Metagenomics and Microbial Community Analysis

Ch16 Metagenomics and Microbial Community Analysis / Introduction

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第十六章 宏基因组学与微生物群落分析

引言

人类微生物组（human microbiome）由Joshua Lederberg定义为"……与我们身体空间共栖、共生及致病的微生物所构成的生态群落"，对人类健康具有核心重要性。环境微生物组同样重要，它们支撑着所有生命所依赖的基本生物过程，而其对气候变化做出的响应将深刻影响生物圈的健康。

利用宏基因组学（metagenomics）等技术，我们现在能够深入研究微生物组的组成与功能。宏基因组学通过环境DNA测序来呈现宏基因组样本的分类多样性及功能多样性的纵深横断面。宏基因组学及其他技术推动了微生物组探索性与实验性研究在范围上的迅速增长。宏基因组数据分析虽然采用了序列比对和同源性评估等经典生物信息学技术，但大多数样本中极高的生物多样性（通常含有超过100个已命名物种）以及序列数据的碎片化特性带来了独特的挑战，需要开发专门的生物信息学技术。

宏基因组序列分析与相关方法能够提供微生物组详尽但仍不完整的图谱。现代DNA测序平台能够产生数千万条短序列（长度为150–250 nt），这些序列代表了微生物群落中总DNA的一个样本。从这些序列 reads 出发，宏基因组数据分析面临的挑战在于推断特定样本中的群落结构与功能，并实现多个样本之间的比较。获得分类和功能信息后，研究人员可以就微生物群落提出详细的问题，例如："克罗恩病和2型糖尿病等慢性疾病中是否存在一致的微生物特征？""牛瘤胃中微生物的碳水化合物分解代谢潜力如何？""饮食如何影响人类微生物组，又如何反过来影响人类健康？""淡水微生物群落的'正常'季节性变化是什么？""这种季节性变化如何受到偶发干扰事件的影响？"

从原始序列 reads 到可靠的生态学推论，需要经过许多计算步骤。虽然微生物组分析已开发出许多优秀的算法和软件工具，但许多方法所作的假设可能与群落实际的结构和功能相矛盾。一个被广泛引用的例子是归一化分类丰度谱中的组成性问题（compositionality）。例如，将序列计数表示为微生物种群比例，可能诱导类群之间的虚假相关性，并导致对群落结构的错误推断。为了提供宏基因组数据分析的概览，本章将聚焦于三个核心挑战：(i) 理解碎片化且不完整的DNA序列数据，(ii) 使用适当的群落多样性及功能表征方式，(iii) 寻找适当的技术来汇总和比较微生物组样本。

尽管原核生物（即细菌和古菌）通常是微生物组研究的焦点，但其他生物实体——包括病毒、单细胞真核生物，甚至小型多细胞生物（如线虫）——也可被视为微生物组的一部分。然而，实验技术的选择会强烈影响所回收的信息类型。例如，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增基因组特定区域的标记基因分析通常只针对原核生物，而且根据引物的选择，可能只返回细菌的信息。病毒评估需要一套不同的技术，包括选择性过滤，且依赖于单一通用标记基因的计算方法无法使用。目标生物的选择可能是明确地由假设驱动，也可能由于评估技术的选择而隐含地决定。

Ch16 Metagenomics and Microbial Community Analysis / Why Study the Microbiome?

Why Study the Microbiome?

为什么要研究微生物组？

在 2017 年发表的一项研究中，研究人员考察了 microbiota transfer therapy（微生物群移植疗法）对 autism spectrum disorder（ASD，自闭症谱系障碍）相关症状的影响。该试验在 7–8 周内，将一组“健康”的肠道微生物引入一组 ASD 儿童体内。研究结果非常显著：胃肠道症状的严重程度不仅下降了 80% 以上，而且与自闭症相关的临床症状也表现出明显且持续的改善（Kang et al. 2017）。微生物疗法为何能够对健康和认知状态产生如此深刻的影响？关键在于连接肠道微生物群与宿主的代谢相互作用和信号相互作用。在自闭症的案例中，不同类型的细菌已被发现与 ASD 呈正相关或负相关，尽管目前尚未识别出精确的微生物“特征”（signature）。驱动 ASD 中宿主—微生物相互作用的机制很难评估，相关研究仍在进行，但由微生物组诱导的免疫失调很可能发挥关键作用（Vuong and Hsiao 2017）。

评估微生物疗法等干预措施对患者影响的一个关键环节，是评估干预所诱导的微生物群落变化。为此，需要对 microbiota（微生物群）进行“干预前后”的评估。怎样才能做到这一点？培养完整的细菌库在实践上并不可行，在许多情况下甚至是不可能的，因为物种数量庞大，而且许多物种难以在实验室中培养。最广泛使用的方法是利用 high-throughput DNA sequencing（高通量 DNA 测序）方法收集分子数据，然后使用 bioinformatic techniques（生物信息学技术）和 reference databases（参考数据库），将观察到的信息（例如 DNA sequences）与样本中存在的 taxonomic diversity（分类多样性）和 molecular functions（分子功能）信息联系起来。在上述自闭症研究中，作者使用 DNA sequences 作为微生物生物多样性的替代指标，并能够将 Bifidobacterium 和 Prevotella 等分类单元的丰度，与患者在若干标准化自闭症症状评估中的改善相关联。

假设驱动的实验研究和临床研究可以提供关于微生物组变化与其他变化之间关系的详细信息，例如微生物组变化与人类宿主健康变化之间的关系。即使是对一组人类受试者或环境样本的微生物组调查，也可以提供非常有价值的信息。大规模微生物组测绘项目，包括第一个 Human Microbiome Project（人类微生物组计划）（Turnbaugh et al. 2007; Huttenhower et al. 2012），将研究重点放在构建名义上健康人群中存在的基线微生物组。许多研究比较了不同国家个体的微生物组、同一国家不同地理区域人群的微生物组，甚至比较了同一城市内不同建筑和交通枢纽中的微生物组。Metagenomic analysis（宏基因组分析）也已被用于识别和分析人类微生物组中的特定功能基因，包括参与维生素和短链脂肪酸合成的基因，以及赋予 antimicrobial resistance（抗微生物药物耐药性）的基因。

