 m/z 比值和相对丰度与已知分子数值数据库进行比较，从而鉴定相应的分子物种。

目前使用的质谱仪由上述离子化方法、质量分析器和离子检测器的任意组合构成，并且都将输出记录为一组连续直方图，表示离子化分子撞击离子检测器的信号，这被称为质谱图（mass spectrum）（Box 11.2）。

Box 11.2 The Mass Spectrum（Figure 11.5）

质谱图表示为二维条形图：Y 轴为信号强度，X 轴为 m/z 比值，其中包含许多信号强度峰，对应于被检测离子的 m/z 比值和强度。这里，m 表示离子的质量，z 表示离子携带的电荷。被移除电子的数量即电荷数（对正离子而言）；+1、+2、+3 分别表示带有一个、两个和三个电荷的离子。对于电荷为 1 的离子，m/z 比值就直接表示离子的质量。峰的位置，或通常所称的特定信号，对应于由肽产生的离子的各种 m/z 比值，并可作为生物样本中肽和蛋白质的富含信息的分子指纹。

Tandem Mass Spectrometry for Peptide Identification

与液相色谱结合时，串联 MS（LC-MS/MS）涉及在质量分析器中进行多轮连续的离子选择和碎裂（Box 11.1）。通过不同离子活化方法引发离子碎裂，可为所研究分子的分子结构（例如肽序列）提供关键信息，是串联 MS 的必要组成部分。这些离子活化方法通常应用于不同质量分析阶段之间，可以单独使用，也可以联合使用；它们会产生丰富的碎片模式，从而提供关于分子组成的精确信息。MS2 数据生成的速度和特异性决定了 LC-MS/MS 分析复杂生物样品的效率，例如多肽混合物的测序深度。

每一条记录到的 MS2 谱图，都是某一特定肽段在其通常具有特异性的主链酰胺键和/或侧链键断裂后所产生的、通常独特的碎裂模式的结果。与 MS 中的一贯原则相同，肽片段只有在携带电荷时才能被离子检测器检测到。如果电荷保留在片段的 N 端，该离子会根据断裂发生的位置被归类为 “a”、“b” 或 “c” 离子。如果电荷保留在片段的 C 端，则归类为 “x”、“y” 或 “z” 离子（Figure 11.6），并以下标表示片段中的位置或残基数。MS2 的特异性和低化学噪声使肽检测具有较高的选择性和灵敏度，从而能够对复杂样品进行定性和定量分析。

Ch11 Proteomics and Protein Identification by Mass Spectrometry / Tandem Mass Spectrometry for Peptide Identification

肽段鉴定中的串联质谱

离子检测器

通过分析器后，分离出的（肽段）离子会撞击检测器（或离子收集系统），随后根据其 m/z 比值和相对强度进行识别；相对强度与丰度相关。检测器能够进行信号放大，其中一些检测器灵敏度足够高，理论上可以检测到单个分子。质谱仪可配备多种类型的检测器。最常用的检测器是电子倍增器（electron multiplier），其工作原理是检测带电离子撞击涂层检测器表面时产生的二次电子发射。

在串联质谱仪中，离子收集系统还能够计算每一特定质量处所产生离子碎片的相对丰度。质谱仪与基于计算机的软件平台相连，这些平台以数字格式记录质谱图。随后通过数据分析，将检测到的 m/z 比值和相对丰度与已知分子数据库中的数值进行比较，从而鉴定相应的分子种类。

目前使用的质谱仪由上述离子化方法、质量分析器和离子检测器的任意组合构成。它们均将输出记录为一组连续的直方图，用来表示离子化分子撞击离子检测器的信号；这种输出称为质谱图（mass spectrum）（Box 11.2）。

Box 11.2 质谱图（Figure 11.5）

质谱图通常表示为二维柱状图：纵轴为信号强度，横轴为 m/z 比值，其中包含许多信号强度峰，这些峰对应于被检测离子的 m/z 比值和强度。这里，m 表示离子的质量，z 表示离子所携带的电荷。被移除的电子数称为电荷数（对于正离子而言）；+1、+2、+3 分别表示带有一个、两个和三个电荷的离子。对于电荷数为 1 的离子，m/z 比值就直接代表该离子的质量。

一个峰的位置，或者通常所称的明确的信号，对应于由肽段产生的各种离子的 m/z 比值，并作为一种信息丰富的分子指纹，用于表征生物样本中存在的肽段和蛋白质。

肽段鉴定中的串联质谱

与液相色谱结合使用时，串联质谱（tandem MS, LC-MS/MS）是在质量分析器中进行多轮连续的离子选择和碎裂（Box 11.1）。通过各种离子活化方法使离子碎裂，可以为所研究分子的分子结构提供关键信息，例如肽段序列；这一过程是串联质谱的必要组成部分。这些离子活化方法通常应用于不同质量分析阶段之间，可以单独使用，也可以组合使用，并产生丰富的碎片模式，从而为分子的组成提供精确信息。MS2 数据生成的速度和特异性决定了 LC-MS/MS 分析复杂生物样品的效率，例如多肽混合物的测序深度。

每一张记录下来的 MS2 谱图，都是某一特定肽段在其通常具有独特性的主链酰胺键和/或侧链键断裂后产生的碎裂模式的结果。与质谱中的一般情况相同，肽段碎片只有在携带电荷时才能被离子检测器检测到。如果电荷保留在碎片的 N 端，该离子会根据断裂发生的位置被归类为 “a”、“b” 或 “c” 离子。如果电荷保留在碎片的 C 端，则被归类为 “x”、“y” 或 “z” 离子（Figure 11.6），并以下标表示碎片中的位置或残基数。

MS2 的特异性和低化学噪声使其具有很高的肽段检测选择性和灵敏度，因此能够对复杂蛋白质混合物进行定性和定量分析。与高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）或超高压液相色谱（ultra-high-pressure liquid chromatography, UHPLC）肽段分离技术结合后，现代 MS2 工作流程可以在单次实验中以“shotgun”方式测序数千种不同的多肽。

Figure 11.5 碎裂串联质谱（MS/MS，或 MS2）谱图

质谱图是一个简单的二维图，展示实验测定得到的离子质荷比与强度之间的关系。在本例中，它表示由肽段碎裂产生的产物离子的分布或模式。图中突出显示的基峰（base peak，即最强峰）位于 448.99 m/z，对应于丰度最高的离子；通常将其相对丰度设定为 100%。其他峰则表示具有特定质量的碎片离子。纵轴显示相对丰度或强度，其中所显示的数值代表离子检测系统记录到的离子数量；也就是说，离子丰度越高，峰越高。M+ 是母体分子离子（parent molecular ion），即未碎裂的肽段离子失去一个电子后的形式。

MS2 中连续的质量分析阶段可以通过两种方式实现：空间串联（tandem-in-space）或时间串联（tandem-in-time）。空间串联是指一种 MS2 仪器配置，其中两个独立的质量分析器按顺序耦合在一起：首先在第一个质量分析器中通过离子选择完成 m/z 分离，随后在中间区域（例如碰撞室或离子阱）中发生解离；之后，离子被传输到第二个分析器中进行产物离子的质量分析。

第二种方式是时间串联，即使用单一质量分析器，在同一个装置中按时间顺序依次完成离子选择、活化和产物离子分析的所有步骤。空间串联仪器的例子包括四极杆（quadrupole）与 TOF 质量分析器的组合；而离子阱质量分析器则可以进行时间串联分析。原则上，这两类仪器都可以扩展为多级 MS，以提供更详细的结构信息；这通常称为 MSn，其中 n 表示碎片分析的阶段数。

Ch11 Proteomics and Protein Identification by Mass Spectrometry / Sample Preparation

Sample Preparation（样品制备）

细胞、组织或生物流体（如血浆）中蛋白质浓度具有高度复杂性、多样性和极宽的动态范围，这使得蛋白质的全面鉴定和定量具有挑战性，尤其是低丰度蛋白和膜相关组分。为了获得更好的离子化效率和鉴定率，通常使用具有序列特异性的酶（如 trypsin，胰蛋白酶）通过酶切消化将多肽切割为较小的肽段。Trypsin 具有极高的切割特异性，可通过水解 lysine（K）或 arginine（R）残基羧基端一侧的肽键来切割蛋白质，但当其后接 proline（P）时例外；这一过程通常产生长度为 6–20 个或更多氨基酸的肽段，非常适合通过 LC-MS/MS 进行检测和测序。蛋白水解切割可显著提高检测灵敏度，从而改善蛋白质组覆盖度。由于 trypsin 在多种条件下具有较高的蛋白水解活性和稳定性，它已成为基于 MS 的蛋白质组学中首选的蛋白酶；不过，其他酶也可提供互补的序列覆盖。

![Figure 11.6 多肽骨架切割产生不同的产物离子类型。]

Figure 11.6 多肽骨架切割产生不同的产物离子类型。

（a）示意图显示了多肽骨架发生碎裂的典型位点，并采用标准 Roepstorff–Fohlmann–Biemann 命名法进行标注（Roepstorff and Fohlman 1984）。肽段碎裂是键活化和断裂的结果——例如，由于与惰性气体碰撞（CID）而产生 b 离子和 y 离子，或由于电子转移（ETD）而产生 c 离子和 z 离子。离子从氨基端开始标记为 a1、b1 和 c1，其中下标表示该离子所包含的氨基酸侧链数量。

（b）当电荷保留在氨基端片段上时，会产生 a、b 或 c 片段离子；而当电荷保留在羧基端片段上时，会产生 x、y 和 z 片段离子。

在复杂肽段混合物能够通过 MS 分析之前，通常需要先通过生化分离进行处理和简化，例如使用反相 LC，或采用亲和捕获富集目标肽段。PTMs（post-translational modifications，翻译后修饰）尤其受到关注，因为它们是调节蛋白质合成后活性或相互作用的重要且常见的调控机制。这些调控可以通过酶介导添加一个或多个共价功能性化学基团（如 phosphorylation，磷酸化），也可以通过活细胞内的蛋白水解切割实现（Box 11.3）。基于 MS 的 PTM 检测在生物学上具有很高的信息价值，因为 PTM 几乎影响正常细胞生物学和稳态的所有方面，从蛋白质功能到物理结合事件（如 protein–protein interactions，蛋白质–蛋白质相互作用）均包括在内。然而，由于 PTM 通常是瞬时的且低于化学计量水平（sub-stoichiometric，即在任一时刻并非给定蛋白质的所有分子都发生该修饰），因此检测起来可能较为困难。为了提高可检测性，研究者开发了针对特定修饰的生化富集技术，如亲和捕获，用于在消化前或消化后分离经 PTM 修饰的蛋白质，以帮助检测和表征修饰肽段。例如，对 serine 和 threonine 磷酸化进行选择性亲和捕获和分析，通常可通过 immobilized metal ion affinity chromatography（IMAC，固定化金属离子亲和色谱）实现，例如使用 titanium dioxide（TiO2）beads。不同的色谱分离方法可以单独使用，也可以组合使用，其目的都是生成更简化的分子（肽段）混合物，使其能够以更高效率注入并离子化进入质谱仪。除促进 PTM 检测外，样品制备过程中通过预分级和靶向富集实现的样品简化，也在从日益多样化的生物样品中获得较高蛋白质序列覆盖度和总体鉴定率方面发挥重要作用。

Box 11.3 Post-Translational Modification（Figure 11.7）

蛋白质翻译后修饰（protein post-translational modifications, PTMs）是细胞响应环境刺激的主要机制之一。它们在控制细胞过程方面发挥关键作用，包括调控细胞分化、降解、基因表达以及蛋白质–蛋白质相互作用的信号转导通路。PTMs，如 phosphorylation（磷酸化）、glycosylation（糖基化）、ubiquitination（泛素化）、nitrosylation（亚硝基化）、methylation（甲基化）、acetylation（乙酰化）、sumoylation（SUMO 化）和 proteolytic processing（蛋白水解加工），通常会影响正常细胞生物学和稳态的几乎所有方面。由于 PTMs 往往具有动态性、低于化学计量水平（不完全）和瞬时性（可逆），它们使蛋白质组的功能和结构多样性呈指数级增加。鉴定这些修饰并理解其作用，对于研究细胞生物学、疾病发病机制以及开发新治疗方法至关重要。

Phosphorylation 是最常见且研究最深入的 PTM；目前已有超过 58,000 个具有实验证据支持的修饰位点，因此“phosphoproteomics”（磷酸化蛋白质组学）成为功能蛋白质组学的一个重要分支。Phosphorylation 是一种关键的可逆修饰，通过在蛋白质的 serine、threonine 或 tyrosine 残基（在原核生物中也包括 histidine）上添加 phosphate group（磷酸基团）而发生，并在维持细胞内众多细胞过程和信号通路的完整性方面发挥关键作用。例如，与质膜受体相关的 protein kinases（蛋白激酶）是一类酶，能够催化关键胞内信号蛋白 tyrosine 残基的磷酸化，而这些蛋白在信号转导过程中具有重要作用。破坏 tyrosine kinases 功能的基因组异常可导致细胞转化和癌症，tyrosine kinase protein ABL 即为一例。导致形成 BCR–ABL1 fusion protein 的 ABL 突变，会驱动 chronic myelogenous leukemia（CML，慢性粒细胞白血病）的发病机制；CML 是一种可治愈的骨髓癌症，可被抑制性药物有效靶向治疗。

