Molecular Evolution and Phylogenetic Analysis

第9章 分子进化与系统发育分析

9.1 引言（Introduction）

> “离开进化之光，生物学中的一切都将失去意义。”

>

> ——Theodosius Dobzhansky

宇宙已经存在了很长时间。根据计算，它的年龄超过 130 亿年（Planck Collaboration 2015）。太阳系被认为大约有 46 亿年历史（Bouvier and Wadhwa 2010），地球则在稍晚一点的时间形成，约为 45 亿年前（Wilde et al. 2001）。长期以来，地球上最早的生命证据被认为是西澳大利亚发现的 fossilized microbial mats（化石化微生物席），即 stromatolites（叠层石），其年代可追溯到 34 亿年前（Wacey et al. 2011）。不过，来自加拿大 hydrothermal vent precipitates（热液喷口沉淀物）中 biogenic carbon（生物成因碳）的新证据，把生命起源的时间进一步推到距今约 41 亿年前（Dodd et al. 2017）。对于生物而言，这是一段极其漫长的时间：它们在其中生存、繁殖、相互作用、争夺资源，并且不可避免地死亡。在这段时间里，地球经历了大量气候、大气和地质变化，改变了地球的化学组成和温度（Allegre and Schneider 2005）。

由于细胞生命在 metabolism（代谢）、physiology（生理）和 architecture（结构组织）上具有相似性，人们知道地球上所有生命都共享一个共同祖先，即 last universal common ancestor（LUCA，最后 universal common ancestor），时间早于 38 亿年前（Doolittle 2000; Weiss et al. 2016）。Charles Darwin 在《On the Origin of Species》（1859）中提出的 natural selection（自然选择）进化理论认为，evolution（进化）是生物种群中可遗传特征在连续世代中的变化，并且“所有生物都由共同祖先经分支过程而来”（Darwin 1859）。Darwin 的奠基性著作首次描述了这种进化变化机制，也支持了进化过程产生 biodiversity（生物多样性）的理论。地球生物多样性的早期估计范围很宽，从 300 万到 1 亿个物种不等；而较新的数字提示，现存物种可能接近一万亿种，其中真正被命名的只有 190 万种，收录于数据库的只有 160 万种（Mora et al. 2011; Ruggiero et al. 2015; Locey and Lennon 2016）。

Systematics（系统学）研究生物之间的相互关系。如何命名所有这些物种，并把它们归入更高阶的类群，是一门称为 taxonomy（分类学）的科学分支。过去曾使用过许多不同方式来归类生物，后文会继续讨论。本章的重点是 phylogenetics（系统发育学）：它是系统学中专门研究生物、若干生物群体（例如物种或种群），甚至生物体内基因和蛋白质之间 evolutionary relationships（进化关系）的领域。所谓物种、基因或蛋白质等实体之间的“phylogenetic relationship（系统发育关系）”，是指这些实体在过去某个时间点如何共享共同祖先。系统发育分析总是使研究者能够推断关系。

现在的系统发育分析通常使用 cladistics（分支分类学），这是一种针对生物、基因或蛋白质之间关系提出假设的方法。这类分析基于 branching patterns（分支模式）：这些模式用类似人类家谱的树状表示来呈现，并依据 traits 或 characters（性状或字符）的相似性构建。传统上，这类分析使用的 characters 是生物的 morphological features（形态特征）；但随着 genomics（基因组学）的兴起，以及来自多种生物的大量 whole genome sequencing（WGS，全基因组测序）数据可用，这一领域已经转向以基因或蛋白质序列作为分析基础。在这种语境下，每一个核苷酸或氨基酸残基都非常字面意义地成为一个“character”。

基因传统上被视为可遗传单位，会随着时间积累突变。具有共同进化历史的生物，会共享某些突变；这些突变可以通过不同算法和软件进行追踪与比较。因此，cladistics 的三个核心原则可以概括如下：

• 任何一组生物、基因或蛋白质，都通过共同祖先的传承而相关联。
• cladogenesis（clade formation，支系形成）呈现 bifurcating pattern（二分分支模式）。
• 特征变化会随着时间在 lineage（谱系）中发生。

除了基础生物学研究，理解基因、蛋白质和物种彼此之间如何相关，也有许多实际应用，例如 bioprospecting（生物勘探）、控制疾病暴发、法医学、药物治疗的选择与监测、生态退化追踪、食品与农业研究，以及更多其他场景。为此，本章将回顾早期分类方案，以及把分子序列作为 molecular clocks（分子钟）的用法；解释系统发育学的基础，以及如何解释系统发育树（包括必要的警示）；描述常见系统发育方法和软件之间的差异及其适当用法；并提供系统发育分析在真实世界中的应用示例。

Early Classification Schemes｜早期分类方案

纵观历史，早期用于命名和组织 taxa（分类单元）的分类方案，传统上主要建立在一系列生理、生物形态以及生物化学特征之上。

希腊哲学家 Aristotle（亚里士多德，384–322 BC）提出了两个关键概念：按生物类型进行分类，以及 binomial nomenclature（二名命名法）（Archibald 2014）。Aristotle 会根据生物之间的相似性来分组，例如“有血动物”和“无血动物”，然后再把这些组组织成层级结构。然而，Aristotle 的“ladder of nature（自然阶梯，scala naturae）”或其分类系统，并不是建立在共同进化历史之上的；阶梯上的不同物种彼此之间也不存在明确的遗传关系（Archibald 2014）。Aristotle 的 binomial definition scheme（二名定义方案）会为每种动物或植物赋予一个名称，这个名称由“genus and difference（属加区别特征）”构成，用以按照独特特征区分家族内部的不同亚群。

不过，正式的 binomial nomenclature（二名命名法）直到两千年后才被系统性采用，其标志是著名瑞典医师兼植物学家 Carolus Linnaeus（1707–1778）出版《Systema Naturae》（1735）。Linnaeus 常被视为 taxonomy（分类学）之父（Linnaeus 1735）。到二十世纪后期，Robert Whittaker 提出的 five-kingdom classification system（五界分类系统）已经成为生物学教材中的标准内容。该系统主要依据代谢差异进行划分（Whittaker 1969），将生物分为 Protista（原生生物界，单细胞真核生物）、Animalia（动物界）、Plantae（植物界）、Fungi（真菌界）和 Monera（原核生物界，单细胞原核生物，包括绝大多数细菌）。在这一阶段之前，分类方案大多仍依赖形态特征或代谢特征，或者依赖某位科学家主观赋予较大权重的 character（性状）；而不是去考察不同生物共享了多少总体特征。

一种更客观的生物分类方法，是依据共同祖先所导致的 shared derived characteristics（共享衍生特征）来对生物进行归类，这就是 cladistics（支序分类学）所提供的路径。在 cladistics 中，共享较多 derived characters（衍生性状）的 taxa，会被归为彼此关系更近的一组；而共享较少者则距离更远。这样一来，这些特征集合（即 characters，性状）就可以被科学家用来推断 phylogenetic（系统发育）或 evolutionary（进化）关系。

德国昆虫学家 Willi Hennig 在第二次世界大战期间身为战俘时，起草了 cladistics 的奠基性著作《Basic Outline of a Theory of Phylogenetic Systematics》（1950）（Schmitt 2003）。Hennig 说明，推断出的关系应当以一种分支式层级树状结构来表示，这种图称为 cladogram（支序图）。构建 cladogram 时，应尽量使一个 character state（性状状态）到下一个 character state（即下一个 branch 或 clade）之间所需的变化次数最少。cladistics 的这些原则，构成了现代 phylogenetic analysis（系统发育分析）的基础。

Sequences As Molecular Clocks｜作为分子钟的序列

基因以及调控区域中的 nucleic acid sequences（核酸序列）会随着时间推移，通过多种机制积累不同类型的 mutation（突变）。这些突变包括 DNA 复制过程中产生的 missense（错义）、nonsense（无义）或 frameshift（移码）错误；DNA 片段的 insertion（插入）和 deletion（缺失）；重复序列的扩增；甚至还包括基因乃至整条染色体的 duplication（重复）（Griffiths et al. 2000）。遗传序列的化学性质会影响其结构，也会影响它们与其他分子相互作用的能力。遗传物质中的突变可以影响细胞功能；同时，遗传变化的下游后果也会影响蛋白质的结构、理化性质和催化能力（Griffiths et al. 2000）。