环境微生物组研究扩展了我们对微生物的认识，这些微生物支撑着 nutrient cycling（营养循环），并维持着大多数生态相互作用。早期研究……

Ch16 Metagenomics and Microbial Community Analysis / The Origins of Microbiome Analysis

微生物组分析的起源

对海洋微生物组的研究揭示了 SAR11 的存在。SAR11 现在被认为是海洋中最丰富的一类微生物。宏基因组分析显示，SAR11 类型存在显著变异，并可能受到环境筛选作用的影响；这提示在不同地理位置，SAR11 可能具有不同的生态相互作用，并对营养循环产生不同影响（Brown et al. 2012; Giovannoni 2017），同时也体现出生物多样性和功能的纬度梯度。2010 年 Deepwater Horizon 石油泄漏事件后，对墨西哥湾开展的宏基因组分析显示，Oceanospirillum 等能够降解石油的生物类群丰度增加（Lu et al. 2012）。尽管这种增加提示 Oceanospirillum 可能用于生物修复（bioremediation），但它在 Deepwater Horizon 石油泄漏后果中的实际影响仍不确定。其他大规模环境调查也已经完成，例如 Tara Oceans initiative（Sunagawa et al. 2015）和 Earth Microbiome Project（Thompson et al. 2017）。除发现新的分类类群和生态关联外，这类调查还为未来研究提供了基线和参考数据库。随着环境破坏和气候变化使地球生物多样性承受越来越大的压力，理解环境微生物组将在评估和预判变化影响以及制定缓解策略方面具有核心重要性。

微生物组分析的起源

1985 年的一项开创性分析直接从环境中解析了遗传序列数据（Stahl et al. 1985）。通过直接测序 5S ribosomal RNA（rRNA，核糖体 RNA），作者能够识别已培养嗜热生物的近缘类群，并通过将获得的序列映射到更大的系统发育树中，描述了 Yellowstone National Park 中 Octopus Spring 的微生物群落结构。该温泉 pH 略偏碱性，温度为 91 ℃；研究发现其中存在一个繁盛的微生物群落，其成员所生活的温度和 pH 高于此前已表征的远缘亲属。

1991 年，第一项基于 16S rRNA 基因（下文简称“16S”或“16S gene”）的研究发表，该研究用于描述 Sargasso Sea（围绕 Bermuda 的深蓝色海域）的群落结构。借助 16S gene 所提供的分辨率，作者发现了高度多样且丰度很高的 SAR11 生物簇（Giovannoni et al. 1990）。到 20 世纪 90 年代中期，16S 调查的速度不断加快，部分原因是 Sanger sequencing 成本下降，以及可用 16S 数据迅速增加。因此，Ribosomal Database Project（RDP; Cole et al. 2014）的序列集合大幅增长：在 1992 至 2001 年的 10 年间，从仅 471 条核糖体序列增加到超过 100 000 条。

尽管在 21 世纪，metagenomics（宏基因组学）几乎已经成为 DNA sequencing 的同义词，但该术语最早由 Handelsman et al.（1998）使用。当时他们利用功能克隆载体（functional cloning vectors）来表达直接从环境中分离得到的基因。“metagenomics”一词指的是以不依赖细菌分离和培养的方式，同时研究多个基因组。然而，这一术语后来扩展到涵盖其他环境表征方法，尤其是直接从环境中进行 DNA 测序；这种方法是一些里程碑式论文的核心，这些论文聚焦于表征 Sargasso Sea 和酸性矿山排水（acid-mine drainage）环境中的微生物组（Tyson et al. 2004; Venter et al. 2004）。

尽管 DNA 测序在表征微生物群落方面非常有用，但样品中存在某些基因并不保证这些基因正在主动参与相应系统中的生物化学过程。基于 marker genes（标记基因）和 metagenome samples（宏基因组样品）的 DNA 调查，不能区分不同条件下基因表达的差异，也不能揭示基因表达带来的代谢后果。这一局限性推动了一组扩展的“meta-omic”（宏组学）或“multi-omic”（多组学）技术的发展。之所以这样命名，是因为这些技术涵盖多种评估方法，包括分别针对群落 RNA、蛋白质和代谢物组成的 metatranscriptomics（宏转录组学）、metaproteomics（宏蛋白质组学）和 meta-metabolomics（宏代谢组学）。这些方法能够区分 DNA 含量没有显著差异的样品。然而，这些技术成本更高，样品制备和保存通常也更加复杂。这些新兴方法前景广阔；不过，鉴于基于 DNA 的方法应用最为广泛，本章的大部分内容将聚焦于 marker-gene analysis（标记基因分析）和 metagenomic analysis（宏基因组分析）。

宏基因组分析流程

宏基因组数据及相关类型数据的分析存在许多变体，但所有这类研究所使用的实验流程和分析流程具有很强的相似性（Figure 16.1）。

• 样品采集按照标准采集方案进行。该方案可能包括按大小过滤、岩芯或柱状取样（core sampling）、拭子采样（swabbing）等步骤。一个重要考虑因素是 DNA 保存条件的选择。例如，将样品在室温下放置较长时间，可能会对微生物群落组成以及生成序列的分类分布和功能分布产生负面影响（Choo et al. 2015）。用于其他类型方法的样品（例如 metatranscriptomics）必须更加谨慎地处理。例如，将用 mass spectrometry（质谱）表征的样品在提取前不得冷冻。

• DNA 序列提取所使用的技术通常取决于样品来源生境，这是由样品的化学性质和物理一致性决定的。例如，土壤样品通常含有 humic acids（腐殖酸）——这类化合物会干扰用于制备和测序 DNA 的酶——因此，在 DNA 测序前必须进行 DNA purification（DNA 纯化）等处理。