Ch11 Proteomics and Protein Identification by Mass Spectrometry / Bioinformatics Analysis for MS-based Proteomics

Bioinformatics Analysis for MS-based Proteomics

Figure 11.7 翻译

Figure 11.7 翻译后图中文字

• Target protein：靶蛋白
• mRNA：mRNA
• Ribosome：核糖体
• Protein：蛋白质
• NH3：NH3

• Nitrosylation：亚硝基化

将 NO 共价连接到蛋白质的半胱氨酸残基上。

• Phosphorylation：磷酸化

在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上添加一个磷酸基团。

• Acetylation：乙酰化

在蛋白质的 N 端或赖氨酸残基处添加一个乙酰基。

• Methylation：甲基化

添加一个甲基，通常发生在赖氨酸或精氨酸残基处。

• ADP-ribosylation：ADP-核糖基化

向蛋白质添加一个或多个 ADP-核糖基团。

• Glycosylation：糖基化

将糖连接到氨基酸侧链中的 N 或 O 上。

• Prenylation：异戊二烯化

向 C 端半胱氨酸残基添加一个疏水分子。

• Proteolysis：蛋白水解

蛋白质在蛋白酶作用下于其肽键处发生切割。

• Neddylation：NEDD8 化

通过 C 端甘氨酸与赖氨酸残基之间的异肽键，将 NEDD8 添加到蛋白质上。

• Ubiquitylation：泛素化

在蛋白质的赖氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸残基处，或在 N 端氨基处添加 ubiquitin。

• Sumoylation：SUMO 化

将小蛋白 SUMO（small ubiquitin-like modifier，小泛素样修饰物）添加到靶蛋白上。

Figure 11.7 翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs）发生在蛋白质中不同的氨基酸残基上。虽然目前 UniProt 数据库中列出了超过 50 种 PTM，本图列出的是其中一些研究较为充分的 PTM。

基于 MS 的蛋白质组学的生物信息学分析

MS 实验产生的数据量非常大，几乎每一张谱图都包含数以万计的数据点。由于测量误差、缺失值以及实验不同阶段引入的伪影，这些数据本身具有较高噪声。在利用谱图识别真实信号（例如肽段碎片）之前，需要通过多变量统计方法对数据进行清理或预处理；这一过程可以降低谱图噪声和复杂度（维度），在肽段或蛋白质鉴定之前生成规模小得多、并且在统计上可处理的一组明确峰。多数商业 MS 仪器都配备软件，可基于各种预设参数和算法执行数据预处理，以便进行多种信号处理操作，包括基线校正、平滑、归一化和峰提取，从而产生更容易解释的 MS 谱图（Figure 11.8a）。数据平滑使用 Savitzky-Golay filtering、mean 或 median filtering、Gaussian filtering 等信号处理技术，去除谱图中由仪器噪声导致的低信号波动。基线校正涉及 Top Hat filter、Loess derivative filters 或 linear splines 等方法（Bauer et al. 2011），可去除估计的化学噪声；这类噪声可能来自整个仪器工作流程中存在的痕量污染物。平滑和基线校正是分别应用于每一张谱图的，而归一化则通过将所有谱图转换到相同的强度范围来校正系统性仪器变异，使同一实验中记录的谱图更具可比性。最后一个关键步骤是定义峰，即峰提取（peak picking）。该步骤利用若干成熟方法之一，根据 signal-to-noise ratio（SNR，信噪比）、centroid、Gaussian fit，或 center-of-width at half-maximum height 等指标，确定每个峰的精确质量、峰顶和强度。所得峰列表随后用于下游统计分析和生物学解释。

Figure 11.8 翻译

Figure 11.8 图中术语

• Data smoothing：数据平滑
• Baseline reduction：基线降低
• Peak picking：峰提取
• baseline：基线
• m/z：m/z
• Relative intensity (%)：相对强度（%）
• Monoisotopic m/z：单同位素 m/z
• Average m/z：平均 m/z
• Monoisotopic m/z = 14838.008：单同位素 m/z = 14838.008
• Average m/z = 17847.4411：平均 m/z = 17847.4411

Figure 11.8 质谱图的数据预处理工作流程。质谱图预处理工作流程中的不同步骤。（a）预处理步骤包括数据平滑、基线校正和峰提取。在将质谱图转换为适合进一步统计分析的峰列表时，每一步都有多种算法可用；这些峰列表随后用于肽段和蛋白质鉴定过程。（b）一个单同位素质量为 584.3124 的肽段碎片在不同电荷状态（+1、+2、+3）下可能产生的质谱图示意。（c）Gallus gallus 蛋白 lysozyme 的同位素包络图，显示其单同位素质量和平均质量。

Figure 11.8（续）

已有若干高级处理技术被开发出来，用于定义相关肽峰簇。这些峰簇可能来自多种电荷状态的存在、稳定同位素的天然丰度，以及 PTM 引起的质量偏移。由于质谱仪测量的是 m/z 比，而不是严格意义上的质量，因此具有相同质量但带有不同电荷状态的离子（例如 +1、+2、+3，分别来自一个、两个或三个质子离子的存在）会以不同的 m/z 比被检测到。例如，与带单电荷（+1）的肽离子相比，带 +2 电荷的肽离子（双质子化）所检测到的 m/z 比大约减半；而带 +3 电荷的第三种离子（三质子化）则只表现为三分之一的 m/z 值，依此类推（Figure 11.8b）。MALDI 电离通常产生低电荷状态（+1）的离子，而 ESI 过程则常常产生具有多种电荷状态的前体离子。为了实现准确检测，理想情况下应将每一张 m/z 谱图转换为一种与电荷状态无关的质量表示：即把 MS 检测到的某一肽段的所有多电荷形式重新计算为相应的单电荷形式，并将其归为一组，以计算总强度和峰宽。将多电荷状态简化为单一质量测量值的过程称为电荷状态归约（charge state reduction）或去卷积（deconvolution）。这些过程需要使用软件工具，并利用现代质谱仪的高分辨率；现代质谱仪能够分辨单个肽段的不同稳定同位素峰。例如，含有一个 13C（重同位素）元素的肽段，其测量质量会比相应的 12C（大量存在的天然碳）对应物重 1 Da。由于多数生物分子天然具有这类同位素变异（这里约 1% 的碳为 13C），通常每个分子都会观察到多个同位素峰，从而形成一个离子包络，并在 m/z 比上表现出特征性的质量偏移（Figure 11.8c）。

质谱仪系统产生的数据有以下两种形式。

• Average mass（平均质量）。这是该分子所有已观察到同位素形式的加权平均质量，通常由无法分辨同位素的低分辨率仪器报告。

• Monoisotopic mass（单同位素质量）。这是根据高分辨率谱图计算得到的，等于每种元素最丰度同位素的精确质量之和；其计算过程称为 “de-isotoping”，即去除最终峰列表中不需要的同位素。

单同位素质量被认为更准确，因为平均质量会受到天然同位素丰度变化的影响，因而无法同样精确地确定。同位素峰和单同位素质量的检测也有助于电荷去卷积过程。例如，一个带 +2 电荷的分子，其稳定同位素峰在谱图上的间隔约为 0.5（1/2）Da；带 +3 电荷时，间隔约为 0.33 Da，依此类推。

质量偏移还可能由化学加合物（例如钠）引起，这些加合物可在体外与肽段结合；也可能由化学修饰（例如生物学 PTM）或体外实验诱导的改变造成。例如，在样品制备过程中，甲硫氨酸残基常常会发生氧化，每添加一个氧原子，质量增加 16 Da。因此，加合物和 PTM 的检测依赖于确定胰蛋白酶肽段质量的改变，以及特定氨基酸残基侧链修饰后产生的产物碎片。为了准确鉴定修饰位点，必须同时在前体肽离子以及携带该修饰残基的一部分 N 端和 C 端碎片离子中检测到特征性的质量偏移。如果高分辨率仪器获得的 MS2 数据质量良好，则可以可靠地鉴定并定位单个肽段中的一个或多个候选修饰残基。

Ch11 Proteomics and Protein Identification by Mass Spectrometry / Proteomics Strategies

Proteomics Strategies

蛋白质组学策略

用于蛋白质分析的两种主要蛋白质组学策略是“bottom-up”（自下而上）和“top-down”（自上而下）方法。对蛋白质经蛋白水解消化后获得的肽段进行分析，通常称为 bottom-up proteomics 或 shotgun proteomics（鸟枪法蛋白质组学），并构成了迄今为止大多数蛋白质组学研究的基础。与 bottom-up 方法相对，top-down proteomics（TDP，自上而下蛋白质组学）是一种将 MS 用于探索完整蛋白质“proteoforms”（蛋白质形式）的概念。Bottom-up 策略可采用 targeted（靶向）或 global（全局）方法。在 targeted proteomics（靶向蛋白质组学）中，只用 MS 专门分析一小组预先选定的蛋白质；而在 global proteomics（全局蛋白质组学）中，则试图以最小偏倚分析给定样品中存在的所有蛋白质。

大多数标准的基于 bottom-up MS 的蛋白质组学研究包含三个不同阶段（Figure 11.9）。

1. 使用多种生物化学方法从一个或多个生物来源中提取和纯化蛋白质，随后将分离出的蛋白质经蛋白水解消化为肽段，并对所得混合物进一步进行液相色谱分级。

1. 对所得肽段进行定性和/或定量质谱分析。

1. 基于序列数据库搜索，对记录到的谱图数据集进行计算分析，以确定肽段氨基酸序列；其目标是鉴定并定量蛋白质，随后进行统计分析，以确保赋值结果具有可信度。

蛋白质组学研究的科学目标可能不同，可以是定性研究，也可以是定量研究。定性研究侧重于系统鉴定样品中的蛋白质，并表征其 PTMs（post-translational modifications，翻译后修饰）；而 quantitative proteomics（定量蛋白质组学）旨在测量绝对或相对蛋白质水平，例如样品之间蛋白质丰度的差异（如病例与对照；Box 11.4）。定量蛋白质组学是一种强有力的策略，可用于 shotgun 分析和 targeted 分析，通过定量相应的分子离子，理解不同条件下（如病理生理背景中）细胞、组织或生物体内全局蛋白质表达动态以及 PTM 模式的变化。该方法已在 systems biology（系统生物学）、biomarker discovery（生物标志物发现）和 biomedical research（生物医学研究）中形成了富有成效的应用领域。

Box 11.4 Quantitative Proteomics（Figure 11.10）

• Label-free quantification（无标记定量）。 这是一种相对定量技术，用于比较两次或多次 liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS/MS，液相色谱-串联质谱）运行之间的蛋白质或肽段水平。在这里，其假设是：在理想条件下，在不同实验条件下测得的相同肽段，可以直接使用记录到的 MS1 强度或谱图计数进行比较。无标记技术的优点是，它不需要进行标记所需的额外实验步骤，并且任意数量的实验都可以较容易地进行比较。其缺点来自 MS/MS 固有的欠采样问题：复杂混合物中存在的并非所有肽段都能在样品之间被一致检测到，即使是重复运行也如此，这会导致丰度估计产生方差，从而削弱差异水平统计度量的效力。

• Labeling strategies（标记策略）。 蛋白质组学样品可以通过体内 metabolic labeling（代谢标记）进行同位素标记，也可以通过对提取出的蛋白质或肽段进行体外化学标记来实现。由于同一（多）肽的轻同位素形式和重同位素形式在化学性质上相同，它们通常会在 LC 分级过程中共同洗脱，因此可以同时被检测到；但在 MS 分析中，由于其质量不同，又可以被区分。随后，可比较两个或多个实验组中测得的重标记肽段与轻标记肽段峰强度比值，以确定一个样品相对于另一个或多个样品的丰度变化。如果测量以精确方式产生，则可可靠地推断具有统计学意义的变化。可在样品制备过程中，采用体内和体外方法，在蛋白质或肽段水平引入多种同位素标记或标签。下面讨论不同的标记策略。

Figure 11.9 Shotgun proteomics workflow.