蛋白质序列和结构与功能紧密相连。由于蛋白质是细胞的“工作主力”，其 primary sequence（一级序列）的变化可能改变细胞表型，甚至改变整个生物体的表型。分子序列中的某些区域对功能至关重要。如果生物在这些区域积累突变，往往会导致有害的功能扰动，从而降低 fitness（适合度）。因此，selection pressure（选择压力）会倾向于保守这些区域；相比之下，其他不那么关键的区域则更能容忍变化。不同分子序列位置的变化速率并不相同；不同基因和蛋白质类型之间、不同物种之间，以及不同环境条件下，变化速率也会不同。一般来说，生物之间的序列差异越多，它们独立积累突变的时间就可能越长；因此，它们之间的进化关系也通常越远。

20 世纪 60 年代和 70 年代，蛋白质与核酸测序技术的发展，极大推进了科学家认识和研究生物的方式。1965 年，Emile Zuckerkandl 和 Linus Pauling 借一篇受邀撰写、但未经过同行评议的手稿之机，试图就使用分子序列推断进化历史中的变化速率“说一些惊人之语”。这个想法后来被称为 molecular clock hypothesis（分子钟假说）（Zuckerkandl and Pauling 1965）。molecular clock（分子钟）的概念，是利用生物分子的突变速率来推断两个或多个生命形式、基因或蛋白质发生分化的时间点。Zuckerkandl 和 Pauling 利用古生物学信息，对人和马的血红蛋白链中的氨基酸变化速率进行校准，从而推断许多动物物种的 last common ancestor（最近共同祖先）。尽管该研究假设一个序列中所有位置的变化速率都是均一的——而现实中这种情况很少成立——但“molecules as documents of evolutionary history（作为进化历史文献的分子）”这一观点，打开了用 DNA 与蛋白质序列追踪进化事件的大门（Zuckerkandl and Pauling 1965）。

这一概念对 microbiology（微生物学）产生了深远影响。传统上，微生物分类常常基于表型性状，而这些性状往往带有主观性。相比之下，序列比较可以提供更客观、可量化的指标。事实上，1977 年 Carl Woese 使用 16S ribosomal RNA（16S rRNA，16S 核糖体 RNA）序列比较，构建了现代意义上的 Tree of Life（生命之树），进一步革新了微生物学领域。Tree of Life 将生物划分为三个 domain（域）：Eukarya（真核生物，也称 eukaryotes）、Bacteria（细菌；Woese 最初称其为 eubacteria）以及 Archaea（古菌；最初称为 archaebacteria）（Woese and Fox 1977; Woese et al. 1990）。16S rRNA 基因（在 Eukarya 中对应 18S）看起来是一种理想的分子钟，因为它不受 coding sequence（编码序列）的约束或偏倚影响，并且序列中的不同部分会以不同速度发生突变（Woese and Fox 1977）。变化较快的区域可用于分类亲缘关系较近的生物，而进化较慢的区域则可用于识别亲缘关系较远的生物。

Woese 使用 16S rRNA 基因构建 Tree of Life 的思路，后来被扩展到多种其他单基因和蛋白质，用于构建 phylogenetic trees（系统发育树）。其中还包括利用某个基因内部、发生在三大生命域形成之前的 duplication（重复）事件，来为 Tree of Life 定根（Lawson et al. 1996）。由于 selection pressure、环境影响、复制机制准确性差异以及其他因素不同，由这些不同序列构建出的树，其 topology（拓扑结构）并不总是一致；这反映了不同生物中的基因序列会随着时间积累各自的变化。换言之，一个生物体的进化历史，很少能完全由单个基因的进化历史来代表。

这一认识促成了 concatenated gene and protein sequence datasets（串联的基因与蛋白质序列数据集）的使用。所谓串联数据集，是指把一系列不同序列首尾相接地连接起来；这种方法通过在多个基因历史之间获得共识，增强 phylogenetic signal（系统发育信号）的解析度（Gadagkar et al. 2005）。随着 genome sequencing（基因组测序）的化学方法和技术不断改进，WGS（whole-genome sequencing，全基因组测序）已经成为理解 biodiversity（生物多样性）的有力工具。如今，成千上万个基因的序列都可以被解析，并用于系统发育分析以及许多其他应用。

9 分子进化与系统发育分析

背景术语与基础概念

如前所述，系统发育分析（phylogenetic analysis）是推断或估计进化关系的方法。所有系统发育分析都基于特征（characters）或性状（traits）的分析。对于形态学数据，特征可以是毛发是否存在或骨骼的某种特定形状。分子系统发育学（Molecular phylogenetics）是通过比较序列中的核苷酸或氨基酸来研究进化关系的学科。在序列数据分析中，比对中的每一列都被视为一个特征或性状，列中的每个氨基酸残基或 DNA 碱基代表该特征的特定状态。

最终的关系通常以各种类型的层级树（hierarchical trees）表示。树的绘制方式可以有多种，但都包含相同的基本元素：由分支（branches）连接节点（nodes）和叶子（leaves），将祖先与后代联系起来。分类单元（taxon）代表任意分类级别的分类群，如物种、科或目。单一共同祖先衍生的所有后代组成一个单系分支（monophyletic branch），称为支系（clade）。系统发育图（cladogram）是一种以树的形式呈现进化关系的图，其中分支的长度是任意的；相比之下，系统发育树（phylogenetic tree）中的分支长度通常表示所发生的特征变化量。树的形状，或者说节点和分支如何连接不同分类单元的方式，称为树的拓扑结构（tree topology）。这些系统发育树的基本组成元素如图 9.1 所示。

构建系统发育树的基本步骤包括：定义生物学问题、来源与选择具有同源性（homologous）的序列（即拥有共同祖先）、比较保守与可变特征、量化序列间的变化，以及用树的形式呈现数据。以下将逐一讨论这些步骤。

定义所提出的生物学问题对于确定分析方法以及采样程度（sampling，即应包含的序列和物种的范围与类型）至关重要。值得注意的是，并非所有基因都存在于所有物种中。序列可以在实验室中生成，也可以从 GenBank（美国国家生物技术信息中心，NCBI）等私人或公共数据库中获取（见第 1 章）。无论序列是新测得还是从数据库下载，都应确保其质量高、错误少，并经过仔细筛选以保证其同源性。在报告方法时，同样重要的是要注明序列数据的来源。公共数据库常使用基于自动化序列相似性的算法来为基因组注释基因/蛋白质名称。然而，不同的研究人员和不同的物种往往有不同的命名惯例，因此不应仅凭名称来选择序列，而应基于序列相似性来选择。

序列一致性（sequence identity）是一种可量化的度量，描述被比较的序列之间相同的字符数量。序列相似性（sequence similarity）也是一种可量化的度量，描述序列之间相同或化学相似的字符数量；须记住，这种度量并不一定反映亲缘关系（见第 3 章）。例如，同一化学基团的氨基酸共享电荷、极性和疏水性等特性。丙氨酸和缬氨酸都具有疏水性侧链，因此两条序列在相同位置分别含有这两种不同氨基酸时，应被视为相似而不一致（图 9.2）。因编码这些序列的基因遗传自共同祖先而具有匹配字符（核苷酸或氨基酸）和相似结构的序列称为同源序列（homologs）。同源序列因遗传而具有序列相似性。不同物种中由物种分化事件产生的同源序列称为直系同源物（orthologs）。然而，某些物种由于基因复制（gene duplication）过程会包含一个基因（或蛋白质）的多个拷贝。一旦一个基因在生物体内被复制，系统就会有一定的冗余，使选择过程可以在基因的不同拷贝上以不同方式发挥作用。不同的拷贝以不同方式和速率积累变化，导致分歧，并常常使一个或两个拷贝产生新功能。因基因复制而相关的序列称为旁系同源物（paralogs）。有时生物体会通过水平基因转移（horizontal gene transfer / lateral gene transfer）从其他物种获得基因。这些基因的不同拷贝称为异源序列（xenologs）。

在选择比较序列或进行后续分析时，识别和区分这些关系类型非常重要（图 9.3）。选择比较序列的最佳方法是通过 BLAST 搜索等计算方法进行相似性搜索（见第 3 章）。