• 随后通过构建序列“library”（文库）来进行 DNA 测序准备。序列文库是由待测基因组或多个基因组来源的、经过特殊制备的 DNA 片段集合。文库制备步骤可能包括 DNA 剪切、通过 PCR 进行扩增、添加 adapters（接头）以便测序，以及添加短而具有区分性的 DNA 序列（Hamady et al. 2008），用于区分同一次测序运行中测序的多个样品。制备方案通常与将要使用的 DNA 测序平台相对应。

Collect environmental sample

Store material

Sample preparation and QC

Metadata

Extract DNA

Sequence DNA

Quality control

Taxonomy and function

Statistical analysis

Figure 16.1 基于 DNA 的微生物组分析的一般流程。

Ch16 Metagenomics and Microbial Community Analysis / Metagenomic Workflow

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# 宏基因组学与微生物群落分析

……以及 meta-metabolomics，分别以群落中的 RNA、蛋白质和代谢物组成为研究对象。这些方法能够区分那些在 DNA 含量上没有表现出显著差异的样本。然而，这些技术成本更高，样本制备和保存通常也更加复杂。这些新兴方法具有很大潜力，但鉴于基于 DNA 的方法已被广泛使用，本章的大部分内容将重点讨论 marker-gene 分析和 metagenomic analysis。

## Metagenomic Workflow

metagenomic 数据及相关类型数据的分析有许多变体，但这类研究所采用的实验流程和分析流程具有很强的相似性（Figure 16.1）。

- **样本采集**应按照标准采集方案进行。该方案可能包括按大小过滤、取芯采样、拭子采样等操作。一个重要考虑因素是用于保存 DNA 的条件选择。例如，将样本在室温下放置较长时间，可能会对微生物群落组成以及所生成序列的分类学分布和功能分布产生负面影响（Choo et al. 2015）。为其他类型方法（例如 metatranscriptomics）制备的样本必须更加谨慎地处理。例如，将使用 mass spectrometry 表征的样本在提取前不得冷冻。

- **DNA 序列提取**所采用的技术通常取决于样本来源生境，这是由样本的化学性质和物理一致性决定的。例如，土壤样本通常含有 humic acids（腐殖酸）——这类化合物会干扰用于制备和测序 DNA 的酶——因此，在进行 DNA sequencing 之前，必须先执行 DNA purification 等技术步骤。

- 随后，通过构建序列“library”来完成 **DNA sequencing 的准备工作**。sequence library 是一组经过特殊制备的 DNA 片段集合，这些片段来源于待测序的一个或多个基因组。library preparation 步骤可能包括 DNA shearing、通过 PCR 进行 amplification、添加用于促进测序的 adapters，以及添加短而具有区分性的 DNA 序列（Hamady et al. 2008），以区分在同一次测序运行中测序的多个样本。制备方案通常与将要使用的 DNA sequencing platform 相对应。

Collect environmental sample

↓

Store material

↓

Sample preparation and QC

↓

Extract DNA

↓

Sequence DNA

↓

Quality control

↓

Taxonomy and function

↓

Statistical analysis

**Figure 16.1** 基于 DNA 的 microbiome analysis 的一般工作流程。

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Ch16 Metagenomics and Microbial Community Analysis / General Considerations in Marker-Gene and Metagenomic Data Analysis

General Considerations in Marker-Gene and Metagenomic Data Analysis

标记基因与宏基因组数据分析的一般考虑

对上述一般工作流程进行细化，可能会显著影响后续需要执行的生物信息学分析。

DNA 测序平台的选择会强烈影响对微生物组信息的获取。DNA sequencing 技术正在快速变化；针对某一分析选择测序平台时，需要综合考虑多种因素，包括成本、预期错误率、预期错误类型、读长以及平台可获得性。随着每个核苷酸碱基的测序成本持续下降、新技术不断出现，某一项目的最佳平台选择也会随之改变。一般而言，多样性研究受益于更长的 read length。Marker-gene 研究通常基于某一基因的短片段，但对更长片段或整个基因进行测序，可以为分类学分类提供更高分辨率。在 shotgun metagenome 研究中，判断哪些 DNA 片段来自哪些基因组，在很大程度上会因获得长度 >1000 个核苷酸的 reads 而变得更容易。这类 reads 更有可能跨越难以组装的区域，例如重复序列、低复杂度区域或旁系同源基因（paralogous genes）。这有助于组装出更大的 contigs。

目前，少数几个测序平台几乎承担了全部环境 DNA 研究。Illumina 系列 DNA 测序仪能够以相对较低的成本产生数量非常庞大的 sequence reads，但 reads 较短，通常只有 150–300 nt。Illumina 测序仪的测序错误率约为 0.1%。鉴于其广泛使用，本章的大部分内容将重点讨论 short-read Illumina sequence data，但在适当位置也会提及其他技术。Pacific Biosciences（PacBio）RS II 能够产生长得多的 reads，其中位读长通常在 5000–10 000 nt 之间。虽然这对于 microbial community analysis 可能是一项优势，但其测序错误率（>10%）非常高。在许多应用中，常见做法是使用较长的 PacBio reads 构建 metagenomic contigs 的近似 scaffold，然后再进行 Illumina sequencing，以尽可能校正错误。Nanopore sequencing 是一种相对较新的技术，正开始应用于许多研究领域。与 PacBio 类似，Oxford Nanopore MinION 可以产生长 reads，但同样存在相对较高的错误率。Nanopore 方法按每个核苷酸序列计算的成本最高，但其目前的关键优势在于便携性，以及能够进行“real-time” sequencing。