Figure 11.9 Shotgun proteomics workflow. 示意图显示了典型“bottom-up” liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）流程中涉及的不同步骤。蛋白质样品通常使用 trypsin（胰蛋白酶）进行酶促消化，生成肽段；随后对这些肽段进行色谱分离，以在注入（electrospray，电喷雾）串联质谱仪进行碎裂之前简化样品。电离后，气相 precursor ions（前体离子）在第一轮扫描中产生 MS1 谱图。这些 parent（precursor）ions（母离子/前体离子）随后 either individually（data-dependent acquisition，数据依赖采集）或 concomitantly（data-independent acquisition，数据非依赖采集）发生碎裂，产生 MS2 谱图。获得的 MS2 谱图随后通过多种搜索算法进行肽段鉴定（数据库或谱图库搜索）和蛋白质推断（综合评分）。

Figure 11.10

Figure 11.10 A schematic diagram comparing the label-free approach with the different labeling strategies. 比较 label-free 方法与不同 labeling strategies 的示意图。由红色矩形表示的同位素标记在定量蛋白质组学工作流程的不同阶段被引入样品中，随后样品被混合并接受质谱仪分析。

– Metabolic labeling（代谢标记）。 体内稳定同位素标记是通过在含有特定氨基酸或营养物的条件下培养所研究的细胞或生物体来完成的，这些氨基酸或营养物含有一个或多个重同位素。较常用的代谢标记技术之一是 stable isotopic labeling by amino acids in a cell culture（SILAC；Ong et al. 2002），即细胞培养中的氨基酸稳定同位素标记。在 SILAC 中，培养基中存在的重同位素在生长过程中被引入哺乳动物细胞，从而在 MS 分析中使消化后的肽段质量发生可预测的偏移，该偏移与标记掺入效率成比例。经 MS 分析的差异标记样品中的肽段通常被检测为成对峰，其中观察到的质量差异反映了所用标记氨基酸的数量和性质，从而允许快速比较肽段和蛋白质比值。在 SILAC 实验中，重标记 lysine（赖氨酸）和 arginine（精氨酸）用于对待比较的两个（或三个）样品进行双重（或三重）标记。其他同位素标记技术主要使用体外方法；如下所述，这些方法通常通过化学或酶促处理，对纯化的或经蛋白水解消化的测试样品和参照蛋白质样品进行共价修饰来实现。

– Chemical labeling（化学标记）。 Isotope-coded affinity tagging（ICAT；Gygi et al. 1999，同位素编码亲和标签）是一种开创性的化学标记技术，其中蛋白质样品在 cysteine（半胱氨酸）残基处与同位素重试剂或轻试剂偶联。ICAT 试剂由三个组成部分构成：一个针对 cysteine 的反应基团，用于标记氨基酸侧链；一个八重氘代（d8；使肽段分子质量增加 8 Da）或轻型（d0）连接区域；以及一个用于亲和分离标记多肽的 biotin（生物素）标签。随后将标记样品混合，用适当的 protease（蛋白酶）如 trypsin 进行消化，在 streptavidin（链霉亲和素）亲和柱上进行标签捕获，然后在进行 MS 分析之前洗脱。

另一种替代性的、成本较低的化学标记技术是 dimethyl labeling（二甲基标记）。该技术在蛋白质经过蛋白水解消化后应用，基于肽段一级胺的反应（肽段 N 端和 lysine 残基的 epsilon 氨基；Hsu et al. 2003）。二甲基标记试剂由 formaldehyde（甲醛）和 cyanoborohydride（氰基硼氢化物）组成，其标记形式含有氘代氢和 13C 原子的组合，并可用于 triplex（三重标记）。这使得可以在一次 MS 运行中，通过比较二甲基标签的质量差异来确定不同样品中的蛋白质丰度，从而对三个样品进行定量分析。

– Enzymatic labeling（酶促标记）。 酶促标记技术，例如使用 trypsin 等蛋白酶进行的蛋白水解标记，可在切割（水解）反应过程中引入 18O（或常规 16O）标记水，从而生成同位素标记肽段。例如，在一个两步反应中，多肽水解切割时，一个 18O 或 16O 原子被掺入所得肽段的羧基末端；随后发生羧基氧交换反应，将第二个 18O（或 16O）原子掺入每条肽段的羧基末端（Miyagi and Rao 2007）。

所有同位素标记技术都允许基于测量差异标记肽段之间的质量差异进行相对定量，但受限于一个实验组中可共同研究（multiplexed，多重化）的样品数量。质量差异这一概念通常限于二元（2-plex）或三元（3-plex）试剂组，因为更高阶多重化会导致 MS1 谱图复杂性增加、区分能力下降。通过使用为更高多重化而设计的 isobaric tags（等重标签；见 Isobaric Tagging），可以在一定程度上克服这一限制。

– Isobaric tagging（等重标记）。 Isobaric tag for relative and absolute quantification（iTRAQ；Ross et al. 2004）和 tandem mass tag（TMT）reagents（Thompson et al. 2003）代表了两种可用于定量 MS 的等重标记技术。iTRAQ 试剂有 4-plex 和 8-plex 形式，而 TMT 试剂有 2、4、6、8、10，以及最近的 11-plex 形式。这些等重稳定同位素标签由以下部分组成：一个 mass reporter（质量报告基团），具有独特数量的 13C 和/或 15N 重同位素取代；随后是一个 mass normalizer（质量平衡基团），用于平衡标签质量，使所有标签具有相同质量，因此在 MS1 前体离子扫描中形成共同的 m/z 峰；最后是一个反应区域，将标签交联到目标多肽上的 amine（胺基）或 cysteine 残基。样品用各自的质量标签标记后合并，用于 LC-MS/MS 分析。由于所有标签具有相同质量，所有样品中存在的相同肽段表现出相同的质量偏移，并在 MS1 中作为单一前体离子峰共同洗脱。MS2 碎裂后（例如通过基于 higher energy collisional activation dissociation 的碰撞活化），报告标签在特定连接区域同时被切下，形成质量接近但彼此不同的分子片段报告离子；这允许对相对肽段强度进行并行定量，同时获得相应的肽段碎片离子系列，用于蛋白质序列鉴定。

用于比较性定量蛋白质组学分析的主要方法有两类：同位素标记技术和无标记技术。定量蛋白质组学中使用的 MS2 方法在很大程度上与蛋白质鉴定所用方法相同，但增加了用于丰度测量的一个维度。在 label-free 方法中，每个样品分别通过 LC-MS/MS 进行分析，然后基于每个样本或样品组中每个蛋白质或 PTM 位点获得的 MS2 谱图计数，对测得的离子水平进行比较。在基于标记的方法中，一个实验组内的样品被同位素标记（例如通过体外化学标签或体内代谢标记），随后合并并在同一次 MS 运行中一起分析；同位素标签的不同质量既区分了多重化样品的来源，也区分了每个样本中相应蛋白质的相对水平。通常认为同位素标记策略更准确，因为样品可以直接比较；并且由于样品处理和 MS 欠采样造成的变异被最小化，因此可产生更可重复的结果。然而，这些策略实施成本更高、耗时更长，在可合并样品数量方面更受限制，并且需要专门的软件工具进行数据分析（见 PSM Software）。另一方面，尽管 label-free 方法在所分析样品总数方面具有良好的扩展性，并且更容易实施，但它们在检测蛋白质丰度小差异方面可能效果较差，并且可能存在较低的可重复性。

相对定量比较两个实验组样品之间的蛋白质或肽段水平，例如测量健康状态与疾病状态、突变细胞与野生型细胞，或祖细胞与分化细胞之间分子谱的差异（Filiou Michaela et al. 2012）。而绝对定量使用 reference standards（参考标准品）来确定一个或多个样品中一个或多个目标蛋白质或肽段的精确数量，因此适用于确定蛋白质浓度、蛋白质复合物亚基化学计量关系以及 PTMs 的程度（Gerber et al. 2003）。

此外，蛋白质组学中通常使用两种不同策略，均涵盖 targeted MS：基于 discovery（发现）的 global profiling（全局谱分析）方法，以及 hypothesis-driven（假设驱动）的 directed（定向）方法（Schubert et al. 2017）。基于发现的蛋白质组学研究是开放式的，可在使用 bottom-up shotgun sequencing 时通过 data-dependent acquisition（DDA，数据依赖采集）程序完成。在 DDA 中，所有高于预定强度的肽离子都被选择用于 MS2 碎裂，并随后以迭代（串行）方式从所得碎裂谱图中进行鉴定。也可以进行 data-independent acquisition（DIA，数据非依赖采集），其中样品中肽段的共同碎裂和鉴定以更系统化、多重化的方式进行，最典型的是同时分析某一质量范围内的所有肽段。相比之下，假设驱动的蛋白质组学使用先验信息，预先选择仅一个或少数特别感兴趣的蛋白质和肽段用于 MS2 分析。这包括 targeted MS detection（靶向 MS 检测），例如 selected reaction monitoring（SRM，选择反应监测）。在 SRM 中，MS 会选择性筛选少数预先定义的 fragment reporter ions（碎片报告离子）的信号强度模式，这些离子特异于感兴趣的目标蛋白质或肽段，用以确认分子身份。在谱图中选择性检测到这些模式，即可鉴定相应分子。靶向蛋白质组学的优势在于，这种选择性筛选允许更灵敏、更特异的蛋白质检测。检测携带特定 PTMs 的肽段、代表明确分子响应的肽段，或血液中以痕量存在的候选循环生物标志物，是靶向蛋白质组学最常见的应用场景。

Shotgun 方法虽然流行且相对较易实施，但必须同时处理蛋白质推断（肽段到蛋白质的赋值）方面的歧义，以及序列/修饰覆盖不完整和不一致的问题。在 bottom-up 工作流程中，亲本完整蛋白质与相应消化肽段之间的连接关系会丢失，从而在综合分析过程中带来复杂性（即赋值问题）。由于 TDP 方法同时测量完整蛋白质以及由 MS2 产生的碎片离子质量，因此可以获得缺口更少、更高的序列覆盖度，有助于表征 proteoforms 等蛋白质变体。然而，尽管 TDP 技术减少了推断问题，它高度依赖 feature discrimination（特征区分）和 deconvolution（去卷积）（例如解析由 ESI 产生的高度复杂、多重带电完整蛋白质离子包络；Kelleher et al. 1999）。

现在，读者已经了解了蛋白质 MS、样品制备以及 biological MS（生物质谱）基础数据分析背后的一般概念，我们可以考察当前使用较多的基于 MS 的蛋白质组学技术。

Ch11 Proteomics and Protein Identification by Mass Spectrometry / Peptide Mass Fingerprinting

Peptide Mass Fingerprinting

肽质量指纹图谱（peptide mass fingerprinting, PMF）是一种概念上较为简单的蛋白质鉴定技术。在该方法中，单一多肽（例如凝胶条带）首先由具有序列特异性的蛋白酶（通常为 trypsin）切割成较小的肽段，随后通过准确的 MS 测定所得肽段的质量。MALDI 或 ESI 分析为鉴定凝胶条带或斑点中的蛋白质提供了一种快速、准确且高效的方法。PMF 的基本前提是：任何独特蛋白质都可以较容易地用一组独特的肽质量来描述，这些肽质量对应于经酶切产生的特定子序列中的氨基酸组成。虽然某些蛋白质可能高度相似（由基因重复或旁系同源基因编码），但一个蛋白质序列中通常至少有一部分是独特的，因此应当能够产生特异、可识别的肽质量组合。因此，如果某一特定多肽以特定方式被切割，则由 MS 获得的所得肽质量会形成一种独特的“指纹”，可特异性地映射回相应的蛋白质序列；该序列需要预先已知，即来自参考序列数据库。

PMF 蛋白质鉴定过程的关键在于，将实验测定的肽质量与理论预测的质量进行比较和匹配。肽质量可以通过 in silico 方法推断：取给定生物体的注释蛋白质序列，并按照处理真实样品所使用的同一种酶（例如 trypsin）切割规则进行计算机模拟切割。对数据库中每个蛋白质的每个肽段质量进行计算，并将所得模式与 PMF 分析中观察到的质量进行比较（Figure 11.11）。统计方法用于确定某一给定蛋白质的哪种理论肽段组合与观察到的肽段最为匹配；这通常包括进行显著性评估，以计算该匹配由偶然因素产生的概率（即假阳性概率）。在预先定义的质量误差范围（mass tolerance，质量容差）内具有最佳对应关系的候选蛋白质，被认为是最可能的候选者。显然，当样品为蛋白质混合物时，PMF 更容易出错；如果所研究的生物体尚未完成测序，则 PMF 也无法使用。此外，在样品处理过程中必须谨慎，避免出现来自污染物的无关肽段，例如来自头发和皮肤的肽段，或 trypsin 自溶产生的肽段，因为这些都可能导致伪结果。蛋白质消化是一个随机过程，蛋白酶可能并不会在每一个切割位点处都完全切割多肽，从而产生漏切（missed cleavages）。不完全蛋白水解消化可能产生较长的肽段，这些肽段更难检测或裂解。如果在理论消化的序列数据库中包含所有可能的部分切割肽段，也会导致复杂度呈指数级增加。如果未考虑未知 PTMs（post-translational modifications，翻译后修饰）或样品制备过程中发生的化学修饰（例如氧化）的存在，也可能产生伪结果，因为这些修饰可增加或降低分子量。修饰的程度可以是不完全的（variable modifications，可变修饰），也可以是在某一特定氨基酸的所有出现位置上普遍存在的（fixed modification，固定修饰）；例如半胱氨酸的 carbamidomethylation（羧酰胺甲基化）就是样品制备中常用的一种反应，用于防止样品消化后形成半胱氨酸交联桥，该反应会增加半胱氨酸的分子量。由于匹配的只是肽质量，而不是精确序列，PTMs 的存在可能导致结果产生歧义。数据库中的理论肽质量数量会随着每一种可变修饰而呈指数级增长，从而降低匹配特异性，并显著增加搜索时间。因此，为了降低计算复杂度，需要限制允许的可变修饰数量；同时，参考数据库又必须能够考虑所有可能的漏切和可变修饰组合。

PMF 数据库搜索概念最早由 Henzel 及其同事实现，他们于 1993 年开发了 Fragfit 计算算法（Henzel et al. 1993）。该程序在搜索包含 91 000 条候选蛋白质序列的数据库时，仅使用每个蛋白质 3 个肽质量，就能准确鉴定从 Escherichia coli 细胞裂解液中分离出的蛋白质，展示了计算软件与 MS 联合用于蛋白质鉴定的价值。虽然 PMF 方法的核心优势在于只需（准确）测量（独特）肽段的质量，但当混合物中含有一个以上蛋白质时，PMF 算法会受到干扰。理想情况下，如果能够测定肽段的序列，而不仅仅是它们的质量，那么蛋白质混合物的问题以及蛋白质鉴定的置信度都可以得到改善。如下文所述，利用 tandem mass spectrometric techniques（串联质谱技术）实际上可以实现肽段测序。

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Figure 11.11 Peptide mass fingerprinting (PMF) workflow.