为了测量不同核苷酸或氨基酸序列之间的变化量，必须首先进行序列比对。这样做是为了确保正在比较的是基因或蛋白质中相同的位置。有不同类型的比对适用于不同的目的，也有许多工具可以执行成对比对和多重序列比对（见第 8 章）。成对比对（pairwise alignment）是将两条序列的字符对齐以实现最大一致性（对于氨基酸序列还考虑保守性）的过程，使人们能够评估相似程度及同源性的可能性。多重序列比对（multiple sequence alignments）对系统发育分析特别有用，可以聚焦于序列的一部分（称为局部比对，local alignment），也可以涉及完整序列（称为全局比对，global alignment）。识别具有许多完全相同或高度相似字符以及一些可变字符的位置，可以指示序列的保守区域。这些保守区域更容易比对，包含了最有信息量的系统发育信号（phylogenetic signal）。高度分化的位置往往难以比对，因此被认为是系统发育噪声（phylogenetic noise），通常不包含在大多数分析中（图 9.4）。关于不同类型软件以及初学者进行系统发育分析所需的各种比对考虑的概述，将在下面的树构建部分讨论（见"多重序列比对与比对编辑"）。

分歧路径，或者说序列通过积累突变随时间变化的方式，将影响所描绘推断进化过程的系统发育树的形状。量化比对序列间的变化并确定序列间的分歧路径需要一些假设，这些假设基于所研究的明确定义的生物学问题。替换模型（substitution models）估计一个碱基或氨基酸变为另一个的似然率；同时估计序列中不同位点的总体变化相对速率。一般来说，在生化性质更相似的碱基或氨基酸残基之间，替换更为频繁。对于 DNA，四种转换（transition）类型（A → G、G → A、C → T 和 T → C）通常比八种颠换（transversion）类型（A → C、A → T、C → G、G → T 及其反向）更为频繁。这种偏差会影响两条序列之间估计的分歧程度。

相对替换速率的具体规定通常以一个方阵的形式呈现（称为替换矩阵，substitution matrix；见第 3 章）。不太可能的替换的替换成本高于更可能的替换。矩阵的非对角线元素对应于从一个碱基到另一个碱基的相对成本。对角线元素代表不同序列中相同碱基的"成本"。不同的 DNA 和蛋白质替换模型将在下面的树构建部分回顾（见"确定替换模型"）。一个值得注意的因素是基因如何将遗传变化从基因传播到蛋白质再到表型表达。非同义替换（non-synonymous substitution）是改变蛋白质氨基酸序列的核苷酸突变。相比之下，不改变氨基酸序列的核苷酸变化称为同义替换（synonymous substitution）。由于非同义替换导致生物体的生物学变化，它们更容易受到选择。

随着测序技术的发展，人们已开发了多种统计检验方法来量化作用于蛋白质编码区的选择压力。其中，dN/dS 比值是最广泛使用的指标之一，部分原因是其简单性和稳健性。该指标通过比较假定为中性的静默位点的替换率（同义替换率，即 dS）与可能受选择影响的非静默位点的替换率（非同义替换率，或 dN）来量化选择压力。dN/dS > 1 仅在选择促进蛋白质序列变化时才会出现，而 dS/dN 比值 < 1 则仅在选择抑制蛋白质变化时期望出现。因此，除了替换类型的变异外，不同位点之间替换速率的变异已被证明会深刻影响树的构建结果——这被称为速率异质性（rate heterogeneity）（Swofford et al. 1996）。

最明显的位点间速率变异（或异质性）例子是编码序列中密码子的三个位点。由于遗传密码的简并性，第三个密码子位点的变化能够在不影响最终蛋白质序列的情况下发生得多。因此，这个第三密码子位点往往变化大得多。出于这个原因，许多编码 DNA 的系统发育分析会排除第三密码子位点。然而，在某些情况下，速率变异模式更为微妙，特别是对应于蛋白质保守区域或 rRNA 的那些。因此，在执行任何系统发育分析之前，应尽可能多地了解给定基因或序列的相关信息；包括所提议的结构域、整体保守程度、编码和非编码区域，以及如果是分析非蛋白质编码基因则应了解其 RNA 结构。为了校正生物分子中各位点突变率的异质性，可以采用 Gamma 分布来建模变异（Yang 1994）。Gamma 分布是一种概率分布（类似于更为人所知的泊松分布），描述变化速率的统计概率，取决于某些参数。Gamma 分布的不同形式（例如峰值振幅和曲线宽度）由一个称为"形状参数"的单一 alpha 参数高度控制。alpha 值越高，异质性或位点变异越低。

树构建方法在细节上有所不同，但本质上都是基于进化模型将物种放入相关分支和节点。树构建方法可以分为基于距离的方法（distance-based methods）和基于特征的方法（character-based methods）。基于特征的方法在树构建过程中直接使用比对序列。基于距离的方法则先将序列数据转换为成对距离（calculated values，将最相似的序列连接在一起的计算值），然后使用这些派生值而非直接使用特征来构建树（图 9.5）。虽然基于距离的方法计算量远小于基于特征的方法，但基于距离的方法会校正各位点的突变饱和。换言之，在发散对的一条序列的某个位点发生突变后，任一序列中的后续突变都无法再使该位点变得更"不同"。事实上，后续突变可以使它们再次相同——例如，如果缬氨酸突变为异亮氨酸但又突变为缬氨酸，这将导致一次"看不见的"替换。这些方法还计算分支长度，表示节点之间或节点与叶子之间发生的变化次数。长分支长度表示更多变化；短分支长度表示更少变化。不同的基于距离和基于特征的方法将在下面的树构建部分讨论（见"树构建"）。

将代表物种的数据拟合到一个树中有许多不同的方法，这通常随所用序列数量的增加而增加。有多种程序可用于评估数据中的系统发育信号和树拓扑结构的稳健性。最流行的方法是统计重采样，称为自展法（bootstrapping）。自展法基于这样的前提：如果系统发育信号均匀分布在整个序列中，不同位点应足以提供相同的树拓扑结构（Efron 1979; Felsenstein 1985）。判断这一前提是否成立很重要，因为某些序列区域可能错误地影响树。例如，具有序列相似性但存在于功能非常不同的蛋白质中的结构域（如结合盒，binding cassettes）可能对系统发育树产生不利影响。因此，自展法可被视为一个两步过程：第一步是从原始数据集中通过随机有放回抽样生成许多新的扰动数据集；第二步是像原始系统发育分析一样处理这些数据集。根据产生的树集合（通常为 100 或 1000 棵树），计算特定分支（例如某个分类单元）在树中出现的比例，并将该值放在共识树（consensus tree）的相应分支上。该值通常称为自展值（bootstrap value）。

需要注意的是，这些新数据集是通过从原始数据集随机抽样字符列创建的。这种随机抽样意味着每个位点与其他位点被抽中的概率相同。因此，每个新创建的数据集与原始数据集具有相同数量的总位点，但有些位置被重复或三倍复制，有些则缺失。因此，某些新创建的数据集可能与原始数据集完全相同——或者在极端情况下，可能只有一个位点被复制了 500 次，而原始数据集中剩余的 499 个位点都丢失了。因此，自展分析允许人们识别给定的分支顺序对序列的某些修改是否稳健，特别是关于某些位点的移除和替换。简而言之，每个自展值都作为对节点置信度的度量。

系统发育树可以表示为有根树或无根树。树的根代表祖先谱系，分支的顶端代表该祖先的后代。随着从根移动到顶端，时间向前推进。通过定义树中（假定的）祖先的位置来对树进行加根，通常通过引入一个"外群"（outgroup）来实现。外群可以是任何未从正在分析的生物体或序列的最近共同祖先衍生的生物体或序列。例如，选择外群的一个例子是用沙门氏菌（Salmonella）序列作为大肠杆菌（Escherichia coli）序列集合分析的外群。Salmonella 序列适合作为外群，因为它足够相似以识别所有分类单元之间的系统发育信号，但又在大肠杆菌属之外（"内群"，ingroup；图 9.6）。

同样，由于已知爬行动物是哺乳动物物种的祖先，爬行动物序列可用于哺乳动物序列分析的外群。外群序列必须在系统发育分析开始时选择，并且必须包含在所有后续步骤中：比对、替换和进化建模，以及树评估。然而，外群加根可能会有问题。接近内群的外群可能只是被错误排除的内群成员。明显较远的外群（例如植物分析中的真菌）可能具有高度分化的序列，其与内群的连接会受到"长枝吸引"（long branch attraction）问题的影响（见下文"树构建"）。明智的做法是检查有外群和无外群两种情况下产生的树拓扑结构。另一种加根方法涉及重复基因或具有内部重复的基因分析（Lawson et al. 1996）。如果所有生物体的旁系同源物都包含在分析中，那么假设没有长枝问题，可以逻辑地将树在旁系同源物基因树汇聚的节点处加根。