在 metagenomic 和 marker-gene 研究中，数据质量是一个重要问题。如上所述，测序错误会给分析带来显著挑战。所有 DNA 测序平台都会产生错误，但不同平台产生的错误类型不同，例如序列替换（sequence substitutions）与插入（insertions）。因此，有必要依据质量指标对 sequence reads 进行过滤；这些质量指标通常表示在 FASTQ 格式文件中（Cock et al. 2009）。Phred scores 是一种广泛使用的序列质量度量，用于表示某一碱基被错误判定的概率。FASTQ files 在典型的序列和 header 信息之外，增加了逐碱基表示的 Phred scores。FastQC（www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc）是一种广泛使用的工具，可根据样本 reads 的 Phred scores 对其进行汇总，并执行低质量序列区域的 trimming 以及低质量 reads 的移除（Figure 16.2）。

通常，平均质量分数低于给定阈值的 reads 会被移除；reads 中包含低质量 base calls 的片段也会被移除。虽然可以使用不同的质量阈值，但一种常见方法是在遇到一个相关质量低于给定阈值的核苷酸后截断 read，或者直接丢弃整个 read。Chimeric sequences 也可能在 PCR 过程中产生；由于这类序列来源于两个不同序列的部分片段，从分类学角度看会产生很强误导，因此应予以移除。

分析的计算成本同样重要。鉴于许多 metagenomic datasets 包含一百万条或更多 sequence reads，如果某些应用的运行时间或内存使用量随输入数据集规模呈二次方增长，甚至更糟，那么除非数据集非常小，或在详细分析之前已经经过非常严格的过滤，否则这类应用将不可行。一个简单例子是 all-versus-all homology search。在这一例子中，包含 n 条序列的数据集大约需要 n × n = n² 次比较；但如果数据集大小增加一倍，则需要 2n × 2n = 4n² 次比较。对于包含数亿条 reads 的 metagenomic datasets，以及包含数万个已测序基因组的 reference databases，这种扩展特性会带来不可承受的计算负担，因此需要高效的替代方案。Sequence alignment 是一个其扩展性能已被深入研究的领域；相关综述见 Baichoo and Ouzounis（2017）。

Figure 16.2 Illumina 测序运行中 DNA sequence read quality 的 FastQC 摘要。对于每一个 read position（横轴），图中显示 quality scores（纵轴）的分布。虽然最初几个 read positions 的平均分数较好（绿色带），但 quality score distributions 会迅速升高，许多位点在所有 reads 中都表现出较差质量（红色带）。Source: www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/bad_sequence_fastqc.html.

微生物组分析中使用的两类主要序列分类方法是 sequence searching/alignment 和 compositional similarity。Sequence searching 和 alignment 可用于识别 query sequences 与 reference database 中序列之间的同源性（homology）及相似程度（见 Chapter 3）。Compositional similarity 是一种将序列分解为 summary vectors 的方法，其中每一个向量元素描述序列的一个属性。迄今为止，最常见的这种表示方式涉及 k-mers（在 Taxonomic Assignment and Profiling 中会更详细介绍），即将一条序列分解为其所有长度为 k 的组成词。虽然 k-mers 会牺牲这些词在较大序列中位置上下文的信息，但其计算速度可以比 sequence alignment 方法快几个数量级。Sequence searching/alignment 和 compositional similarity 方法均改编自 metagenomic sequencing 出现之前已经开发的方法；但为了应对 metagenomic datasets 的独特性质，这些方法仍然需要进一步改进。

Metagenomic data analysis 中另一个重要考虑因素是 reference databases 的完整性和可靠性。如今，16S genes 数据库中已经包含超过 200 万条带有指定分类学信息的序列，但环境 16S surveys 不可避免地会产生一些与 reference database 中任何序列相似性都非常低的序列。对于这些 mystery sequences，应该如何处理？一种选择是使用无监督……

Ch16 Metagenomics and Microbial Community Analysis / Marker Genes

Marker Genes

另一种方法是基于序列一致性（sequence identity）或其他标准，将环境序列彼此关联起来，而不是通过与参考数据库比较来进行归属。另一种选择是在较高的分类层级上报告信息；例如，某条序列可能能够被可靠地分类到 Proteobacteria 门，但无法分类到更具体的层级。在这种情况下，该序列可以被纳入高层级的分类汇总，但在其他分类阶元中排除。参考分类数据库也体现了原核生物分类学的局限性，因为在 16S 系统发育树中，与不同分类群相关的序列常常混杂在一起（见第 9 章）。

类似的局限性也适用于为宏基因组读段分配功能注释。通过同源性进行功能分配（使用 BLASTX 或下文概述的其他序列搜索算法；另见第 3 章）是一种常见做法，但参考数据库中包含许多功能未知的基因。即使在所有微生物中研究最深入的 Escherichia coli K-12 MG1655 菌株中，许多预测基因仍被标注为 “hypothetical”（假定的）或 “putative”（推定的）。在许多宏基因组序列数据集中，预测基因常常匹配到功能未知的基因，因此在功能汇总中必须被舍弃，或归入 “other”（其他）类别。

另一个重要考虑因素是，从给定采样地点获得的微生物/序列多样性是否具有生态相关性。Baas-Becking 假说认为：“Everything is everywhere, but, the environment selects”（万物无处不在，但环境会进行选择）。这一假说对许多微生物是成立的，因为它们具有高度流动性，并且不受迁移屏障的严格限制（Baas-Becking 1934）。相邻生境之间具有很强的连通性，这一点可以从病原体在宿主之间传播，以及环境扰动后邻近生境的重新定殖中清楚地看到。虽然粪便样本常被用作人体肠道微生物组的替代样本，但靶向研究已经表明，肠道不同部位可以栖息不同类型的微生物，而一个粪便样本可能代表来自不同亚生境的生物混合物（Stearns et al. 2011）。迁移和生境连通性可能导致微生物群落中包含生态上并不相关的生物。对海洋生境的深度测序（Caporaso et al. 2012）揭示了许多丰度极低的序列。因此，在许多情况下，这些序列所代表的生物可能对周围环境影响很小。然而，不能假定稀有就意味着无关，因为稀有类群可能提供关键的代谢过程，并且某些稀有分类单元会偶尔出现丰度峰值，这种性质称为条件性稀有（conditional rarity）（Shade et al. 2014）。重复采样和重复实验有可能区分稀有分类单元与无关分类单元；但无论如何，研究者在判断观测到的分类单元和功能是否具有生态相关性时，都必须谨慎。