Figure 11.11 肽质量指纹图谱（PMF）工作流程。 示意图显示了 PMF 流程中的不同步骤。纯化蛋白质样品经酶切消化后，提取出的肽质量通过 mass spectrometry（MS，质谱）进行测量；由于速度快且操作简便，通常采用 matrix-assisted laser desorption ionization（MALDI，基质辅助激光解吸电离）time of flight（TOF，飞行时间）MS。随后，将观察到的肽质量模式与理论计算质量进行比较；理论质量通过在参考数据库中的蛋白质序列上以 in silico 方式应用酶切割规则获得，并使用搜索算法进行分析，得到按排名排列的候选蛋白质列表。

图中主要流程标签：

• Proteolysis：蛋白水解
• Peptide mixture：肽混合物
• Purified protein sample：纯化蛋白质样品
• Intensity (%)：强度（%）
• Mass spectra：质谱图
• Peak list：峰列表
• Match：匹配
• In silico digestion：计算机模拟消化
• Sequence database entry：序列数据库条目
• Theoretical proteolytic peptides：理论蛋白水解肽段
• Calculation of peptide mass：肽质量计算
• Theoretical peak list：理论峰列表
• Result：结果
• Ranked list of protein candidates：候选蛋白质排名列表
• Monoisotopic mass of Peptide (+)：肽段（+）单同位素质量
• Seq No.：序列编号
• Score：得分

Ch11 Proteomics and Protein Identification by Mass Spectrometry / PMF on the Web

PMF 的 Web 应用

Mascot

Mascot 是一种广泛使用的商业化 MS 搜索引擎，也是最早将基于概率的评分方法用于 peptide 和 protein 鉴定的搜索引擎之一。它源自 MOWSE 概率算法；MOWSE 只能进行 PMF 搜索，并且在计算 peptide mass values 之前，需要预先建立按特定 enzyme 划分索引的数据库。这使得搜索潜在的 PTMs 变得困难，因为每一种修饰组合都需要一个新的数据库。Mascot 的开发正是为了解决这些限制：它可以直接从 sequence databases 中“on the fly（即时）”计算质量值，从而不再需要数据库索引，并增加了对 PTMs 和更灵活搜索策略的支持（Perkins et al. 1999）。

数据以 peptide masses 或 peak lists 的形式在线提交。其他与搜索相关的参数（见 Table 11.2）包括样本（物种）taxonomy、protein reference database、潜在 modifications、proteolytic enzyme、允许的 missed cleavages 数量、所使用的 MS scan mode，以及在计算 peptide mass 时使用 monoisotopic mass values 还是 average mass values；这些参数连同 protein mass window 和 match error tolerance 一起作为输入提供。搜索结束后，系统会生成一份详细的 summary report，其中概括给出推定的 peptide 和 protein identifications（Figure 11.12）。

Mascot 在 peptide identification 中的基本思路，是计算观察到的实验数据与 reference database 中某个候选条目之间的匹配仅由偶然因素产生的概率。概率最低的 peptide 被视为最佳匹配，并以 −10*log10(P) 的形式报告，其中 P 为实际概率。Mascot 还通过 target–decoy 方法计算 false discovery rate（FDR；见 Box 5.4）来估计显著性：即使用相同参数，将搜索重复应用于一个序列被反向或随机化的数据库。由于在这个“decoy”数据库中预期不会出现真实匹配，因此其中的匹配数量可以很好地估计结果中的 false positives 数量。任何基于概率评分的 spectral matching 算法，其目标都是为 peptide-spectrum match 指定一个置信水平，以剔除 false positives；因此，在当时的其他 MS 搜索工具相比之下，这一方法具有巨大优势。

Ch11 Proteomics and Protein Identification by Mass Spectrometry / Proteomics and Tandem MS

Proteomics and Tandem MS

虽然 PMF 是一种简单而快速的蛋白质鉴定方法，但它也存在一些重要缺陷。多个不同蛋白质同时存在、未被考虑的剪接变体，以及 PTMs 引起的意外质量偏移，都会削弱其有效性。只有当蛋白质的肽段处于所记录的质量范围内，并且对应于数据库中已有明确定义的序列时，才可能被鉴定出来。串联质谱（tandem MS，MS/MS 或 MS2）的引入，有助于克服其中许多限制。通过二级肽段碎裂获得的额外信息，以及更好的搜索算法，使复杂蛋白质混合物的分析成为可能。

![Figure 11.12 Mascot peptide mass fingerprinting (PMF)]()

Figure 11.12 Mascot 肽质量指纹图谱（peptide mass fingerprinting，PMF）。PMF 提交界面和搜索结果，展示代表性的蛋白质汇总报告，其中匹配肽段以红色标出。（a）PMF 提交表单，可选择搜索特异性参数，例如酶、漏切次数、物种分类、修饰以及肽段质量。（b）蛋白质搜索结果页面显示按排序排列的蛋白质列表，每个蛋白质均给出一个 −log10(P) 蛋白质得分。显著性得分最高的蛋白质被认为是最可能的匹配。（c）蛋白质视图页面在匹配的蛋白质序列中显示已鉴定肽段（红色）、序列覆盖百分比，以及已搜索和已鉴定的质量值数量。（d）蛋白质视图页面的续页列出已鉴定肽段序列的位置，同时给出实验质量（在提交表单中输入）以及搜索所用蛋白质序列数据库中计算得到的和理论的肽段质量。

Figure 11.12（续）

Figure 11.12（续）

Figure 11.12（续）

Peptide Spectral Matching

从生物混合物中鉴定蛋白质最常用的方法，通常涉及从 shotgun LC-MS/MS 数据集中推断肽段序列。这一过程通常通过数据库搜索方法完成，或通过肽段谱图匹配（peptide spectral matching，PSM）完成。在 PSM 中，以若干 MS 数据格式之一保存的已采集 MS2 谱图（见 Reporting Standards）会与一组编译好的注释蛋白质序列进行搜索比对；这些序列通常来自经人工审查的公共数据库，例如 UniProt 或 NCBI nr（见第 1 章；Table 11.1）。

在所有数据库搜索算法中，数据库中的每一条记录首先都会进行 in silico 酶切，即采用与实验样品实际酶切所用酶相同的特异性规则。随后，每个实验 MS2 谱图会与每个肽段的理论碎裂模式进行相关性比较。理论碎裂模式依据常见碎裂规则构建，这些规则会考虑具有相同质量（即 isobaric，等质量）的氨基酸离子、氨和水离子的丢失，以及离子的谱峰强度，以寻找合适的匹配。搜索通常限制在满足用户设定标准的一部分肽段范围内，例如质量容差、蛋白水解酶约束、是否允许漏切，以及是否存在可能的 PTM。

Table 11.1 常见蛋白质序列来源列表（以 FASTA 格式使用）。

搜索输出是一组候选匹配列表，包括肽段序列及其对应蛋白质。这些候选项会被赋予得分并排序，以确定最可能的候选结果。不同的数据库搜索工具采用不同的评分方案，为每个匹配计算似然得分，从而区分潜在正确的指派与可能错误的指派。目前已有多种有效的 MS2 数据库搜索工具可用，包括成熟且广泛使用的商业发布软件，如 SEQUEST 和 Mascot；也包括免费可用的软件，如 X! Tandem、Andromeda/MaxQuant 和 MS-GF+（见 Internet Resources）。

为了尽可能提高肽段鉴定的可靠性，大多数算法还会将查询 MS2 谱图与同一参考序列的随机化或反向 decoy 版本进行搜索比对，以定义并最小化 FDR。也就是说，在给定得分下，计算随机匹配数量相对于非随机匹配数量的函数关系。随后，通过设置严格的评分阈值，从结果中过滤掉不可靠的鉴定结果，以在保留合理候选鉴定的同时尽量减少假阳性。最终确定的已鉴定肽段列表随后会在数据库搜索之后，通过数据归一化和统计评估组装为对应蛋白质，这一过程称为蛋白质推断（protein inference）。

使用 MS2 鉴定 PTMs 在计算上更为密集，也更容易出错，因为它需要在蛋白质数据库的大多数肽段序列中搜索所有潜在质量偏移组合。这会导致潜在候选匹配数量发生组合爆炸。因此，数据库搜索工具通常建议在一次运行中最多只搜索两种或三种不同修饰。Mascot、SEQUEST 和 MaxQuant 等大多数常规数据库搜索工具，只能检测固定数量的预先指定 PTMs。然而，也已经开发出更灵活的算法，用于鉴定未指定 PTMs。这些方法包括采用“blind”或 PTM-agnostic 搜索策略的算法，例如 Sequential Interval Motif Search（SIMS）；也包括混合搜索方法，例如 GutenTag、InsPecT 和 PEAKS PTM 中实现的方法。由于搜索空间在很大程度上没有边界，作为一种实用限制，混合搜索会先生成一个容错性的 de novo 初始搜索，用于缩小潜在候选序列范围；或者先进行一轮常规数据库搜索，以过滤得到较小的蛋白质候选池。

De Novo Peptide Sequencing

标准序列数据库搜索方法无法鉴定参考库中不存在的新肽段；当所研究生物的相应基因组序列不可用或不完整时，该方法也无法使用。在这种情况下，de novo sequencing 是一种替代方法，即在没有现存氨基酸序列先验知识的情况下，对肽段谱图进行测序。

De novo sequencing 利用两个相邻碎片离子之间的连续质量差，累积计算肽段骨架中相应氨基酸残基的质量。识别离散峰离子类型是 de novo 搜索算法的关键特征（Figure 11.13）。例如，利用碰撞诱导解离（collision-induced dissociation，CID）碎裂产生的 “b” 离子系列或 “y” 离子系列，可以生成一组氨基酸序列；这些序列也与完整肽段的实测质量一致（Box 11.1）。根据多种标准，例如谱图反卷积，以及对 homeometric peptides 的过滤，即不同肽段具有相似的理论相同 b 峰和 y 峰集合，候选序列（通常多达数万条）会被缩小到最符合实验 MS2 谱图的结果。

![Figure 11.13 Peptide sequencing via tandem mass spectrometry (MS/MS) spectra interpretation]()

Figure 11.13 通过串联质谱（MS/MS）谱图解释进行肽段测序。注释后的 MS2 谱图显示代表 b 离子和 y 离子的肽段碎片峰。De novo sequencing 算法在迭代过程中利用相邻碎片离子对之间的质量差，计算相应氨基酸残基的质量，从而沿肽段骨架确定序列。例如，y5 与 y6 离子之间的质量差等于 87.04 Da，对应丝氨酸（serine，S）的精确质量。类似地，y5 与 y4 之间的下一个残基可根据相应质量差确定为亮氨酸（leucine），或等质量残基异亮氨酸（isoleucine）。截图展示 PEAKS de novo 搜索引擎，突出显示注释谱图及候选肽段推导序列。

De novo 方法的优点是不会受到搜索数据库中序列错误的影响，并且可以使用部分序列来搜索 PTMs。然而，与 blind PTM 搜索一样，它也是一个计算密集且容易出错的过程，因此特别依赖高质量 MS2 谱图；这些谱图需要完整、准确度高，并且没有虚假噪声。一些常用 de novo 软件工具包括 Lutefisk、PEAKS 和 PepNovo+（见 Internet resources）。

Spectral Library Searching

谱图库搜索（spectral library searching）已经成为传统蛋白质序列数据库搜索的一种替代方法，尤其适用于基于 DDA 的数据生成流程。理论上，对于给定序列而言，库中 MS2 谱图比数据库搜索为同一肽段序列计算预测得到的 in silico MS2 谱图，更忠实地表示了观测到的碎片离子强度和离子类型。一旦一个 MS2 肽段谱图通过传统 shotgun 测序蛋白质组学流程被可信匹配，它就会被存储在一个注释谱图库（annotated spectral library，ASL）中，之后可被重复用于快速鉴定另一实验中由同一肽段产生的其他 MS2 谱图。

由于这种方法不依赖对常规蛋白质序列的访问，也不需要面对数量巨大的未经验证候选项，因此与传统数据库搜索方法相比速度极快。一次成对谱图比较只需数毫秒即可完成，而标准数据库匹配方法需要数分钟，因此谱图库搜索为鉴定 MS2 谱图提供了一种更高效、也可能更可靠的方式。