树查看软件以不同的格式或"视图"呈现节点、分支和叶子，可以包括加根、自展值和其他置信度指标、分支长度以及叶子标注（例如分类单元、基因或蛋白质的名称；序列 ID 及其他信息），根据需要或喜好设置。在下一节中，我们将概述树构建方法和常用的系统发育分析软件。

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图 9.1 树的两种可视化方式。 本例中同一棵树以（a）和（b）两种方式呈现。分类单元被组织成由一系列分支和节点组成的支系，节点标记分支中的分叉点。在（a）中，注意分支长度没有意义——它们不表示分歧程度，树仅提供分支顺序。判断树仅说明分支顺序的线索是分支长度相等且与每个分类单元名称平齐。（b）同一棵树，但分支长度表示从分析中推断的分歧程度。通过相加每个分类单元之间的分支，可以估计它们之间的分歧程度。在本例中，将分支 1、2 和 3 长度相加表示果蝇和小鼠之间的分歧程度。将分支 1、2 和 4 长度相加表示果蝇和人类之间的分歧程度。在这个人为的示例中，分支长度的差异推断果蝇和小鼠彼此之间比果蝇和人类更近。需要注意的是，在像（b）所示的情况下，仅水平分支有意义。垂直分支仅用于分隔分类单元，便于观察。

图 9.2 说明序列相似性与序列一致性之间差异的比对。 展示了两个比对，比较序列 1 与序列 2 和序列 3。比对 1 比较序列 1 和序列 2，含有四个替换（高亮）。这些替换在同一化学基团内，因此被认为是相似的；A → V、I → V 和 A → L 都是疏水性氨基酸组内的变化，N → T 都是极性不带电氨基酸。有 16 个相同位置，因此一致性为 80%；而相似位置为 20 个（16 个相同加 4 个相似），总相似性为 100%。比对 2 比较序列 1 和序列 3，含有五个替换（高亮）。其中三个替换发生在同一化学基团内，因此被认为是相似的：H 和 R 都是碱性氨基酸，S 和 T 都是极性不带电氨基酸，D 和 E 都是酸性氨基酸。然而，两个替换发生在化学无关的氨基酸之间，因此不被认为是相似的：P 和 V 来自不同基团，R 和 E 也来自不同基团。有 15 个相同位置，因此一致性为 75%；而相似位置为 18 个（15 个相同加 3 个相似），总相似性为 80%。

图 9.3 直系同源物、旁系同源物和异源序列之间的差异。 右边的祖先生物体含有某一特定基因的单一拷贝（以白色矩形表示）。蓝色谱系（带有灰色基因的后代）积累了许多不同的突变，在第一次物种形成事件中形成了一个新的独特物种。每个谱系都有自己的基因拷贝，通过突变和选择分化，这些不同版本称为直系同源物。基因复制事件在同一生物体中产生两个不同的基因拷贝（重复基因以黑色显示），这些拷贝被传递给后代并独立积累突变。仅因基因复制而分化的基因称为旁系同源物。水平基因转移（HGT）事件（也称为侧向基因转移）将基因拷贝传递给新谱系（以虚线轮廓显示），导致不同支系或分类单元共享更近缘的基因，尽管这些谱系本身并非通过垂直传递紧密相关。通过 HGT 过程共享基因产生了异源序列。

图 9.4 系统发育信号与系统发育噪声之间的差异。 系统发育信号由序列保守区域提供，在这些区域中不同位置可以被比对并包含一些变异。这些位置包含有关进化过程或速率的信息（本图中为位置 1–22 和 35–40）。系统发育噪声由更快进化的位点产生，这些位点通常难以比对，可能包含多个空位。这种噪声可能误导系统发育推断，导致弱支持或对错误假设的支持。

图 9.5 基于特征的方法与基于距离的方法。 基于特征的方法（如最大简约法和最大似然法）在树推断过程中直接使用比对序列，而基于距离的方法（如邻接法）首先将序列数据转换为成对距离。

图 9.6 用外群对树加根。 大肠杆菌通常存在于温血动物的下肠道。大多数大肠杆菌菌株是无害的，但某些类型（称为血清型）是有致病性的，可导致人类严重的食物中毒。本例中，将大肠杆菌致病谱系（O157:H7 EDL933 和 APEC01）与野生型实验室菌株进行比较，构建了一个小型大肠杆菌系统发育树。虽然可以从无根树推断序列之间的关系，但除非对树加根，否则无法推断祖先序列。通过用外群（此处为 Salmonella 序列，已知更远缘并是该研究群组的祖先）对树加根，可以确定哪些谱系是祖先的，哪些是后代的。

How to Construct a Tree — 中文翻译

原文信息

• 来源：Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Sequences, 4th Edition
• 范围：PDF page 280-288；印刷页码 260-268；止于 Marker-Based Evolution Studies 标题前
• 版权声明：

翻译说明

• 术语统一采用项目术语库（bioinformatics_glossary.xlsx）
• 工具名、数据库名、URL、文献题录保留英文原文
• 内部子标题（Multiple Sequence Alignment and Alignment Editing / Determining the Substitution Model / Tree Building / Tree Visualization）作为 ### 处理，不作为 peer entries 暴露

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正文

如何构建一棵树

究竟是使用核苷酸数据集还是氨基酸数据集进行系统发育分析，这一问题一直存在争议，焦点集中在系统发育信号的强度与总体使用的便捷性之间。使用氨基酸序列推断系统发育的主要论据在于，氨基酸具有比核苷酸（4个）更多的可能特征状态（20个）。因此，特征状态数目的增加可以提高比对过程中的分辨率。然而，核苷酸序列中特征数目的增加往往能够更好地解析树的拓扑结构，尤其在研究亲缘关系较近的序列时。当然，有些序列（如16S rRNA序列）本身没有相应的蛋白质编码序列。在这种情况下，分析者需要综合考虑生物学问题、所研究序列的分化程度、可用于采样的序列以及现有工具，做出最终判断。

一个简洁的系统发育分析包含四个步骤：多序列比对、替换模型确定、构建系统树，以及系统树评估。每个步骤对分析都至关重要，理应得到相应的重视。一棵树的优劣完全取决于它所基于的数据质量。

多序列比对与比对编辑

系统发育序列分析始终从多序列比对开始。在系统发育分析中，比对步骤的重要性不亚于甚至超过后续步骤，因为它决定了后续进化模型所依据的数据集。在比对过程中，被纳入系统发育分析的比对位置代表了先验的系统发育结论，因为这些位点本身（而非实际碱基）实际上被假定为具有谱系关系或同源关系。典型的比对流程是：先应用 Clustal（ClustalW、ClustalX 或 Clustal Omega）等程序进行比对，再进行手工比对编辑，最后提交给树构建程序（Chenna et al. 2003）。许多现有方法（包括 Clustal、PileUp 和 ProPack 中的 ALIGN）按照明确的系统发育标准（即基于初始成对序列比对生成的"引导树"）来比对序列。执行全局成对比对最广泛使用的算法是 Needleman–Wunsch 算法，该算法同时在 Clustal 和 MUSCLE 比对程序包中实现；该算法在输入数据集的所有序列对之间尽可能多地匹配字符（无论序列长度如何），以获得成对评分（Needleman and Wunsch 1970）。不同程序的具体实现方法略有不同：Clustal 使用实际序列进行比对，而 MUSCLE 在比对的第一阶段仅通过调查序列中的 k-mer（即长度为 k 的短序列）来节省时间（Needleman and Wunsch 1970）。这些评分随后被用于构建引导树，引导树再用于生成多序列比对。

顾名思义，引导树实际上引导构建更稳健的比对。其原理是：亲缘关系更近的序列应优先比对，然后产生的序列组虽然在组间同源性较低，但仍有共同祖先，因此可以更准确地进行彼此之间的比对。多序列比对方法和常用比对软件的示例详见第8章。