Marker Genes

标记基因（marker gene）是指具有某种表达功能的 DNA 序列，通常编码结构 RNA 或蛋白质；它存在于目标分类群的所有成员中，并且具有足够的变异性，能够区分该分类群中的不同成员。16S 基因是一种标记基因，由于若干原因，它在细菌和/或古菌多样性的一般性调查中占据主导地位。第一，作为核糖体的关键结构组分，16S rRNA 存在于所有原核生物中。第二，由于 16S 基因长期以来一直是早期分子系统发育研究的基础，它已经在许多微生物中得到广泛表征，并构成目前可获得的最全面的遗传生物多样性资源。第三，16S 基因包含高度保守区域，这些区域可作为有用的 PCR 引物结合位点，覆盖广泛的生物多样性。第四，保守区域夹在 9 个可变区两侧；这些可变区具有足够的特异性，能够将许多类群解析到属、种或菌株水平（Figure 16.3）。第五，由于 16S 基因不编码蛋白质，它不表现出通常的密码子简并模式，而这种模式会使引物设计复杂化。

因此，通过一个相对简单的流程，即分离并测序 16S 基因，就有可能表征样本中大多数细菌多样性。这一策略已经成功应用于数以千计的环境 DNA 调查。

Figure 16.3 16S ribosomal RNA 基因的一级结构和可变区。具有高熵的高变区能够区分不同的细菌谱系，而低熵区域适合用于 polymerase chain reaction（PCR，聚合酶链式反应）引物设计。颜色表示在 RIM-DB 的古菌序列中某一给定同源位点被观察到的次数（Seedorf et al. 2014）。Source: doi.org/10.7717/peerj.494/fig-2.

然而，在设计 16S 实验时，需要牢记这种方法的若干局限性。第一，多拷贝基因可能导致某些细菌在扩增样本中过度代表，因此需要进行化学计量校正（stoichiometric corrections）（Kembel et al. 2012）。在少数情况下，多个拷贝的核苷酸序列差异可高达 10%，从而使正确的物种归属变得困难。第二，在基于短读段设计扩增子实验时，必须选择特定的引物对，使其靶向所有可变区中的一个子集。引物偏倚可能导致某些基因被过度代表，而其他基因被低估；每一种引物对选择都可能完全漏检某些基因。使用不同可变区进行的研究不能可靠地相互比较。第三，16S 基因并不总是能够解析物种或分离株内部非常接近的关系，因为任何观察到的变异都可能源于测序错误。

尽管存在这些局限性，16S 基因仍然是宏基因组研究中使用最广泛的靶标，并且能够产生稳健的结果，至少在单个研究内部具有一致性。如果某项研究无法接受 16S 方法的缺点，一种常见做法是使用替代标记，或如后文所述，直接从宏基因组数据中进行分类学推断。

Ch16 Metagenomics and Microbial Community Analysis / Metagenomic Data Analysis

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宏基因组数据分析

与元数据的关联

多种统计和机器学习方法已被用于将分类学信息与环境元数据参数（如来源部位、土壤pH值和营养浓度）相关联。多种两样本和多样本检验方法，如t检验和方差分析（ANOVA）（及其置换变体，如PERMANOVA），已被用于识别样本之间和样本内部的显著差异。

标记基因分析回收的大量序列和OTU在统计分析中引发了多重检验问题：随着潜在预测变量的增多，部分预测变量很可能因偶然因素而产生显著关系。在这种情况下，必须进行多重检验校正，如Bonferroni校正或伪发现率（FDR）校正（见第18章）。除统计显著性外，还必须考虑效应量，因为统计结果可能具有非常小的p值，但不同类型样本之间却只有无意义的差异。STAMP（Parks等，2014）和LEfSe（Segata等，2011）是旨在解决宏基因组学中若干统计挑战的两个程序。LEfSe通过线性判别分析评估样本类型之间的差异，然后识别对类别间区分贡献最大的特征。LEfSe生成可视化结果，突出显示在不同类别样本中被过度代表或不足代表的分类群（图16.8）。

机器学习方法也被用于发现微生物组与环境数据之间的关联。16S序列和OTU数据的高维特性要求能够处理大量输入的方法，可能还需要使用前置特征选择方法来缩小感兴趣的候选群。Knights等（2011）应用了多种跨越统计学和机器学习的方法，包括随机森林和弹性网络分类器，使用OTU作为输入对若干参考宏基因组数据集进行分类。研究未发现明显的最优方法，这与"没有免费午餐"定理一致，该定理大致指出：没有任何单一分类器能在所有类型的分类问题中都全局最优。Ning和Beiko（2015）将特征选择和随机森林分类器应用于口腔微生物组样本的分类，发现灵活的系统发育分组定义往往比严格定义的OTU阈值更有效，这突显了OTU在微生物群落分析中的局限性。

基于标记基因的方法利用基因组多样性来构建微生物多样性的综合视图。然而，在设计标记基因调查和解释结果时，需要考虑本节所述的局限性。针对微生物群落分类学特征分析的不同方法进行比较，引发了人们对PCR分析方法准确性的重大担忧（Schirmer等，2015）。除这些技术考量外，另一个重要陷阱在于仅根据分类学名称就为分类群或OTU指定推定的生态作用。考虑到微生物快速生态多样化的能力，一个命名物种或属可能包含执行不同任务的多个不同谱系，有时其丰度之间可能表现出强烈的负相关。尽管存在这些局限性，16S基因等标记基因仍然是生成关于群落多样性和功能变化重要驱动因素假设的有用工具。