谱图库搜索本质上是一种模式匹配策略，自 20 世纪 50 年代以来已被用于分析光谱学。然而，它作为蛋白质组学搜索工具的应用，只是在过去二十年中才成为可能。这得益于代表性样本的蛋白质组范围 MS2 谱图逐渐可用，使代表性 ASLs 的构建成为可能。谱图库搜索正迅速成为若干应用中的理想工具，例如仪器质量控制、分子扫描仪和生物标志物验证；在这些应用中，快速且可信地匹配预定义靶标至关重要。

National Institute of Standards and Technology（NIST；Stein 1990）和 Global Proteome Machine（GPM；Fenyö et al. 2010）数据库是两个公开可用的参考肽段谱图库，合计包含来自 1600 万种不同肽段的 60 多亿条注释谱图。随着越来越多高质量 MS2 数据的产生，它们也在持续更新。由于目标是快速鉴定，谱图库搜索引擎只需要一个注释 MS2 谱图库，以及指定蛋白质消化所用蛋白酶的明确定义规则。

得到的候选 peptide-spectrum matches 列表首先通过对齐前体质量进行过滤，然后根据与实验 MS2 谱图计算得到的 Pearson 相关性进行评分。匹配得分用于表征实验 MS2 谱图与库中 MS2 谱图之间的相似性。候选项按得分排序，库中得分最高的肽段被指派给该谱图。由于谱图库来源于实验观测到的 MS2 谱图，这一方案赋予库搜索比传统数据库搜索更高的鉴定灵敏度。然而，应始终注意谱图库中肽段过度代表或代表不足所引发的问题。

谱图库搜索甚至可以鉴定带有意外 PTMs 的肽段；这些 PTMs 在查询传统数据库时可能无法检测到，因为传统数据库搜索要求事先知道样品中存在的所有 PTMs。这种效率和灵敏度的提升，也推动了专门用于 PTMs 鉴定的谱图库发展。目前使用的一些谱图库搜索算法包括 NIST 的 MS PepSearch、PeptideAtlas 的 SpectraST，以及 GPM 的 X! Hunter。

Hybrid Search

混合搜索（hybrid search）是一种结合 de novo sequencing 和数据库序列搜索要素的方法。在混合搜索中，从 MS2 谱图获得的短肽段序列标签（peptide sequence tags，PSTs；长度为 3–5 个氨基酸残基）会被用于容错性数据库搜索。所谓容错性搜索，是指允许产生 MS2 谱图的肽段序列与数据库序列之间存在一个或多个错配。

PST 是一个短氨基酸序列，并带有前缀和后缀质量值，用于指定其在完整肽段中的起始和终止位置（Figure 11.14）。在肽段序列标签技术中，氨基酸连续片段会根据碎裂峰之间的间距外推得到；这些“peptide-words”随后用于在序列数据库中鉴定蛋白质。这种标签技术将搜索空间限制到数据库中含有该序列标签的肽段，从而显著缩短搜索时间。代表性的 PST 搜索算法包括 GutenTag 和 InsPecT。

![Figure 11.14 Peptide sequence tag searching]()

Figure 11.14 肽段序列标签搜索。示意图说明如何使用序列标签（PST）或“word”从 MS2 谱图中鉴定未知肽段。对于蛋白质鉴定，PST（示例中为 LRL）会与互补信息结合使用；这些互补信息包括序列标签之前（N-terminal）的肽段片段质量（mass1）和序列标签之后（C-terminal）的肽段片段质量（mass2）。

Top-Down (Intact Protein) MS

早期 top-down 研究受到样品异质性和蛋白质大小方面的限制。然而，当前分析分离技术的进展，例如纳流反相液相色谱（nanoflow reverse phase liquid chromatography，RPLC）、凝胶洗脱液体组分包埋（gel-eluted liquid fraction entrapment，GELFrEE）、疏水液体相互作用色谱（hydrophobic liquid interaction chromatography，HLIC）、毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）以及等电聚焦（isoelectric focusing，IEF），再加上 MS 仪器分辨率不断提高，以及基于光子和电子捕获方法的离子碎裂技术不断改进，例如表面诱导解离（surface-induced dissociation，SID）和紫外光解离（ultraviolet photodissociation，UVPD），已经使从日益复杂的混合物中表征完整蛋白质成为可能。

近期研究显示，top-down 方法可用于解析含有多种 proteoform 的大分子复合物成分。研究甚至已经确立 TDP 可用于监测临床样品中的 proteoforms，例如在脑脊液中监测儿童脑肿瘤预后相关生物标志物，以及在 Down syndrome 患者唾液中监测早发 Alzheimer disease 的生物标志物。目前使用的一些开源 top-down 分析工具包括 ProSight PTM、TopPIC、MS-Align+，以及最近发布的 Informed-Proteomics。

Database Search Models

现代蛋白质组学平台会生成海量 MS2 谱图，通常每项研究产生数百万张谱图；这些数据只能通过自动化搜索引擎或软件平台进行分析。已有大量评分算法被提出，但目前使用的算法可分为两大类：一类算法在序列搜索和评分之前，需要根据谱图中的离子峰解释并选择特定离子质量特征；另一类算法则不需要解释，并尝试对所有可用质量峰进行评分。De novo sequencing 算法则从零开始推断多肽序列。

Ch11 Proteomics and Protein Identification by Mass Spectrometry / PSM Software

PSM Software

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一类算法属于第一种类型，而标准数据库搜索算法（执行序列匹配）则遵循未解释（uninterpreted）方法。两类算法各有优缺点，但二者都可以从高质量的 MS2 谱图中有效鉴定多肽序列。

根据 PSM 所采用的评分方法，未解释搜索算法还可以进一步分为四个亚类：描述性（descriptive）、解释性（interpretative）、随机性（stochastic）和基于概率的匹配（probability-based matching）。描述性算法通过相关分析将实验谱图与理论谱图进行匹配；解释性模型则尝试在进行数据库搜索之前，先从 MS2 谱图中解释出部分序列。基于概率的匹配模型通过建立实验谱图与数据库之间的统计关系，推导肽段鉴定的概率；随机评分模型则利用已知谱图的训练集来推导最佳匹配的概率。

PSM Software

所有搜索引擎的目标，都是解析由肽段碎裂产生的 MS2 谱图：它们通过不同的评分方案定义“匹配”，从候选序列中选择最佳匹配列表，并将多个已鉴定肽段组装到其对应的蛋白质上。采用概率评分方法的搜索引擎试图区分真实鉴定与错误鉴定；而非统计评分的搜索引擎则依赖后续应用统计工具，例如 PeptideProphet、StatQuest（Kislinger et al. 2003）或 Percolator，将初始匹配得分转换为似然值或概率。

有些搜索引擎可以作为独立应用程序使用，用于对采用特定 MS 技术获得的数据进行鉴定，甚至进行定量；另一些则集成在大型软件包或平台中，使 MS 数据分析更加完整且用户友好。有些工具（如 MaxQuant 和 MS-GF+）是开放访问且免费提供的，而另一些则是需要授权使用的专有商业软件包。某些工具提供在线版本，允许进行受限分析；目前的最新趋势是使用云计算服务，例如 Amazon Web Services（Halligan et al. 2009）和 ProteoCloud（Muth et al. 2013）。不过，大多数应用程序仍需要在具备足够计算能力的本地计算机或计算集群上运行。对当前众多可用搜索工具的所有关键属性进行深入讨论，超出了本章范围；下面将简要介绍一些使用较广泛工具的若干方面。

SEQUEST

SEQUEST 搜索算法是一种稳健的描述性评分方法，由 University of Washington 的 Eng、Yates 及其同事提出（Eng et al. 1994）。它是第一个、并且现在仍是使用最广泛的自动化数据库搜索工具之一，用于从 MS2 数据中进行肽段鉴定。

SEQUEST 算法通过一种迭代式肽段-谱图匹配策略对 MS 数据进行预处理。该策略首先基于前体离子质量（precursor mass）和用户指定的容差筛选候选肽段，随后进行峰分箱（peak binning）和归一化。预处理后的数据随后采用两步评分方法进行打分：首先根据 MS2 谱图中与实验数据匹配的离子数量，计算初步得分（Sp）。随后，为排名前 500 的候选肽段生成理论构建谱图，并将其与实验谱图进行系统比较，以生成归一化互相关得分（XCorr）。XCorr 是带有校正因子的标量点积（Figure 11.15）。具有最高 XCorr 值的肽段被视为最佳匹配；匹配质量和唯一性则进一步通过计算 Delta correlation（ΔCn）得分，根据最佳匹配与次优匹配之间的差异进行判断。这种互相关分析是 SEQUEST 中实现的主要功能，使该工具具有较高灵敏度，但同时也带来较大的计算量，即运行速度较慢。

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Proteomics and Protein Identification by Mass Spectrometry

Figure 11.15 Peptide spectrum match（PSM）。 注释后的 MS2 谱图，显示了一个代表性 BSA（bovine serum albumin，牛血清白蛋白）肽段中匹配的离子系列；该肽段使用 SEQUEST 搜索算法鉴定得到。

在后续更新中，SEQUEST 增加了鉴定动态（可变）修饰的能力；之后，SEQUEST 被整合进商业软件套件 Proteome Discoverer。随后，为开发更快速版本的 SEQUEST，人们引入了预计算索引功能，以加快 XCorr 的计算。TurboSEQUEST 作为 Crux 软件套件的一部分被开发出来，之后又出现了一个速度更快的实现，称为 Tide。通过算法增强以及更有效地利用有限计算资源，Tide 面向高磁盘使用场景优化，并且可以通过运行多个程序实例，在 CPU 集群上进行并行执行。作为 Crux 软件工具包的一部分，Tide 可供学术和非营利用途免费使用。

X! Tandem

X! Tandem 是 X! 数据库匹配算法套件中的一个开源搜索引擎，并作为 GPM 的一部分发布。它最初由 Robertson Craig 和 Ronald Beavis 合作实现，是一个名为 TANDEM 的免费开源搜索工具（Craig and Beavis 2004）。这与当时大多数流行搜索工具形成对比：后者多为专有软件，进一步改进的空间有限。

TANDEM 的实现目标是优化速度并提高鉴定效果，并设计为可从命令行运行。它会对实验获得的谱图进行预处理，以去除伪峰（噪声），并根据蛋白质序列生成酶特异性的理论谱图；在匹配观测谱图与预测谱图时，还会考虑潜在的翻译后修饰和化学修饰。随后，系统会基于超几何分布计算 hyperscore；该得分为匹配峰强度之和与匹配到的 b 离子和 y 离子数量阶乘的点积。

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另外还引入了两个评分指标——K-score 和 S-score——用于衡量肽段 MS2 谱图与候选序列之间的相似性。与原生 hyperscore 类似，K-score 包含一个预处理步骤，该步骤利用来自噪声峰和未匹配峰的信息，以给出更灵敏的匹配；而 S-score 则将匹配峰的对数强度之和除以序列长度的平方根，并通过期望值（expectation value，e value）评估统计显著性。一旦建立肽段层面的证据，蛋白质层面的推断就会使用 Bayesian model 进行估计；该模型基于某一给定蛋白质所鉴定到的肽段数量及其相应得分。

TANDEM 是最早使用 Biopolymer Markup Language（BIOML；Fenyö 1999）的程序之一。BIOML 是一种 Extensible Markup Language（XML）格式，用于注释蛋白质序列信息，并根据分析仪器的标准报告格式生成输入和输出文件，从而便于整合进 MS 搜索流程。TANDEM 已被整合进 Trans-Proteomic Pipeline（TPP）软件套件；TPP 是较为流行的公共 MS2 分析平台之一。不过，TANDEM 仍由 GPM 作为 X! 工具套件的一部分维护；截至本文写作时，其最新版本为 Alanine（2017.02.01）。

MaxQuant（Andromeda）

Andromeda 是为功能强大的 MaxQuant 软件套件开发的数据库搜索引擎（Cox et al. 2011），其在 PSM 评分中实现了概率评分算法。它能够处理由高碎片质量精度产生的 MS2 谱图，并且可以对复杂的 PTM 模式进行指定、评分和定量，例如多重磷酸化肽段；同时，它仍能在大型序列数据库中保持高效搜索能力。

与多数搜索引擎类似，用户需要指定允许的肽段和蛋白质修饰、用于蛋白质切割的酶，以及待搜索的参考蛋白质序列数据库。随后，系统会利用这些参数生成数据库中所有肽段的列表，并基于肽段质量构建双层索引结构，以实现快速检索。对于给定肽段，系统根据其肽段序列以及固定修饰和可变修饰的配置，在对多种电荷态进行平均和去卷积之后，计算理论碎片离子。

Andromeda 的评分函数基于二项分布概率公式。MS2 谱图被划分为 100 Th（mass-to-charge ratio units，质荷比单位）的质量范围；在考虑肽段长度、漏切位点数量以及潜在修饰存在与否的同时，系统计算实验峰与理论碎片质量在整个谱图范围内匹配数量的概率，并将该概率的对数乘以 10 作为得分。随后，肽段鉴定结果会使用基于 target–decoy 推导的 FDR 所确定的统计阈值进行过滤，并映射到相应的同源蛋白质上。