比对软件中有许多参数控制比较的速度和敏感性，如空位罚分和打分矩阵的选择，第3章有更全面的介绍。在一种比对方法中，最重要的参数是那些决定长度可变序列比对中插入和缺失（indels 或 gaps）放置的参数。比对的参数应随估计的进化分歧程度增加或减少，因为当序列分歧程度增大时，碱基错配的可能性也随之增大（Thompson et al. 1994）。偏斜的采样（例如近缘序列过度代表）会影响引导树中的成对评分和算法 entrainment，对代表性不足的序列的比对产生不利影响（Thompson et al. 1994; Hughey et al. 1996）。在这种情况下，比对参数也应动态调整。Clustal 等部分软件包提供了动态参数调整功能。然而，除非事先知道系统发育关系，否则没有明确的方法来确定给定系统发育分析的最佳比对程序。

一般来说，不建议简单地将计算机生成的比对直接提交给树构建程序，因为后者无法识别前者的错误。然而，只要在整个比对过程中结合独立系统发育证据进行审视，Clustal 等利用一定程度系统发育标准的方法就是目前最好的选择。例如，如果比对中有几个彼此非常接近的空位，应将它们合并为一个包含所有空位的单一 indel，因为从进化角度来看，一次插入或缺失比多次更合理。同样，Clustal 鼓励在亲水性氨基酸序列中形成空位，这与在球状蛋白表面或膜蛋白的亲水环区域发生插入或缺失一致，而在疏水蛋白核心中则不然。然而，必须强调的是，目前没有任何方法能够依据系统发育模型来判断一个多序列比对是否显著优于另一个。

远缘序列的比对可能存在问题。如前所述，生物大分子结构与功能之间存在重要联系。远缘分子之间的序列分歧往往导致比对不确定，要么"间隙过多"，要么在许多位置高度可变。有时，使用二级或三级结构信息来指导比对被认为在系统发育上比纯序列比对更可靠。这是因为当比较复杂特征（如结构）时，同源性评估的信心更高，而比较简单特征（如可能已高度分化的核苷酸和氨基酸）时则会产生系统发育"噪音"。16S rRNA 基因的情况即是如此（见第6章）。此外，有时需要进行比对"手术"或比对编辑，以确保保留系统发育信号并移除模糊信息；这涉及手动删除数据集中的列。手动解决歧义时，应考虑系统发育关系、替换过程和碱基组成。根据系统发育证据解决歧义是完全合理的，在某些情况下，删除比对中的模糊或噪声区域（图9.4）是可取的。根据一系列稍作修改的比对进行系统发育分析是有用的，这可以观察比对的模糊区域如何影响结果，以及结果的哪些方面更为可靠。

替换模型确定

替换模型的选择应与比对和树构建给予同等重视。如前文所述，替换模型同时影响比对和树构建。虽然替换模型中的任何参数在特定数据集中都可能是关键的，但具有最多参数的模型并不总是最好的——恰恰相反，参数越少越好。这是因为每个参数估计都有关联的方差或不确定性。不幸的是，目前没有一种明确的方法优于其他方法，每种方法都有其自身的优缺点，具体取决于所执行的分析类型和研究者秉持的哲学理念。

过去50年间，不同的科学家提出了许多不同的核苷酸替换模型。这些模型对核苷酸碱基频率（即某特定核苷酸在序列中出现的频率估计）和替换率（即进化过程中一个核苷酸被另一个替换的速率）的估计方式各不相同。JC69 模型（Jukes and Cantor 1969）是最简单的替换模型。JC69 假设碱基频率相等且替换率相同。该模型唯一需要估计的参数是总体替换率。K80 模型（Kimura 1980）假设所有碱基出现频率相等，但区分转换与颠换事件并对其赋予不同的权重，从而影响替换率。Felsenstein 1981年的模型（F81 模型）是 JC69 模型的扩展，允许碱基频率变化（即 A ≠ G ≠ C ≠ T 的频率；Felsenstein 1981）。Hasegawa 等人（1985）的 HKY85 模型可以看作是 K80 和 F81 模型扩展的组合。具体而言，HKY85 区分转换与颠换的不同速率，同时也允许不等的碱基频率。T92 模型将 Kimura 的两参数 K80 方法扩展到存在 GC 含量偏差的情况（Tamura 1992）。

在所有条件相等的情况下，生物体的 GC 含量应等于 50%，相应的 AT 含量应占另外 50%。然而，GC 含量在不同物种间存在差异，这些差异的原因被认为是多因素的，且常常存在争议。例如，分析表明，在某些生物体的某些基因组区域中，GC 含量与最优生长温度之间存在相关性，但并非对所有情况都成立。具体而言，已证明原核生物较高的最优生长温度与结构化 RNA（如 rRNA、tRNA 和许多其他非编码 RNA）较高的 GC 含量之间存在强相关性（Galtier and Lobry 1997; Dutta and Chaudhuri 2010）。TN93 模型（Tamura and Nei 1993）区分两类碱基转换（即 A ↔ G 的速率可以与 C ↔ T 的速率不同）。颠换被认为以相同的速率发生，但该速率允许与转换的两种速率均不同。当存在强转换-颠换和 GC 含量偏差时（如 Tavaré 1986 的通用时间可逆模型的情况），此方法很有用。该模型假设六个替换率参数（C ↔ G、C ↔ T、C ↔ A、A ↔ T、A ↔ G 和 G ↔ T）以及四个不同的碱基频率参数（Tavaré 1986）。

除了核苷酸替换模型外，还有许多氨基酸替换模型。最广泛使用的氨基酸替换模型是 PAM（接受点突变）系列矩阵和 BLOSUM（块替换矩阵）系列矩阵（Dayhoff et al. 1978; Henikoff and Henikoff 1992）。这些替换模型的细节在第3章有进一步讨论。对于系统发育分析，PAM 矩阵被认为适合比较近缘物种，而 BLOSUM 矩阵通常被认为更适合进化上较远缘的序列（Henikoff and Henikoff 1992）。对于精细调整的分析，可能需要使用多种打分矩阵分析一组序列，以确定每个矩阵对结果的影响。由于 BLOSUM62 矩阵在检测远缘序列相似性方面取得的成功，该替换模型被许多序列搜索算法（如 NCBI 的 BLAST）作为默认参数。

树构建

树构建过程始于比对。有时，比对程序的输出格式与树构建程序不兼容，需要对比对进行重新格式化；例如，分类群或分子名称标签可能有字符限制，以及关于序列是否必须以交叉格式排列的规范。因此，在尝试进一步分析之前，数据输入说明尤为重要。系统发育程序包需要输入：比对结果、所选替换模型及其伴随的模型参数（默认设置是一个好的起点），以及关于 bootstrapping 和根化的规格说明。

如前所述，树构建算法分为基于距离的方法（通常计算量较小）和基于特征的方法。基于距离的常用算法包括邻接法（Neighbor-Joining, NJ）、非加权组对法算术平均法（UPGMA）、Fitch–Margoliash（FM）法和最小进化（ME）法。NJ 算法通过多次迭代步骤将一棵未解析的"星形"树逐步分解（Saitou and Nei 1987）。该算法首先根据所选替换模型，识别出彼此距离最短的一对不同序列（标注为分类群、基因或蛋白质）。然后将这些分类群、基因或蛋白质连接到一个新创建的节点上，该节点再与中心节点相连。计算每个分类群到该节点的距离，并使用该值识别下一个亲缘关系最近的序列，然后用于创建一个新节点（因此称为"邻居的连接"）。重复此迭代过程，直到所有分类群都被解析到树中的各个节点。

考虑到替换模型之间的差异以及 bootstrapped 数据集之间的差异，此过程可能生成不同拓扑结构的树，且各节点的 bootstrap 支持度也不同。在这种情况下，会识别一棵共识树，即一棵包含所有可能树中具有最多共识节点的树。有些研究者认为 bootstrap 值超过 70% 的节点是良好支持的，而另一些研究者则认为只有超过 95% 才算良好支持——bootstrap 值越高越好。需要记住的是，节点的高 bootstrap 值并不意味着这些分类群（或基因或蛋白质）之间的关系实际上是真实存在的。它仅仅表明该节点在所选数据和分析方法下是得到支持的。对比对的修改（如包含或排除编辑区域、添加或移除物种，或更改所使用的计算参数）可能以不同方式影响所得的系统发育树。此外，在比对中包含一个严重错排的序列可能导致非常高的 bootstrap 值来支持其作为一个独特分支的分离，但这仅仅是因为错排所致。在系统发育分析之前始终建议手动检查比对。一棵得到良好支持的树增强了分析的信心，但如果没有时间机器回到数百万年前检查实际发生了什么，研究者必须记住，系统发育分析的结果仅仅代表一个非常好的假设。人们始终是在推断一种关系。这就是为什么经常使用"系统发育推断"这一术语的原因。