宏基因组数据分析

标记基因的优势在于其在所有采样分类群中的普遍分布；然而，其丰度或分类学归属很少能直接提供群落功能的证据。特定分类群的存在可能暗示特定生化功能的存在，但需要通过不同手段获得直接的功能证据。第一个宏基因组（而非基于标记基因的）分析（Handelsman等，1998）使用克隆和在载体库中表达，而非鸟枪法测序，来评估微生物群落中存在的功能范围。然而，克隆方法成本高昂，高通量测序（本节其余部分将讨论的内容）迅速成为表征微生物群落功能和分类多样性的标准方法。DNA测序所提供的细节水平允许更完整地枚举微生物群落中的候选功能，这些功能随后可用于构建群落功能模型。

从标记基因数据预测功能信息

最近开发的方法，如"通过重建未观察状态进行群落系统发育调查"（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States，PICRUSt）（Langille等，2013），旨在从标记基因调查预测宏基因组功能库。这些预测方法利用了越来越多的已测序微生物基因组，这些基因组提供了标记物与候选功能之间的联系。PICRUSt基于将采样的16S序列插入一个参考树，该参考树包含所有微生物基因组中16S序列。环境序列的功能预测将基于在16S树中与之相近的基因组的基因含量。宏基因组中功能的整体预测基于与环境序列相关的所有功能的总和，并根据其在样本中的相对丰度进行加权。

PICRUSt的准确性依赖于两个相关因素：参考数据库中合适基因组的可用性，以及功能性状的保护程度。当宏基因组组成成分有大量密切相关序列基因组时，准确性最高。对多个生境的初始验证表明，在预测肠道宏基因组方面准确性最高；这在很大程度上是由于对人类肠道微生物组的许多参考基因组进行了深度测序。相反，在参考基因组少得多的生境中，如高盐环境，PICRUSt的准确性要低得多。PICRUSt准确性的第二个关键驱动因素是不同功能性状的保护程度。像核糖体蛋白这样的核心功能在更大的分类学距离上高度保守，因此更容易预测。对于保护程度较低的功能性状（如生境特异性转运蛋白），平均准确性较低，因为这些性状在小分类学范围内分布更加不均匀。预测的不确定性表示为均值预测周围的置信区间，置信区间越小表示预测越有信心。虽然PICRUSt只能生成宏基因组功能分解的预测，但这些预测可用于许多通常应用于真实宏基因组数据的工具。

宏基因组分析流程

与16S分析一样，宏基因组分析的每个相关步骤都有多种可用选项。由于宏基因组数据集包含从多个基因组随机测序的reads，宏基因组分析的某些方面类似于基因组组装和分析中使用的步骤。然而，序列reads的异质来源混淆了序列组装等步骤，并产生了分类归属的需求。Microbiome Helper（Comeau等，2017）是一个宏基因组分析软件包，将一套标准工具整合到一个整体工作流程中。其他宏基因组工作流程工具包括"模块化开源全基因组组装器的宏基因组版本"（metAMOS；Treangen等，2013）和MEtaGenome ANalyzer（MEGAN；Huson等，2016）。虽然本节其余部分以宏基因组数据分析的可信线性工作流程形式呈现，但基因注释、序列搜索和功能分配等不同方面可以在同一步骤中完成。例如，如果通过与参考数据库的序列比对来注释宏基因组基因，则可以在同一时间将为参考基因指定的功能注释分配给预测基因。

质量控制与配对端reads的合并

由于宏基因组学涉及随机DNA片段的测序，如果研究不感兴趣，来自噬菌体、病毒和真核宿主生物的序列可能会从数据集中移除。这些通常通过与参考数据库的比较来移除，使用高效的read比对工具如Bowtie2（Langmead和Salzberg，2012）。与参考数据库序列匹配的宏基因组reads会从宏基因组数据集中移除。

由于某些DNA测序平台对DNA片段的两端进行测序，相应的两个"配对端"序列可以拼接在一起，以保留它们在源基因组中彼此接近的信息。根据片段大小和读长，这些reads甚至可能重叠，在这种情况下，可以使用read拼接程序（如PEAR；Zhang等，2014）获得连续序列。如果reads不重叠，则两个配对端之间会有未知的序列，但它们彼此之间的间距仍然已知。

组装

虽然宏基因组分析可以直接在DNA序列reads上执行，但更长的重叠群（contig）提供了更多关于基因之间关联的信息，并为分类学和功能分布的推断提供了更好的统计信息。标准基因组组装器的一个关键假设是所有reads都来自同一克隆生物体。在宏基因组数据中，情况显然并非如此，组装因需要识别应被组装在一起的reads子集而变得复杂。如果给定样本中存在密切相关的菌株，可能无法识别特定reads的来源菌株，也难以进行跨菌株组装，因为高度保守区域与高变异或差异基因组含量区域会相互穿插。组装质量的关键指标（如N50，重叠群长度分布的度量）在组装质量评估中无关紧要，因为样本中的稀有生物不会被测序reads充分覆盖，因此往往会组装成短的重叠群或保持为未组装的碎片。长读长测序在这些情况下提供了巨大优势，因为数千核苷酸长度的reads提供了更好的组装信息，并且可以跨越许多难以组装的区域，包括含有重复序列和菌株特异性基因内容的区域。虽然配对端Illumina reads较短，但仍可以产生比不成对reads更大的重叠群。