Andromeda 具有稳健的架构和不受限制的可扩展性。它可以独立运行，也可以作为集成在 MaxQuant 计算平台中的搜索引擎使用；该平台配有图形用户界面，专门面向高分辨率（Orbitrap）MS 数据开发。其功能包括原始数据中的峰检测、定量、肽段评分、蛋白质组报告，以及对定量 label-free 技术（例如 spectral counts）、同位素标记技术（例如 stable isotope labeling of amino acids in cell culture，SILAC）和等重标记技术（例如 tandem mass tag，TMT）的支持。两个工具均可免费获得（见 Internet Resources），并可在 Windows 桌面计算机上运行，从而避免 client–server 设置和网络通信问题。对于单条谱图搜索，Andromeda 也可以通过 web server 访问，并可从命令行运行。为辅助生物学解释，MaxQuant/Andromeda 结果的进一步下游生物学分析可以使用一个独立模块 Perseus 完成。

Ch11 Proteomics and Protein Identification by Mass Spectrometry / PSM on the Web

PSM on the Web

用于 MS2 的 Mascot 提供了一个受限的、可通过 Web 访问的版本，可用于单一样品检索。它与 PMF 检索非常相似，但作了一些修改。在这里，数据以峰列表（peak list）的形式在线提交；这些峰列表由原始数据经过一种称为峰提取（peak picking）的过程转换而来（Figure 11.8a）。每个峰列表由观测到的肽离子质量值组成；在可获得的情况下，也可以选择性地包含相应的强度值。数据也可以 Mascot generic format 或 .mgf 文件的形式提交。当前版本的 Mascot 还支持供应商特异性格式，例如 .dta（SEQUEST）、.asc（Finnigan）、.pkl（Micromass），以及蛋白质组学领域采用的标准格式，例如 .mzML 和 .mzData（见下文）。

Ch11 Proteomics and Protein Identification by Mass Spectrometry / Reporting Standards

Reporting Standards

除常规的检索特异性参数外（见“PMF on the Web”），还可以设置其他附加参数，包括 MS2 或 fragment ion 的误差容限，以及用于标记样品或 label-free 样品的定量方法。用户还可以从所提供的列表中选择所使用的 MS 仪器类型和离子活化方法、肽段碎片的电荷状态，以及是否运行 decoy search 以计算 FDR。检索结束后，系统会生成一份详细的汇总报告，概括推定的肽段和蛋白质鉴定结果（Figure 11.16）。在当前版本中，Mascot 支持 PMF、PST 和 MS2 谱图的标准数据库检索，同时支持 PTM 鉴定，以及使用标记和 label-free 技术进行相对定量。三种检索类型均有免费但受限的在线版本可用（见 Internet Resources）；高通量运行则可通过商业方式获得。

Reporting Standards

任何研究领域的发展和进步，一个关键要素都是协作以及数据的便捷交换。为实现这一点，MS 数据必须遵循共同标准，使不同软件工具和计算平台之间能够互操作；同时也便于将蛋白质组学数据提交到公共数据库中，从而促进数据共享、再利用，并最终产生新的生物医学见解，推动临床转化。为建立 MS 数据标准，Human Proteome Organization（HUPO）于 2002 年成立了 Proteomics Standard Initiative（PSI）（Orchard et al. 2003）。这一工作的目标是基于最低信息指南和受控词汇表，制定群体标准化报告格式；同时通过针对 MS-based proteomics 不同方面的工作组章程，推动用于数据分发的公共资源和工具的发展。

这些标准包括 PSI-MI（Proteomics Standard Initiative – Molecular Interactions），用于分子相互作用报告和交换的数据格式（Chapter 13）；MIAPE-MS（Minimum Information About a Proteomics Experiment – Mass Spectrometry），用于实验数据；MIAPE-MSI（Minimum Information About a Proteomics Experiment – Mass Spectrometry Informatics），用于 MS 数据分析；MIASSPE（Minimum Information About Sample Preparation for a Phosphoproteomics Experiment），用于 phosphoproteomics 等 PTM 相关实验；以及 MIAPE-Quant（Minimum Information About a Proteomics Experiment – Mass Spectrometry Quantification），用于蛋白质组学定量实验。

这些指南定义了 MS 数据发布所需的基本数据元素和元数据，而相应的数据格式则提供了报告待共享信息的模型。后一类格式包括 ad hoc formats，即代表特定群体或开发者需求的专用格式。除 ad hoc formats 外，还有一些事实标准，例如作为 TPP 套件一部分开发的 pepXML 和 protXML。它们并未经过正式标准化流程，但已经被广泛接受。真正意义上的标准，例如 mzML，则通过正式标准化流程定义；该流程在广泛测试和审查之后，规定 XML 格式的结构。

Proteomics XML Formats

目前存在多种蛋白质组学数据格式。遗憾的是，供应商特异性的专有 MS 数据格式不便于数据操作或共享。为克服这些问题，过去十年中出现了若干开放数据格式。当前推荐的最新开放标准蛋白质组学格式是 mzML。mzML 由 HUPO PSI 开发并支持，并建立在早期开放标准 mzData 和 mzXML 的基础之上；这些标准最初被广泛用于存储原始 MS 数据，例如谱图和色谱图。虽然 mzML 是目前可用的最佳标准，但较早的格式，例如 Institute for Systems Biology（ISB, Seattle, Washington）开发的 mzXML，仍被广泛使用。这些标准均以 XML 编写，包含蛋白质组学数据结构的文本表示，强调简洁性和可用性，因此既适合人类阅读，也适合机器读取。

自 PSI 成立以来，还定义了其他数据格式，例如 TraML，用于设计 transition lists，作为 target-directed SRM 实验的输入；mzIdentML，用于肽段和蛋白质鉴定；mzQuantML，用于定量 MS 数据；mzTab，用于蛋白质组学和代谢组学结果；gelML，用于蛋白质分离方法；以及 spML，用于样品处理。这些 PSI 数据格式的定义和可用性，有助于简化 MS 算法和软件平台的开发，进而提高互操作性和数据交换能力。目前许多工具都能够以符合标准的方式实现 PSI 格式，例如 ProteoWizard、PRIDE 和 OpenMS。

Figure 11.16 Mascot search engine

Mascot MS2 数据库检索提交窗口和代表性 peptide spectrum match（PSM）检索结果。

(a) Tandem mass spectrometry（MS/MS）离子检索提交表单，可在其中设置或选择检索特异性参数，例如 enzyme、missed cleavages 数量、organism taxonomy、modifications、quantitation、precursor m/z、MS instrument，以及 ion activation（fragmentation）机制。

(b) 检索结果页面显示按排名排列的蛋白质列表，每个蛋白质均带有 −log10(P) protein score。显著性评分最高的蛋白质被认为是最可能的匹配结果。点击蛋白质名称后，会显示该蛋白质对应的 peptide view。

(c) Peptide view 页面显示一个可滚动面板，用于查看该蛋白质中每个已鉴定肽段的质谱图；同时显示 fragmentation table，列出质谱图中各峰的质量。页面还会显示该蛋白质所鉴定肽段的评分列表。

Figure 11.16 (Continued)

Figure 11.16 (Continued)

Ch11 Proteomics and Protein Identification by Mass Spectrometry / Proteomics Data Repositories

Proteomics Data Repositories

大多数 proteomics（蛋白质组学）项目的终点，是研究论文发表。在 proteomics 发展的早期阶段（直到 2000 年代中期），标准做法是在论文发表时，将最终处理后的数据作为 supplemental information（补充信息）发布。因此，除非向作者索取，否则学术共同体无法访问未经处理的数据或原始实验结果。即便如此，如果数据没有得到妥善归档、无法追溯，也可能带来问题。

到 2000 年代中期，许多期刊开始要求在论文发表的同时，将 proteomics 数据提交到公共数据仓库，这与 DNA sequencing（DNA 测序）领域已经形成的做法类似。随着 MS（mass spectrometry，质谱）数据生成能力持续提升，研究者对原始 proteomics 数据访问的需求成倍增加，由此推动了大量实验数据被强制提交到公共数据仓库。数据开放访问使其他研究人员能够对数据进行再利用和再分析，从而定义 MS-observable proteomes（质谱可观测蛋白质组）或构建 annotated spectral libraries（带注释的谱图库）。

主要的 proteomics 数据仓库包括 PeptideAtlas、PRIDE、GPMdb、Mass Spectrometry Interactive Virtual Environment（MassIVE）、jPOST、iProX、Chorus，以及 PeptideAtlas SRM Experiment Library（PASSEL）。ProteomeXchange（PX）是一个数据仓库联盟，其建立目的是管理公共数据仓库的整合，并促进数据向科学共同体共享。

ProteomeXchange

PX Consortium（Deutsch et al. 2017）的建立，是为了监督 proteomics MS 数据提交指南的标准化。PX 提供了用户友好的数据提交流程和框架，用于协调已有数据库仓库的资源，包括 PRIDE、MassIVE、jPOST、iProX、PASSEL 和 PeptideAtlas。

提交所必需的数据和 metadata（元数据）包括：MS 输出结果（以二进制格式保存的 raw data，或标准 mzML 格式数据）、处理后的鉴定结果，以及描述实验条件的 metadata。其他信息，如 peak lists（峰列表）和 quantification results（定量结果），也可以一并提供。提交完成后，作者可以在论文正式发表前引用分配得到的 PX accession（PX 登录号）。

前五个数据库存储用户提交的数据，因此被视为 primary resource（一级资源）。相比之下，PeptideAtlas 中的数据会通过 TPP pipeline 重新处理，这与 GPMdb 的做法类似，因此构成 secondary resource（二级资源）。除 PeptideAtlas 外，PASSEL 被建立为面向 target-driven SRM data（靶向 SRM 数据）的数据仓库。迄今为止，已有超过 4500 个数据集被提交，覆盖 900 多种生物；Proteome Central 则作为访问门户，提供浏览和高级可视化功能。

PRIDE

Proteomics Identifications database（PRIDE；Vizcaíno et al. 2016）是一个 MS 数据仓库，其中包括实际 spectra（谱图），以及暂定的 peptide 和 protein identifications（肽段和蛋白质鉴定结果）和 PTM site assignments（翻译后修饰位点分配）。支持科学论文的数据可以在同行评审之前或评审过程中提交到 PRIDE，并被分配一个 PX accession number。论文发表后，这些数据会公开发布，并可使用所提供的 accession number 下载。

该数据库可以通过 PX accession、protein accession、PubMed accession 或 metadata 中包含的任意 keywords 进行查询。数据可以使用多种工具以多种格式存储：PRIDE Converter 工具可将上传的 MS spectra 和 identifications 转换为 PRIDE XML 格式；PRIDE Inspector 是一个 XML validator，用于在提交前验证数据格式；PRIDE Archive 网页可用于查询数据库；PRIDE Cluster 可根据相似性对仓库中的 spectra 进行分组，并可使用 peptide sequence 或 consensus spectrum 查询这些 clusters。此外，还可以下载物种特异性的 spectral libraries。

提交过程可以采用 complete submission（完整提交）的形式，即先将处理后的鉴定数据转换为 PRIDE 的 XML 格式。PRIDE 也支持 partial submissions（部分提交），此时需要提供 PSI de facto mzXML 格式，以及标准 mzML 或 mzIdentML；同时还必须包含所用搜索引擎对应的 peak list file。完整提交可确保处理后的数据被整合进 PRIDE，支持将处理结果直接与 mass spectra 连接起来，从而能够使用数据库的可视化工具进行质量评估。

PeptideAtlas

PeptideAtlas（Farrah et al. 2013）最初主要作为真核生物 peptide sequences 注释数据库而开发，但后来扩展为 proteomics 数据存储、交换和整合的框架。PeptideAtlas 会先使用 TPP 对 high-throughput data（高通量数据）进行重新处理，并采用严格的 FDR（false discovery rate，错误发现率）评估，然后再将得到的 peptide annotations 映射到 genomes。不同于 PRIDE 以研究者提交时的形式存储和呈现 peptide 与 protein identifications，PeptideAtlas 会进行统一的重新处理。

数据通过 PeptideAtlas 的提交界面上传后，重新处理后的数据会被组织为属于某个 proteome（或 sub-proteome）的 “builds”。PeptideAtlas 还提供统计验证工具，如 PeptideProphet 和 ProteinProphet，用于控制 false-positive identifications（假阳性鉴定）。现在，PeptideAtlas 已成为一个高度 curated（人工整理）的 protein expression database。近来，PeptideAtlas 也开始作为构建 spectral libraries 和 SRM 相关工具的资源，并且已经成为 PX consortium 的组成部分。

Global Proteome Machine + GPMdb

GPM 的开发目标，是整合快速增长的 proteomics 数据来源并从中提取信息，使其能够在 biomedical research（生物医学研究）中得到更广泛使用（Craig et al. 2004）。为实现这一目标，GPMdb 数据库被建立起来，以便学术共同体能够访问 MS2 data，并使用其流行的开源 X! search tools 套件进行 proteome-wide analysis（蛋白质组范围分析）。该套件包括 X! Tandem 和 X! Hunter。

自建立以来，GPM 已成为著名的 protein expression database，并持续通过获取 proteomics 数据仓库和接收用户提交来提供广泛内容。数据在存储前会被重新处理，以便对 peptide MS2 spectra、暂定 protein identifications 和 PTM mappings 进行严格验证；随后数据会被保存为 ASL XML 文件，并建立索引，存储在 MySQL 数据库中。