UPGMA 是另一种聚类算法，它计算所有最近的邻居（Sokal and Michener 1958）。该方法与 NJ 的不同之处在于，NJ 会考虑所有其他叶子到其他叶子的平均距离。UPGMA 隐含假设所有谱系以相同的速率进化（依据分子钟假说），因为它生成的树中所有叶子到根的距离相等。如果各谱系以不同速率进化（事实上它们确实如此），UPGMA 树可能不太适合距离数据。因此，UPGMA 通常不被认为是构建基于距离树的理想方法。ME 和 FM 系统发育推断方法基于以下假设：分支长度估计总和最小的树最可能是真实的树（Fitch and Margoliash 1967; Rzhetsky and Nei 1992）。在基于距离的方法组中，FM 和 ME 方法表现最佳，但它们比 NJ 慢得多，而 NJ 通常会生成与这些方法非常相似的树。

常用的基于特征的方法算法包括最大简约法（Maximum Parsimony, MP）和最大似然法（Maximum Likelihood, ML）。简约原则是所有科学的基础，其观点是：在其他条件相同的情况下，最简单的可能解释是最好的。就树构建而言，MP 方法需要最少的进化变化或最少的特征状态变化（Swofford et al. 1996）。分析中使用所有特征数据；但在确定序列之间的关系时不计算分支长度。虽然通过计数特征状态变化来对系统发育树进行评分很容易，但没有算法能够快速生成最简约的树。相反，最简约的树必须在通常所说的"树空间"中寻找，即在所有可能的树中寻找。MP 分析往往产生大量树（常常数以千计），它们得分相同但拓扑结构不同。在这种情况下，拓扑结构与所有等可能树中最多节点一致的树被认为是最好地支持数据的树。

当考虑的分类群数量较少时，可以进行穷举搜索，对每棵可能的树进行评分并选择最佳的一棵。对于更多的分类群，则必须执行启发式搜索，即在无法获得精确解时找到一个近似解。应当指出，MP 方法在存在大量位点间速率异质性时表现不佳（Huelsenbeck 1995）。此外，最优 MP 树会最小化同塑性（convergent evolution，即特征的独立趋同进化）。因此，MP 方法有时会受到长枝吸引的影响（Bergsten 2005）。长枝吸引发生在不同快速进化的谱系被误判为亲缘关系较近的情况下，无论其真实关系如何。通常，这种情况的出现是因为分析中包含的一个或多个特征在多个分类群中发生了趋同进化。MP 程序可能错误地将这种同塑性解释为在两个谱系共同祖先中进化一次的共裔性（synapomorphy）。

相比之下，ML 方法寻找在给定用户指定的序列进化模型下最好地解释数据的树（由用户指定的参数和分布设置）。四分法（quartet puzzling）是一种相对快速的树搜索算法，用于 ML 树构建（Strimmer and von Haeseler 1996）。使用 ML 时，如果已知数据集的其他信息（例如跨位点的高变化速率），最简单的解释可能不被认为是最正确的。虽然 ML 方法非常慢且计算量大，但据认为它能产生进化过程的最佳表征。因此，ML 方法一直是被称为贝叶斯推断的强大统计方法的基础（Huelsenbeck et al. 2002）。

贝叶斯推断是一种统计推断方法，在算法进行过程中，随着更多证据或信息的获得，进化假设的概率会得到更新。结果的更新概率由先验概率和似然函数确定。先验概率是在检查任何数据之前就确定的一组结果的参数和分布。先验概率有助于在了解实际发生了什么之前确定可能结果的机会。"似然函数"由一组结果的参数和分布组成，当已知可能发生的情况时使用。在分析过程中，通过使用马尔可夫链蒙特卡洛算法来更新结果的概率，该算法迭代地将结果的似然度（及其参数和分布的集合）与数据进行比较，并解析出最可能的结果；然后告知进一步采样的似然度范围（Yang and Rannala 1997）。此过程按研究者指定的次数重复进行。贝叶斯方法与 ML 方法使用相同的方法，即根据进化模型将最好地代表数据的树视为"最佳树"；然而，似然度计算被认为更加"有据可依"。

表 9.1 列出了一些实现不同系统发育分析方法的主流软件包。

表 9.1 实现不同系统发育分析方法的部分常用软件包

实现这些不同方法的流行软件见表 9.1。使用经典 PHYLIP 程序包进行 NJ DNA 序列分析的示例工作流程如图 9.7 所示。

在构建系统发育树时，从尽可能多的角度审视数据是很重要的。由不同方法生成的树拓扑结构的一致性表明，该分析是对真实系统发育的良好估计。不幸的是，不同方法获得的结果之间的一致性并不一定意味着该结果在统计上是显著的或代表了真实的系统发育，因为这种一致性可能有多种原因。外群分类群的选择对分析的影响可能与内群分类群的选择一样大。特别是当外群与一个或多个内群分类群共享异常属性（如组成偏差或分子钟速率）时，会出现复杂情况。因此，建议使用多个外群计算每次分析，并检查内群拓扑结构的一致性。此外，要注意程序可能根据输入文件中序列的排列顺序生成不同的树。PHYLIP、PAUP 和其他系统发育软件提供了一个"jumble"选项，可以以不同的（随机排列的）输入顺序重新运行分析。

如果无论出于什么原因必须单次运行计算树，应将怀疑有"问题"的序列放在输入文件的末尾，以降低树重排方法受到任何问题序列导致的较差初始拓扑负面影响的可能性。一般来说，当生物信息学分析基于进化假设时，应始终将其置于进化背景下进行考虑。例如，如果执行了 BLAST 分析，应该提出以下问题：BLAST 分析中的哪些命中可能是直系同源物而非旁系同源物？在搜索中识别出的哪些跨膜蛋白可能是同源物（祖先相关）还是因跨膜 α 螺旋序列相似性而偶然相似？在比对序列中，哪些结构域似乎是保守的？是否有与某个进化支相关而与其他进化支无关的 indels，表明它们可能具有功能性意义？

树可视化

系统发育树由多个部分组成。树的骨架由节点（nodes）、分支（branches）、叶片（leaves）以及（如果有的话）根（root）构成。叶片的标签通常对应基因、蛋白质或物种名称，但也可以包括生物体的俗名、物种名称可以采用粗体、斜体或彩色字符格式化。典型的系统发育树还会在各自节点旁边标注 bootstrap 值，以及分支长度比例尺。这是一个位于图底部的刻度条，旁边有一个数字（通常是一个分数），用于校准给定字符数下的变化次数。分支长度也可以被量化并标注在树上。一般而言，如果不从比对中移除这些序列，就无法从树可视化中移除分支、节点和叶片并重新进行分析。

系统发育树可以用不同的方式可视化。例如，树可以绘制为水平、垂直、圆形或放射状视图（图 9.8）。叶片和分支可以绕节点旋转而不改变推定的关系。目前有多种树绘制程序可在各种计算平台上使用，包括 TreeTool、TreeDraw、PHYLODENDRON、TREEVIEW、FigTree 以及 PAUP 内的树绘制工具；所有这些程序都处理标准的树文件。这些程序不仅便于生成适合发表或其他演示的树，也便于一般性地查看数据。例如，免费的 TREEVIEW 等程序使用户能够操作分支顺序视图、对树进行重根化，以及执行其他有助于用户的图形操作。

更全面的系统发育树可视化软件列表（包括预计算树的基于网络的视图）可通过互联网资源部分中的"系统发育树可视化软件"链接找到。树图像/文件也可以经常导出到 PowerPoint 或 Photoshop 等其他常用演示和图形软件中，并叠加其他生物学相关特征，例如在疫情调查中涉及的与疾病相关的系统发育相关分离株的聚类，这些可与散发病例区分开来。

Marker-Based Evolution Studies — 中文翻译

原文信息

• 来源：Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Sequences, 4th Edition
• 范围：PDF page 288-289；印刷页码 268-269；止于 Phylogenetic Analysis and Data Integration 标题前
• 版权声明：