宏基因组组装可以通过将序列reads和重叠群分箱为多个子集来简化，这些子集可以进一步组装。这种分箱可以通过比较重叠群特性——特别是核苷酸组成和相对丰度来实现。由于同一基因组的片段通常具有相似的核苷酸组成模式（即k-mer分布），具有相似分布的重叠群可被认为源自同一来源基因组。基于丰度的分箱方法基于这样的观点：在样本中具有相似丰度的生物应产生具有相同相对丰度的宏基因组重叠群。这些方法使得从环境中重建完整或接近完整的基因组成为可能。例如，Albertsen等（2013）使用差异丰度图谱和四核苷酸频率，将组装脚手架分配到来自废水反应器样本的31个不同的种群箱中，然后组装13个最丰富箱内的reads成为草图基因组。通过这种方法，作者能够从不具特征的门TM7中区分并重建四个高质量基因组。然而，分箱方法受到从短reads中可提取信息量的限制，现有基因组组装工具（如Ray Meta（Boisvert等，2012）和metaSPAdes（Nurk等，2017））的定制宏基因组变体应运而生。

基因注释与同源搜索

在参考序列数据库中搜索同源序列是宏基因组功能和分类注释的基本步骤。通常，只有编码蛋白质或结构RNA（如rRNA和tRNA）的区域才被作为同源注释的目标。宏基因组数据集基因注释的一个明显挑战是，宏基因组reads和重叠群很可能含有开放阅读框（ORF）的片段，可能缺少5'端区域、3'端区域或两者都缺失。在某些情况下，给定DNA序列reads可能没有足够的信息来进行任何注释，但即使存在足够长度的基因片段，也可能缺少正确的起始或终止密码子。虽然并非宏基因组数据集独有，但在宏基因组基因注释中，识别在现有序列数据库中没有已知同源物的新基因的挑战尤其突出。因此，互补方法（如基于密码子使用模式识别ORF）可能很重要。例如，Zhu等（2010）扩展了广泛使用的GeneMark基因注释软件包（见第5章）来开发MetaGeneMark，该软件包将参考微生物基因组的组成统计应用于宏基因组reads。

基于同源的基因注释可以通过多种方式实现。基于Burrows-Wheeler序列比对算法的read比对方法可用于将宏基因组reads和重叠群平铺（tiling）到参考基因组上。在许多情况下，特别是当宏基因组样本中存在新的分类群时，查询序列和参考序列之间的相似性可能太低，无法通过BWA（Li和Durbin，2009）和Bowtie 2（Langmead和Salzberg，2012）等Burrows-Wheeler方法识别。差异更大的序列可以使用BLAST算法套件（Altschul等，1997）识别——具体而言，BLASTN用于直接核苷酸-核苷酸比较，BLASTX用于将参考蛋白质数据库与宏基因组序列的六框概念翻译进行比较（见第3章）。BLASTN的一个优势是它可以识别基因间隔序列以及蛋白质编码基因，因此有可能识别基因组上紧密关联的基因集（通常称为连锁或同源基因），而不是没有位置背景的单个基因。然而，BLASTX搜索是在高度保守的蛋白质序列空间中进行的，这使得BLASTX更适合检测远缘同源物。这种敏感性需要付出显著的代价，因为BLASTX的六框翻译和动态规划元素对于大型数据集与大型参考数据库的比较在计算上非常耗时。最近加速序列比对的方法相对于BLASTX实现了高达四个数量级的加速。在一个这样的例子中，DIAMOND（Buchfink等，2015）被成功用于在单个工作站上在不到3小时内将一组北极永久冻土环境样本与NCBI nr数据库进行比较，而BLASTX需要800,000 CPU小时。DIAMOND通过一系列优化实现这种加速，包括不同的比对种子策略和减少的氨基酸字母表（11种氨基酸而非通常的20种）。

对于高灵敏度搜索，可以使用隐马尔可夫模型（HMM）等方法（见框5.3）。HMM残基频率以及蛋白质中位点特异性插入和删除概率特别适合用于注释短蛋白功能序列模体，因为它们具有更高的灵敏度。HMM通常从参考序列数据库训练，可能对应于蛋白质域或其他功能分组。"宏基因组功能本体论注释"（Functional Ontology Assignments for Metagenomes，FOAM）（Prestat等，2014）是一组超过70,000个HMM，从京都基因与基因组百科全书（KEGG）直系同源群训练，可作为宏基因组序列比较的参考数据库。

分类归属与谱系解析

上述基于同源性的程序产生带有相应功能标签的数据库匹配；如果查询序列和参考序列之间的匹配足够高，则可能为宏基因组序列指定相应的分类标签（如属和种）。对整个宏基因组数据集执行此方法，可用于构建样本的全球分类摘要，并将分类信息精确地分配给特定的reads和重叠群（及其相应的功能信息；见功能预测）。然而，宏基因组数据集对该方法提出了若干障碍。首先，与其他分析一样，缺少参考数据库表示的新分类群将无法在最低分类等级进行分类：相反，目、纲或门等较高级分类等级可能代表可以做出的最精确分类。其次，由于不同类型的基因显示出不同的保守程度，可能可以在种或菌株水平区分某些基因（如快速进化的代谢基因），但无法区分高度保守的基因（如编码核糖体蛋白或16S rRNA的基因）。第三，由于原核基因组大小可能相差一个数量级以上，较大的基因组在样本中会相对于较小的基因组被过度代表，歪曲预测的分类分布。这一限制与16S基因分析中的拷贝数问题类似。最后，像质粒和基因组岛这样的移动遗传元素可以通过横向基因转移过程轻松地在远缘相关生物之间移动，最近被转移到受体的基因可能仍会被归类到供体生物。因此，某些类别的基因必须谨慎对待。

k-mer分解已被许多软件包利用，以实现宏基因组序列的快速分类。根据用于比较分布的方法，基于k-mer的方法可能比序列比对方法快几个数量级。距离计算、高阶k-mer丰度的插值以及朴素贝叶斯（NB）（Rosen等，2011）等机器学习方法都被用于将宏基因组序列的组成与参考序列数据库进行比较。一般来说，这些方法往往比BLAST算法更快，但在分类归属方面精度较低。Kraken（Wood和Salzberg，2014）使用一种替代的k-mer建模和匹配方法，在保持相对于BLAST显著加速的同时实现高精度。Kraken的关键是将序列分解为长（默认31个核苷酸）k-mer：而不是尝试计算图谱之间的距离（对于4^31个k-mer来说这实际上是不可行的），每个已识别的k-mer被视为其自身的潜在分类标记。从参考数据库中的基因组推断预计算的进化树，然后将每个观察到的k-mer映射到所有发现该k-mer的生物的最近共同祖先。例如，如果给定的31个核苷酸序列仅在肠杆菌目观察到，则它将被视为该群的独特标记。宏基因组reads或重叠群被分解为k-mers，然后与参考树进行比较。k-mer集合的证据总和用于识别相应宏基因组序列最可能的来源谱系。在模拟宏基因组数据的试验中，Kraken显示出与MegaBLAST算法几乎相当的灵敏度，同时加速近1000倍。