GPM 的 X! search engines 套件允许用户对自己的数据运行数据库搜索，同时保留将结果提交到 GPMdb annotated spectrum library 的选项。GPM 还允许用户使用 X! Hunter spectral library search engine 进行 spectral library searches，并通过 proteotypic peptide profiler X! P3 分析数据。

GPMdb 以可搜索界面的形式对数据库中的信息进行分类，包括：pYST，提供 PTMs 列表；SNAP，提供 protein amino acid polymorphisms（蛋白质氨基酸多态性）列表；MRM（Multiple Reaction Monitoring），列出在 MS2 实验中观察到的 peptides；以及 PEPTIDE，提供可下载的物种特异性 peptide sequences。所有 peptides 都会映射到 Ensembl genome database identifiers。

通过 GPM web interface 还可以使用其他方式进行搜索，包括 accession number、peptide sequence、chromosome location、keywords、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）pathways、Gene Ontology（GO）terms、PTMs、protein amino acid polymorphisms、BRaunschweig ENzyme DAtabase（BRENDA）以及 tissue ontology。GPMdb 每日更新；截至 build 5600（June 2019），其数据覆盖约 8.29 亿个 proteins 和 86 亿个 peptides。例如，在 GPMdb 中某一特定 protein 被鉴定到的频率，可以作为一种间接置信度指标，用于衡量该 protein 在 MS2 实验中被鉴定到的可能性。

Ch11 Proteomics and Protein Identification by Mass Spectrometry / Protein/Proteomics Databases

Protein/Proteomics Databases

蛋白质/蛋白质组学数据库

在大多数基于 MS 谱图搜索的蛋白质组学工作流中，另一类主要会访问的公共资源是蛋白质序列数据库。蛋白质组学数据与转录组学数据（第 10 章）或代谢组学数据（第 14 章）非常相似：研究最终会得到很长的蛋白质列表（蛋白质组学）、基因列表（转录组学）或代谢物列表（代谢组学），这些列表都需要进行比较、分析、注释和生物学解释。对于蛋白质组学而言，注释和解释过程需要访问全面的蛋白质序列与注释数据库。这些资源在数据驱动的生物学发现和假设生成中发挥着关键作用。

高通量蛋白质组学研究会产生海量 MS 谱图，这使得研究人员迫切需要经过严格人工审查和整理的数据库，以帮助他们将实验结果与已有知识建立联系。根据实验设计的不同，蛋白质组学策略通常会生成关于蛋白质定位、丰度和 PTMs（post-translational modifications，翻译后修饰）的信息，因此，这些数据库中的功能注释对于确立所鉴定蛋白质的生物学相关性至关重要。例如，通过对功能注释数据库进行 data mining，可以基于某个差异调控蛋白的相互作用伙伴的功能，推断该蛋白的功能，例如它在某条生物学通路中的作用；这些相互作用伙伴可能与该蛋白发生相互作用，或与其共定位。除 National Center for Biotechnology Information（NCBI）的 RefSeq（第 1 章）、Ensembl（第 4 章）和 Protein Data Bank（PDB；第 12 章）等知名数据库外，下面还将讨论若干与蛋白质组注释和推断相关的其他数据库。

UniProt

UniProt Consortium 是一个权威且全面的数据存储库，用于保存蛋白质序列的功能信息（第 1 章）。UniProt 是进行 MS 谱图搜索时所需蛋白质序列的首选数据库，因为它收录了研究充分的模式生物以及其他已完成全基因组测序的参考物种的蛋白质组层级蛋白质序列。UniProt 还包含 UniRef（参考序列聚类数据库）和 UniParc（序列归档库）。总体而言，UniProt 是一个信息丰富的资源，包含经过严谨推导的注释、分类学信息，以及定性的功能信息，例如蛋白质亚细胞定位、PTMs、通路和疾病关联，并链接到可用的相关交叉引用和大量文献引用。

UniProt 可用于查找目标蛋白的人工审定信息。例如，可以查询一个蛋白质的结构域组成、生物学功能、亚细胞定位、已知 PTMs、在某条生物学通路中的作用，或其根据同行评议论文所显示出的疾病相关性。UniProt 还可用于比较蛋白质序列，以确定相似的（同源的）蛋白质，并查看与这些蛋白相关的功能信息。

Ch11 Proteomics and Protein Identification by Mass Spectrometry / Selected Applications of Proteomics

PTM 数据库

鉴于 PTM 在调控细胞过程中发挥着重要作用，并且研究界需要对 PTM 进行全面描述，dbPTM 数据库于 2006 年发布（Huang et al. 2019）。dbPTM 收录了从公共数据库中汇集的所有经实验验证的 PTM，以及 UniProt 数据库中的推定 PTM；它还提供了一个基于 Web 的门户，用于对这些信息进行整合访问，并提供 PTM 分析工具。经实验验证的子集已被证明是评估各种 PTM 预测工具预测能力的优秀基准。截至本文撰写时，该子集还已映射到所有相应的 PDB 条目，以定义 347 984 个推定修饰位点。dbPTM 还整合了与 PTM 网络相关的代谢通路信息和 protein–protein interactions（蛋白质—蛋白质相互作用）信息。当前版本的 dbPTM 包含 908 917 个非冗余、经实验验证的 PTM 实例，代表 34 种以上修饰类型，其中包括 571 032 个 phosphorylation sites（磷酸化位点）。

另一个高度人工整理的实验性哺乳动物 PTM 数据库是 PhosphositePlus（PSP）。PSP 于 2003 年推出，目前收录了 400 000 多个非冗余修饰位点，这些位点关联到 20 268 个蛋白质组和 240 万条肽段，覆盖从 21 000 多篇文献中获得的 14 种不同修饰类型。尽管 PSP 纳入了来自低通量研究的数据，但超过 95% 的 PTM 来自高通量数据，因此所获得的数据会使用统一的分析标准重新分析，只保留具有高概率的位点指派结果（p ≤0.05）。PSP 还包含关于推定修饰位点的结构拓扑和功能信息，并提供工具，用于从疾病、组织表达和结构域等蛋白质功能方面对 PTM 进行功能分析。

由于 PTM 在细胞信号传导和细胞过程调控中具有关键作用，蛋白质组学研究所鉴定出的 PTM 需要得到恰当解释，才能深入理解它们在疾病致因中可能发挥作用的重要性。因此，dbPTM 和 PSP 这类数据库为研究人员提供了宝贵资源，研究者可以利用它们对自己的发现进行基准比较。

Selected Applications of Proteomics

蛋白质组学的总体目标是研究 proteome（蛋白质组）的性质，并确定其在细胞周期、信号传导、细胞分裂或疾病等不同生理状态响应中反映出的变化。这些研究可大体归类为 differential proteomics（差异蛋白质组学）、functional proteomics（功能蛋白质组学）和 structural proteomics（结构蛋白质组学）策略（Figure 11.17）。

Differential Proteomics

Differential proteomics（差异蛋白质组学），或称 proteome-scale expression profiling（蛋白质组尺度表达谱分析），研究两种生理状态之间蛋白质表达模式的差异，例如正常状态与癌症状态之间的差异。在生物医学研究中，通常采用比较方法来鉴定在特定情境或特定疾病中显著上调或下调的蛋白质，用于研究细胞响应，作为 diagnostic biomarkers（诊断性生物标志物）或潜在 drug targets（药物靶点），并在分子水平上理解生物过程的机制基础。

差异蛋白质组学技术的实例包括：鉴定在影响糖尿病的代谢通路中控制葡萄糖响应性的一些重要调控系统的研究（Schuit et al. 2002）；发现 Alzheimer disease（阿尔茨海默病）中产生异常调控蛋白的基因（Butterfield et al. 2003）；以及鉴定参与进行性扩张型心肌病和心力衰竭的蛋白质（Gramolini et al. 2008）。

Functional Proteomics

Functional proteomics（功能蛋白质组学）是一个涵盖范围很广的术语，涉及许多不同研究领域，包括在变化条件下进行 protein identification（蛋白质鉴定）、abundance（丰度）和 turnover（周转）测量，以及 PTM mapping（PTM 作图）、protein localization（蛋白质定位）、interaction mapping（相互作用作图）和 functional inference（功能推断）等。

Figure 11.17 Proteomics. 蛋白质组学的广义分类，以及目前常见且正在开展的蛋白质组学研究的生物学应用。3D，three-dimensional（三维）。

例如，multi-protein complexes（多蛋白复合物）已知在细胞分子机器中发挥主要功能作用，因此，系统表征 protein–protein interactions 及其动态组装形成 macromolecular assemblies（大分子组装体）的过程，对于理解它们在驱动细胞信号网络和代谢通路中的作用至关重要。值得注意的是，如果一个未表征的多蛋白复合物亚基与具有已知功能注释的组分发生物理关联，则可以利用 “guilt-by-association”（关联归罪）或 “guilt-by-correlation”（相关归罪）原则推断其功能（Gavin et al. 2002; Krogan et al. 2006）。

PTM 在功能蛋白质组学中发挥着尤其重要的作用，因为它们会影响物理相互作用，从而决定蛋白质活性，例如依赖 PTM 的蛋白质和核酸结合；同时，PTM 还通过细胞内信号级联传递细胞外信号，或通过 protein phosphorylation/de-phosphorylation（蛋白质磷酸化/去磷酸化）事件驱动关键细胞过程，这些事件可触发细胞分裂、分化、凋亡，或代谢/合成代谢状态。

Structural Proteomics

以确定蛋白质在细胞中的位置和关联关系，以及它们在大分子复合物中的三维形状或结构为目标的蛋白质组学研究，称为 structural proteomics（结构蛋白质组学）。结构分析可以通过提供关于目标蛋白生化作用的线索来支持功能表征，这些线索来自关于生物活性和病理生理学意义的互补信息。传统蛋白质生物化学方法通常局限于单个蛋白质或蛋白质类别，但它们可以与无偏的 mass spectrometric techniques（质谱技术）结合，用于在不断扩大的尺度上研究蛋白质组装体的各种结构方面（Sinz 2014）。

Drug target identification（药物靶点鉴定）是结构蛋白质组学的另一项应用。在这一应用中，MS 用于鉴定胆活性小分子配体与其细胞蛋白质靶标之间的相互作用，并定义潜在的 drug binding site(s)（药物结合位点）以及 protein–ligand complex（蛋白质—配体复合物）的三维模型；这是更好地界定化合物 action mode（作用模式）和 structure–activity relationships（构效关系）的关键步骤，也有助于 “rational drug design”（理性药物设计）和药物发现过程（Djuric et al. 2016）。

Ch11 Proteomics and Protein Identification by Mass Spectrometry / Summary + Acknowledgments + Internet Resources + Further Reading + References

Summary

与生物信息学的其他领域类似，蛋白质组学分析也使用复杂的数据分析流程和算法。为了获得最佳结果，必须仔细考虑所提交数据的质量以及所选择的参数。不存在一种在所有情形下都能完美工作的“one-size-fits-all”解决方案，多数软件工具都是针对特定任务而设计的。MS 数据的来源和质量同样至关重要，这也凸显出在开始任何分析之前，必须充分理解所研究的生物学问题。根据所使用的 MS 仪器类型、所生成数据的质量和类型，以及正在进行的实验表征类型，在实现最佳性能之前，需要仔细设定关键的数据库搜索工具参数（见 Table 11.2）。

Table 11.2 使用序列数据库搜索引擎时的标准搜索参数。

CID，collision-induced dissociation，碰撞诱导解离。

在所有蛋白质组学实验与分析中，需要考虑的重要因素包括：

• MS 仪器的正确校准（例如使用已知标准品）；
• 理解仪器预期的质量分辨率和质量准确度；
• 根据蛋白质酶解所使用的 protease，指定适当的蛋白水解切割规则；
• 记录 MS 数据采集（仪器）设置，例如：
• 所使用的电离和碎裂方法，以及每个 spectrum 中识别到的离子系列；
• precursor 和 fragment ion 的质量、扫描范围以及匹配容差；
• 稳定同位素或多重电荷态的存在；
• 定义可变或预定义的翻译后修饰（post-translational modifications，例如 phosphorylation）或化学修饰（例如 acetylation）；
• 污染物种的存在，例如 trypsin 自溶产物、keratin 以及其他实验伪影；
• 为搜索选择参考蛋白序列数据库；
• 处理并测量每个 spectrum 的 signal-to-noise ratio。

充分理解这些参数如何影响搜索范围，并最终影响结果质量，是至关重要的。

一般而言，有两种方法可以确保结果质量。第一种方法是选择最佳参数设置，这可以通过系统性地改变搜索参数，直至获得令人满意的结果来实现。例如，将初始 MS 扫描范围从 375–1500 m/z 增加到 400–1800 m/z，可以改善 peptide coverage 和 signal to noise；通过纳入来自亲缘关系接近但注释更完善物种的 orthologs 来扩大搜索空间，也可以提供信息量更高的结果。另一种确保高质量搜索结果的策略，是整合多个程序的结果，以在最大化覆盖度的同时尽量减少 false positives。由于不同搜索引擎采用不同的评分方案，并会考虑输入数据的不同特征，一个算法可能检测到另一个算法遗漏的特征（Kwon et al. 2011）。