翻译说明

• 术语统一采用项目术语库（bioinformatics_glossary.xlsx）
• 工具名、数据库名、URL、文献题录保留英文原文
• Figure 9.9 归属本节；下一节 Phylogenetic Analysis and Data Integration 未纳入本文件

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正文

基于标记的进化研究

遗传分子标记是与基因组中特定位置相关联的 DNA 片段。分子标记已被用于诊断囊性纤维化等疾病，利用 16S rRNA 基因解析分类亲缘关系，也在分子生物学中作为 DNA 条形码使用，从而能够在未知 DNA 混合池中识别特定序列。可用于建立生物体之间关系层级，或建立诸如疾病易感性等性状层级的分子标记类型很多。如前所述，这些标记可以是基因中的 single-nucleotide variants（SNVs），也可以是不同蛋白中的氨基酸替换。虽然 indels 可以是任意的插入或缺失，但 conserved signature indels 特指那些位于蛋白保守区域内、并且仅限于某一特定进化支或某一类物种中的蛋白 indels（Gupta and Griffiths 2002）。Conserved signature indels 是推断进化关系的有用分子标记，因为同一个插入或缺失事件不太可能在两个彼此独立的进化谱系中的同一位置重复发生。

SNVs 也可以在整个基因组之间被追踪和比较，从而以多种方式对序列进行分组。SNV 标记包括序列 motif，或 DNA 中反复出现的短模式，这些模式通常被认为具有生物学功能，例如转录因子结合位点中的模式。当 SNV 出现在酶切限制性位点中时，它们会影响基因组 DNA 的酶切图谱，而这种图谱可以通过 pulsed-field gel electrophoresis（PFGE；Gerner-Smidt et al. 2006）检测到。具有相同酶切片段图谱的不同分离株被认为彼此亲缘关系最近。PFGE 方法已用于微生物分子分型；它也被用于临床或环境样本中分离株的分类（达到亚种水平），例如用于暴发调查中的食源性病原体。另一种微生物分型技术称为 multi-locus sequence typing（MLST），它根据特定遗传位点上 SNV 模式的差异来为微生物分离株分配“sequence types”；其依据是 DNA 片段测序结果，而不是像 PFGE 那样依据电泳迁移率。MLST 可以在一组标准 housekeeping genes 上实施，并通过其独特的等位基因谱来表征菌株（Margos et al. 2008）。或者，也可以在 whole genome 或 core genome 层面实施 MLST；此时，该方法产生的大量等位基因将通过成对差异矩阵进行比较，并以树的形式展示（Achtman et al. 2012）。MLST 关系通常用 minimum spanning trees 可视化；这类树以最短可能路径连接全部节点。Minimum spanning trees 将 sequence types 聚类在一起，并试图识别每一组的 founding（或 ancestral）sequence type（Salipante and Hall 2011）。随后，这些祖先类型会在径向视图中连接起来（Figure 9.9）。

不同微生物的分子分型依赖不同的 MLST schema（即 loci 与 alleles 的集合），因为不同谱系中的不同位点由于变化速率和选择压力不同，其信息量也不同。有些 schema 甚至能够在 in silico 层面表示某些生物学现象，例如 serotypes - 即细胞表面的免疫学性质，可用于区分不同菌株。一个基于 core genome MLST schema 进行 Salmonella 血清型预测的 Web 可访问工具是 SISTR（Salmonella In Silico Typing Resource；Yoshida et al. 2016）。这类工具使得研究者能够快速识别 Salmonella 污染，从而支持食品安全与公共卫生调查。随着流行病学中基因组分析被越来越广泛地用于理解感染的分布与传播，eBURST（Feil et al. 2004）和 SISTR 等软件，以及存放 schema 与分离株数据的数据库，将在减少可预防传染病病例数量方面发挥关键作用。

尽管大多数真核生物 DNA 被包装在细胞核内的染色体中，线粒体也拥有少量自身的 DNA。Mitochondrial DNA（mtDNA）是存在于大多数真核生物中的一类小型双链 DNA（例如，人类 mtDNA 仅包含 37 个基因），并且遵循母系遗传（Anderson et al. 1981）。由于动物 mtDNA 的进化速度快于核基因（Brown et al. 1979），它携带的 SNVs 因而成为法医学、群体遗传学和医学遗传学中的有价值工具（Kundu and Ghosh 2015; Sturk-Andreaggi et al. 2017; Theurey and Pizzo 2018）。用于考察 mtDNA 序列间关系的工具之一是 mtDNAprofiler（Yang et al. 2013）。

植物分子标记研究已被用于作物改良。研究者已经开发出大量功能性分子标记，这些标记可以在小麦、水稻、玉米、高粱、黍类及其他作物中通过遗传序列分析直接识别（Kage et al. 2016）。例如，在小麦 30 个不同基因中识别出的等位基因，已被证明与食品品质、农艺性状和抗病性状相关，并已成功用于育种计划（Liu et al. 2012）。众所周知，植物分子标记研究推动了 20 世纪 60 年代全球粮食生产力的提升，这场进步被称为“Green Revolution”（Hedden 2003）。小麦 Rht1 和 Rht2 基因中的点突变使植株发生“矮秆化”，从而增强了茎秆强度，并最终提高了籽粒产量（Hedden 2003）。基于这类分析开发出的检测方法，至今仍使农民和科学家能够筛查新品种基因型中是否具有目标性状。

Phylogenetic Analysis and Data Integration

翻译

范围：PDF page 289-292；从 Phylogenetic Analysis and Data Integration 标题起，到 Future Challenges 标题前。

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Phylogenetic Analysis and Data Integration

系统发育和进化分析可用于回答多种类型的生物学问题。例如，当所研究的蛋白质与注释完整的序列紧密聚类时，可通过分支模式推断假设蛋白的功能，这一过程称为功能预测（function prediction）。类似地，旁系同源蛋白与直系同源蛋白之间由于序列分化而产生的分支模式差异，可能提示功能的分化。目前已有多种基于系统发育的蛋白质功能预测工具，例如 SIFTER（Statistical Inference of Function Through Evolutionary Relationships；Sahraeian 等，2015），但许多功能预测算法实际上是建立在基于比对的相似性之上的——其中包括 BLAST 和 PredictProtein。在许多情况下，必须将来自多个来源的不同类型数据与系统发育信息整合，才能回答生物学问题。SNV 的频率可以在群体中进行评估，而 SNV 在地理区域间的传播则可通过系统地理学（phylogeography）这一学科来理解。GenGIS 是一个将地理、生态和系统发育生物多样性数据整合在一起的软件平台，用于在多种环境中可视化系统发育关系。GenGIS 曾被用于评估"全球海洋采样考察"（Global Ocean Sampling expedition）的分类多样性（Parks 等，2009）以及 HIV-1 亚型在非洲的传播（Parks 等，2013）。类似地，MicroReact 将基因组学数据与时间、地理和其他元数据整合，以创建与健康相关的可视化图表（Argimón 等，2016）。该平台曾用于重建西非埃博拉疫情以及全球多种耐药微生物的传播事件研究。除了研究工具之外，23andMe 等个人基因组学公司（见网络资源）也利用标记基因和系统地理学分析来识别健康风险并追溯全球家族谱系。

基因组流行病学（genomic epidemiology）是将全基因组测序（WGS）数据应用于理解微生物种群（无论微生物还是病毒）的基因组变异如何影响疾病的发病率、分布及可能防控措施的学科，同时也涉及与公共卫生相关的其他因素。微生物分离株的基因组数据以及临床、暴露、地理和人口统计学数据，通过系统基因组树和其他比较工具进行比较（Tang 等，2017）。感染了被认定与疫情相关的聚集菌株的患者，将被追踪调查其共同的感染来源和传播方式，进而用于控制疾病传播（Robinson 等，2013）。基因组流行病学技术已在全球范围内用于控制多种传染病，包括结核病、沙门氏菌、大肠杆菌及各种病毒性疾病（Gardy 等，2011；Croxen 等，2017；Moran-Gilad 等，2017）。例如，参与 2016 年新加坡寨卡疫情的科学家利用基因组流行病学技术，通过贝叶斯分析将医院和蚊子病毒株进行匹配；这些结果随后被用于指导后续防控措施，例如在哪些区域增加幼虫杀灭剂的投放，以及在哪些区域启动公共卫生宣传活动（Singapore Zika Study Group，2017）。