总体而言，决定 LC-MS/MS 研究中生物信息学分析成功与否的两个主要因素是：了解数据本身的性质，并牢记 protein identification 只是任何蛋白质组学分析工作流程中的第一步。我们相信，本章在这些方面提供了一些有益的指导。

Acknowledgments

作者感谢 Emili Lab（University of Toronto, Toronto, Canada；Boston University, Boston, MA, USA）成员提出的建设性意见，以及他们在汇编支持信息方面提供的帮助。我们还感谢 Carl White 和 Ruth Isserlin（University of Toronto），以及 Indranil Paul 和 Benjamin Blum（Boston University）分享他们的专业知识、睿智建议和关键见解，这些都极大地改进了本章内容。

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Nature Milestones in Mass Spectrometry（www.nature.com/milestones/milemassspec）是由 Nature Publishing Group 旗下五种期刊共同参与的一项协作成果。每篇 milestone article 均由 Nature Publishing Group 的编辑撰写，聚焦于 mass spectrometry 中一项关键技术发展，并围绕一个突破性进展展开。每篇文章都会重点介绍促成该进展的主要论文，以及由这些进展衍生出的应用。

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Ch12 Protein Structure Prediction and Analysis / Introduction to Protein Structures

Introduction to Protein Structures

蛋白质结构导论

在前几章中，我们已经看到，蛋白质可以很方便地表示和分析为字符字符串（序列）。事实上，今天我们所说的 bioinformatics（生物信息学）中，很大一部分都是基于使用计算机来操作、存储和比较序列或字符字符串。然而，需要记住的是，生物信息学领域并不只包括序列分析；今天生物信息学中许多最有趣、最令人兴奋的应用，实际上关注的是结构分析——有时也称为 structural bioinformatics（结构生物信息学）。事实上，生物信息学的起源实际上可以追溯到 structural biology（结构生物学）领域，因为许多最早的生物信息学程序以及最早的生物信息学数据库，都是为了存储、比较和分析蛋白质结构而开发的（Bernstein et al. 1977; Hagen 2000）。有趣的是，序列分析中使用的许多概念，例如归档（archiving）、比对（aligning）和可视化（visualizing），在结构分析中也有密切对应的概念。不过，由于蛋白质结构本身具有内在复杂性，对其进行分析还面临额外层面的挑战。

蛋白质也许是自然界中最复杂的化学实体。无论是大分子还是小分子，没有任何其他类型的分子能够表现出蛋白质所具有的形状、大小、表面特征和运动性的多样性。蛋白质本身如此复杂，以至于科学家们投入了大量努力，发展高效方法来测定其结构、可视化其形状、测量其运动、简化其描述、比较其折叠方式，并寻找潜在的结构共性。事实上，表征蛋白质结构这一挑战被认为非常重要；自 1960 年以来，已有十余项 Nobel Prize（诺贝尔奖）授予那些测定蛋白质结构或发展蛋白质结构表征方法的科学家。

本章旨在概述用于分析、归档、可视化、预测和评估蛋白质结构的生物信息学工具与数据库。本章分为八个部分：首先简要介绍蛋白质结构；随后简要回顾蛋白质结构是如何被测定的；接着总结蛋白质结构如何被描述；然后介绍主要的蛋白质结构数据库；再概述若干结构可视化工具；随后介绍用于结构预测的生物信息学工具；接着总结蛋白质可以如何被评估；最后说明蛋白质如何被分类和比较。

Ch12 Protein Structure Prediction and Analysis / How Protein Structures are Determined

How Protein Structures are Determined

蛋白质结构是如何测定的

Figure 12.1 提供了一个流程图，说明蛋白质结构如何被测定或“解析”（solved）。从该图可以看出，目前有三种实验技术可用于获得蛋白质原子分辨率（atomic resolution）水平的详细结构信息：X-ray crystallography、nuclear magnetic resonance（NMR）spectroscopy 和 electron microscopy。

Bioinformatics, Fourth Edition. Edited by Andreas D. Baxevanis, Gary D. Bader, and David S. Wishart.

© 2020 John Wiley & Sons, Inc. Published 2020 by John Wiley & Sons, Inc.

Companion Website: www.wiley.com/go/baxevanis/Bioinformatics_4e

Figure 12.1

用于实验制备并解析（即测定）蛋白质三维（3D）结构的步骤流程图，所采用的实验技术包括 X-ray、nuclear magnetic resonance（NMR）和 cryogenic electron microscopy（cryo-EM）。

流程包括：

• 克隆并纯化蛋白质
• 测试结晶条件
• 制备衍生物
• X-ray
• NMR
• Cryo-EM
• 测试 NMR 溶液条件
• 将样品冻结于玻璃态冰中
• 解析相位
• 拟合电子密度
• 生成结构
• 测量 H–H 距离
• 生成结构集合
• 可视化结构
• 分析结构
• 进行单颗粒分析
• 3D 重构
• 收集 X-ray 衍射数据
• 收集 2D 和 3D NMR 数据
• 收集多个颗粒的 EM 数据

所有蛋白质结构都必须从高度纯化的蛋白质出发进行测定；这些蛋白质随后可能被结晶（用于 X-ray crystallography）、置于特殊溶剂中（用于 NMR spectroscopy），或被冻结（用于 electron microscopy）。X-ray crystallography 是最早出现的方法，也是最精确的方法；NMR 出现时间稍晚，也是精确度最低的方法；electron microscopy 则是最新的方法。

在 X-ray crystallography 中，小型蛋白质晶体（尺寸小于 1 mm）会暴露在强 X-ray 束下。X-ray 的波长约等于一个原子的大小（1–2 Å，即 ångstrom，1 Å = 1 × 10−10 m），会被晶体中的蛋白质原子散射或衍射。由此产生的衍射图样通常表现为数以万计的微小斑点，这些斑点排列成复杂的圆形图案。衍射图样会记录在数字 X-ray 相机上。

衍射斑点的位置及其强度（以及一些相位信息）实际上已经足以让计算机计算出该衍射蛋白中所有重原子——碳、氮、氧、硫——的电子密度图。根据这张电子密度图，晶体学家利用已知的蛋白质序列确定所有原子的 x、y、z 坐标。需要注意的是，在 X-ray crystallography 中，尽管衍射图样来自晶体中数以万亿计的蛋白质分子，最终得到的却只是一个“平均”蛋白质分子的结构。

蛋白质晶体学在实验上具有挑战性，在计算上也很复杂，因此这里的简要概述远不能充分体现其全部内涵。关于蛋白质晶体学的优秀综述可见若干高质量教材（McCree 1999; Drenth 2006）。第一个蛋白质的 X-ray 结构（myoglobin）是在 20 世纪 50 年代末测定的（Kendrew et al. 1958）；自那时以来，已有超过 120 000 个蛋白质结构通过 X-ray 技术测定。

X-ray crystallography 可用于测定非常大的大分子结构（数百 kilodaltons，甚至包括 ribosomes 和 viruses），既包括细胞质蛋白，也包括膜结合蛋白。近年来，计算方法、机器人技术和仪器设备的进步（包括强大 synchrotrons 的使用）进一步增强了 X-ray crystallography 的能力，并大大加快了结构测定过程。在 20 世纪 70 年代，纯化、结晶并解析一个蛋白质结构通常需要 6–7 年；而现在，在少数情况下，这一过程最快可缩短至 6–7 天。因此，所有蛋白质结构中超过 90% 是通过 X-ray crystallography 测定的。

然而，X-ray crystallography 并非绝对可靠。正如其名称所示，crystallography 要求在一种“人工”的固态（晶体）环境中研究蛋白质，而这种环境并不类似于细胞或机体中正常的生理性（水相）环境。因此，由 X-ray crystallography 生成的结构常常会受到晶体堆积（crystal packing）和溶剂排除效应（solvent exclusion effects）的影响。同样，并非蛋白质的所有部分都能在 X-ray 结构中被观察到，尤其是高度可动的区域。因此，这些“模糊”区域可能存在解释空间，也可能被误解释。

还需要记住的是，蛋白质的 X-ray 结构通常是欠定的，特别是与小分子的 X-ray 结构相比更是如此。对于“好”的蛋白质结构，R factor（用于衡量计算结构与实验数据之间一致性的指标）通常为 0.25；而对于小分子，其 R factor 通常为 0.05。考虑到理论上最高的 R factor 为 0.59（对应完全错误的结构），可以得出这样的结论：即使是好的蛋白质结构也并非没有缺陷。实际上，许多蛋白质结构在原子位置上存在一些错误、模糊性或不准确性（±0.5 Å）并不罕见。同样，一个蛋白质结构缺失少数原子或残基也并不罕见。

与 X-ray crystallography 相比，NMR spectroscopy 是一种新得多的技术（第一个蛋白质结构于 1983 年被“解析”），并且在某种程度上也更加复杂。因此，对该技术的详细解释超出了本章范围。Cavanagh et al.（2006）撰写的教材中有关于蛋白质 NMR 的优秀概述。NMR 的独特之处在于，它允许研究液态或接近生理环境中的分子结构与动力学。

在 NMR spectroscopy 中，蛋白质结构的测定并不是通过测量 X-ray 如何被原子衍射，而是通过测量无线电波如何被原子核吸收，例如氢（1H）、同位素标记的碳（13C）或氮（15N）。这种吸收测量使研究者能够确定核磁性从一个原子（或原子核）转移到另一个原子（或原子核）的程度。在 NMR 中，这种磁化转移通过 chemical shifts、J-couplings 和 nuclear Overhauser effects（NOEs）进行测量。这些参数在单个氢原子上最容易观察到，并且必须通过复杂的多维 NMR 实验为尽可能多的蛋白质原子测定出来；这些实验通常带有一些颇具趣味性的缩写名称，例如 COSY、TOCSY、NOESY 和 HMQC。

一旦测得这些参数，它们便定义了一组近似的结构约束，可输入基于计算机的约束最小化计算中，例如 distance geometry 或 simulated annealing。其结果是一系列（15–50 个）相似的蛋白质结构，这些结构均满足实验约束。因此，与 X-ray 方法只产生一个结构不同，NMR 方法会生成多个结构；这些结构相互叠加或重合，形成所谓的“blurrograms”（Figure 12.2）。

Figure 12.2

Escherichia coli thioredoxin 结构集合的 nuclear magnetic resonance（NMR）“blurrogram”示例（Protein Data Bank database identifier: 4TRX）。该图表示 E. coli thioredoxin 的 33 个近乎相同的结构的叠合，这些结构满足全部（或几乎全部）已测得的 NMR 约束。

NMR 结构测定工作的质量通常由这些叠合结构彼此匹配的紧密程度来表示，其中 root mean square deviation（RMSD）值 <1 Å 通常提示结构质量较好，而 RMSD 值 >2 Å 则通常见于测定质量较差的结构（Box 12.1）。有趣的是，这些 blurrogram 结构可能更能反映蛋白质在溶液中的真实行为，因为大多数蛋白质似乎都以一组略有差异的构象集合形式存在。

Box 12.1 The Meaning of RMSD

Box 12.1 RMSD 的含义

蛋白质序列比对通常用 expect（E）value、bit score 或 percent identity 进行评价。对于结构比较或结构比对，常使用一种称为 root mean square deviation（RMSD）的指标进行评分；有趣的是，RMSD 实际上是 standard deviation 的一个古老术语。换句话说，RMSD 的计算方式与标准差相同。

当两个结构叠合之后，首先计算 Cα 原子之间距离差值（单位为 ångstroms，即 Å）的平方和，再除以所比较的原子数。该数值的平方根称为 RMSD，通常以 ångstroms 为单位报告。当叠合的结构超过两个时，例如 NMR 结构集合，通常先计算该集合的一个假想平均结构，然后再计算相对于这一平均结构的距离差值之和。

NMR spectroscopists、structure modelers 和 X-ray crystallographers 在比较结构集合、考察相关结构或表征结构家族时，经常使用 RMSD 值。Table 12.1 给出了一个粗略指南，用于说明某一 RMSD 值对于 NMR 结构质量意味着什么。表格第二列则给出了类似的定性指南，用于说明 RMSD 值在结构相似性方面的含义。

Table 12.1

backbone root mean square deviation（RMSD，单位为 ångstroms）与 nuclear magnetic resonance（NMR）结构集合的结构质量（第 1 列）以及蛋白质结构比较（第 2 列）之间的关系。

由于不需要晶体这一实验条件，NMR 样品制备本质上比 X-ray 样品制备更容易。此外，由于 NMR 是基于液体的系统，NMR 结构更可能类似于细胞或机体正常生理性（液态）环境中的结构。然而，NMR 常受到被研究分子大小的限制（实际可行的上限约为 40 kDa）、分子溶解性的限制（膜蛋白无法研究），以及对特殊同位素标记分子的需求限制（成本较高）。此外，NMR 结构在本质上不如 X-ray 结构精确。

持续的计算和仪器改进已经使 NMR 比以往更容易、更快速。事实上，现在可以在数周内测定一个蛋白质的 NMR 结构。已知蛋白质结构中约 10% 是通过 NMR 测定的。

结构生物学家工具箱中最新加入的方法是 cryogenic electron microscopy（cryo-EM，或 three-dimensional [3D] cryo-EM）。与 NMR spectroscopy 或 X-ray 相比，cryo-EM 是近年来才加入结构测定领域的重要技术。