系统发育学在新兴的微生物取证（microbial forensics）领域也已被证明具有重要价值，该领域旨在将生物恐怖主义行为或无意中释放的微生物/毒素的微生物 DNA 证据与潜在来源进行关联，以支持溯源（Schmedes 等，2016）。例如，2001 年，美国邮政局遭受了炭疽生物恐怖袭击。通过精确的菌株分型鉴定和系统发育分析，来自康涅狄格州、纽约州、佛罗里达州和华盛顿特区的看似互无关联的感染病例被聚类到单一作案者，同时排除了自然原因导致的病例（Yang 和 Keim，2012）。当美国卫生和执法官员追踪作案者时，准确知道炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）的精确菌株类型对于缩小潜在来源范围、确定犯罪现场本身都极具价值（Yang 和 Keim，2012）。测序技术和生物信息学分析的持续进步，继续影响着生物防御、刑事调查和情报获取方面的政策和实践（Schmedes 等，2016）。

癌症是一种遗传疾病，当正常细胞功能被 DNA 突变破坏时就会发生。癌症研究涉及范围广泛的临床和流行病学数据，以及分子和进化分析方法。突变发生在单个细胞水平，随后在细胞分裂过程中传播到亚群。亚群之间生长率的差异产生了复杂的肿瘤微环境，其中包含许多相互作用且不断进化的细胞（Beerenwinkel 等，2016）。由此产生的肿瘤内遗传多样性（intratumor genetic diversity）为肿瘤的正确诊断和治疗带来了巨大挑战，尤其是活检样本可能无法代表整个肿瘤（Beerenwinkel 等，2016）。肿瘤系统发育学（tumor phylogenetics）可揭示导致疾病的进化机制，同时也正在为癌症进展、转移和治疗反应的预测与控制提供新见解（Box 9.1）。

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Box 9.1 Using Phylogenetic Approaches to Predict Cancer Progression and Drug Response

利用系统发育方法预测癌症进展和药物反应

肿瘤系统发育学为揭示导致疾病的进化机制提供了重要视角。癌症是一种遗传性疾病，现已认识到突变的积累、多样化和选择会促进肿瘤细胞增殖，并根据复杂的进化机制影响存活率。图示展示了肿瘤如何包含积累了不同类型突变的混合细胞群。一些突变使癌细胞能够发生转移，而另一些突变则使癌细胞对治疗不那么敏感。系统发育分析已被应用于理解和预测癌症进展、转移及治疗反应的控制。肿瘤系统发育学的目标是利用可能的树空间探索从基因组变异中重建肿瘤进化过程，以解释数据集。特别是在肿瘤细胞异质性判断方面——尤其是与不同临床结局相关的突变类型——已经发展出了相应的进化论和分析方法；这些突变类型包括拷贝数变异（copy number variants）、微卫星（microsatellites，即某些 DNA 模体重复的重复 DNA 序列）以及"突变特征"（mutation signatures），如与环境触发因素相关的核苷酸偏好。突变率以及选择压力的程度和强度极大地影响着治疗方案的选择和预后。不同的治疗方案会导致选择作用，进而改变肿瘤内占主导地位的克隆。单药治疗可能通过选择不应答克隆和提高突变率（肿瘤内异质性）而导致复发，并且与抵抗不同类型治疗的能力相关。这些肿瘤多样性研究高度依赖于适当的参数估计和对不同突变过程的建模，这些过程已通过观察数据得到验证。迄今为止，大多数肿瘤系统发育研究都沿用了为不同物种系统发育树构建而开发的经典算法（Schwartz and Schaffer，2017）。

肿瘤细胞进化导致混合肺细胞群

正常肺细胞 → 肿瘤细胞 → 可治疗性肿瘤 / 导致转移的突变 / 耐治疗的突变

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系统发育学也正在通过新兴的药物基因组学（pharmacophylogenomics）领域推动药物开发（Searls，2003）。药物基因组学是一门结合基因、蛋白质定位、基因/蛋白质相关性、药物和药物靶点知识来识别新型治疗来源的研究领域（Searls，2003）。最著名的药物基因组学发现之一是"可成药基因组"（druggable genome）——即人类基因组中约 3000 个能够表达可与类药物分子结合的蛋白质的基因（Hopkins and Groom，2002；Sakharkar 等，2007）。对于既有相互作用又不断进化的蛋白质——如受体和肽配体（即趋化因子及其 G 蛋白偶联受体）——它们的共同进化反映在其系统发育树拓扑结构的相似性上（Searls，2003）。识别进化趋势的研究可用于创建分子相互作用的从新（de novo）预测算法。由于通路和网络经常与其相互作用伙伴平行共同进化，这些研究也将系统发育分析从单个基因和蛋白质扩展到了整个代谢和生理网络，从而拓宽了新型药物来源的搜索范围（Searls，2003）。

宏基因组学（metagenomics）和代谢组学（metabolomics）（见第 14 章）也正在迅速扩展我们探索陆地和水生环境遗传多样性的能力。宏基因组学是直接从环境样本中回收遗传物质进行研究的方法，用于探索复杂微生物生态系统的多样性，包括无法培养的菌株（Handelsman，2004）。NCBI 公共库提供了来自多种环境群落的序列访问，包括沉没的鲸鱼尸体、活性污泥、农田土壤、酸性矿山排水点、亚热带环流和深海沉积物等（NCBI Resource Coordinators，2016）。对这些基因谱系的系统发育分析（phylogenetic profiling）提供了一种计算机内（in silico）分析形式，可帮助确定体外实验的方向。例如，针对 β-内酰胺类以及 A 和 B 型链阳性菌素的细菌耐药基因产物的多样性和流行率，最初是在人类病原体中发现的（D'Costa 等，2007）。通过宏基因组系统发育分析，在许多环境物种中也发现了这些序列，表明土壤耐药基因组（soil resistome）的规模被严重低估，这也得到了体外研究的支持（D'Costa 等，2007）。这些发现为更好的抗生素管理和在临床上审慎使用抗生素提供了重要动力。

第9章 分子进化与系统发育分析

9.8 Future Challenges、Internet Resources 与 References

范围：PDF page 292 Future Challenges 标题起 - PDF page 298；合并 Future Challenges、Internet Resources、References。

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Future Challenges

系统发育分析是回答多种生物学问题的有力工具。不过，系统发育树本质上是一种推断出来的动态结构：它依赖于所采用的方法、纳入或排除的序列区域、物种取样方式、参数设定、定根方式以及其他因素。听起来似乎有些悖论，但在构建系统发育关系时，最重要的因素并不是具体采用哪一种系统发育推断方法，而是原始数据本身的质量。数据选择与序列比对过程的重要性怎么强调都不过分。即便是最复杂的系统发育推断方法，也无法自动纠正带有偏差或错误的输入数据。因此，研究者始终都应从尽可能多的角度检查原始数据和分析结果，确认结论在一般生物学意义上说得通。

随着 DNA 测序技术的成本持续下降，而速度、读长和准确性不断提升，我们对序列数据进行人工审查、分析、存储和共享的能力也必须同步提升。用于开展系统发育分析和其他生物信息学分析的工具与整合平台仍在不断涌现，因为科学家正在持续开发序列信息的新用途与新应用。在“big data”时代，系统发育学和生物信息学面临的障碍，已经不再是能否产生数据，而是是否有足够多具备专业能力的人来完成分析，以及是否有足够的基础设施来支撑这些计算（Muir et al. 2016）。因此，能够对基因、基因组、蛋白质以及其他分子与系统层面信息开展系统发育分析的分析人员和生物信息学家，今后仍会持续保持高需求。

此外，工具和算法的accuracy、sensitivity 和 specificity（见 Box 5.4）必须以系统化、定量化的方式进行评估，才能明确各自的优势与局限。只有这样，研究共同体才能判断哪些工具和算法最适合特定任务，以及不同方法得到的结果应如何进行比较与整合。

展望未来，针对海量可用数据开展的各种整合式生物信息学与系统发育分析，将为我们理解世界提供新的路径，也会帮助我们学习如何适应不断变化的环境。系统发育学的发展，以及地球生命本身的演化，都可以借用一条广为流传的 Charles Darwin 名言变体来概括——这句话被镌刻在 California Academy of Sciences 总部石地板上：

> “It is not the strongest of the species that survive, nor the most intelligent, but the one most responsive to change.”

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Internet Resources

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References

以下参考文献题录按原书英文原文保留：

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