鉴于宏基因组样本含有16S基因的片段，可以提取这些基因序列并执行分类学分类，以便与标准16S调查进行比较。这种方法的一个显著优势是消除了扩增偏差，因为在宏基因组数据生成中不使用PCR引物。然而，这种方式的分类谱系解析丢弃了几乎所有其他宏基因组数据，并且不同16S基因片段之间的比较可能很困难。此外，16S在扩增子研究中使用的一个关键驱动因素是其扩增的可行性，但宏基因组数据提供了数十个单拷贝且高度保守的核心基因的信息。包含数万个分类学参考基因组序列的基因组数据库允许对这些核心基因相关的分类学模式进行详细研究。

基于子集的方法为执行分类归属提供了另一条途径。这些方法基于一小部分核心基因的注释来生成宏基因组分类摘要，这些核心基因存在于大多数基因组中或基因组的目标子集中。两种广泛采用的方法PhyloSift和MetaPhlAn说明了这些方法之间的对比。PhyloSift（Darling等，2014）使用一组37个广泛分布的蛋白质家族，加上16S基因，这些序列显示出高度的 系统发育一致性。这些序列首先通过与参考数据库的快速序列比对搜索在宏基因组数据集中识别。每个基因的参考集作为模型多序列比对和系统发育树进行维护。一旦识别出匹配的序列，就使用HMM将它们精确比对到模型比对，并使用Pplacer插入参考树。系统发育定位的摘要导致宏基因组分类组成的推断。相比之下，MetaPhlAn（Segata等，2012）采用相反的方法，构建了一个超过400,000个基因的参考数据库，这些基因对特定分支内的基因组是"核心"的，并被排除在该分支外的所有基因组之外。由于基因参考集相对于所有基因的规模较小，宏基因组数据集的同源处理可以非常快速地完成。

当然，如果研究者希望不仅了解"谁在那里"和"他们在做什么"，还希望了解"谁在做什么特定功能"，则必须使用组成评估和序列比对的某种组合，将每个宏基因组reads或重叠群与参考数据库匹配。Kraken通过其独特的组成方法实现这一点，BLAST提供了一种高度敏感但相对较慢的序列比对方法。BLAST的一个局限性是宏基因组序列与数据库的最佳匹配可能不代表正确的分类学分类，这可能是因为序列是新的，或者因为存在许多得分几乎相等的数据库匹配。类似于Kraken和PhyloSift采用的系统发育方法，一些方法使用所有预测蛋白质序列的系统发育映射来进行分类预测。MEGAN使用有效的最近共同祖先映射来估计宏基因组序列的分类等级。

功能预测

虽然"功能"可能是一个难以定义的术语，但在宏基因组学中，它通常指的是微生物组中生物执行酶促反应、与包括宿主在内的其他生物进行生态互作，以及构建重要分子结构（如鞭毛）的能力。功能可以用多种方式分类；例如，Gene Ontology（见第13章）层次结构的顶层将功能分为三类：生物过程（一系列功能，如生化途径）、分子功能（给定酶催化的反应类型）和细胞组分（蛋白质发挥作用的位置，如细胞质或周质空间）。功能也可以在不同组织层次上描述：例如，KEGG可以在包括功能、途径（功能的集合）和模块（途径的集合）的层次上定义功能。总结宏基因组功能的最简单方法是针对参考数据库执行序列比对搜索，并按宏基因组中特定功能的存在与否、相对丰度或多样性来总结搜索结果。然而，这种基本方法有几个局限性。

第一个局限性是蛋白质可能出现假阴性注释。在许多情况下，高度相似的同源蛋白质实际上可能具有不同功能：例如，具有相似氨基酸序列的转运蛋白和外排泵可能作用于不同底物并具有不同反应动力学，使得在没有大型且特征明确的参考序列数据库的情况下很难预测这些蛋白质的分子靶点。同时，宏基因组中的许多预测蛋白质可能匹配功能未经实验验证的假设蛋白质或根本不匹配任何参考蛋白质。因此，这些蛋白质不会对功能摘要提供直接信息。使用不同的参考序列数据库将导致不同的假阳性预测与未注释基因之间的平衡；Swiss-Prot数据库（UniProt Consortium，2018）仅包含手动注释和审查功能序列，产生的功能注释相对较少，但通常质量较高。相反，KEGG数据库（Kanehisa等，2017）具有更高的功能覆盖率，其中大部分未经实验验证或手动审查。因此，KEGG倾向于产生更多不正确的注释。可以使用专门的、经过整理的序列数据库来关注特定功能，包括用于碳水化合物活性酶的CAZy（Cantarel等，2008）和用于抗菌素耐药基因的综合抗生素耐药数据库（Jia等，2017）。

功能注释的另一个问题是因为通路中相对较少的步骤存在，或者因为单个功能出现在多个通路中，而对这些通路进行轻率的分配。朴素预测将产生过多的通路集，其中许多在样本中功能上无关。MinPath（Ye和Doak，2009）被开发用于解决这一局限性，它识别可以覆盖宏基因组中所有注释功能的最小通路集。将MinPath应用于参考宏基因组可将预测通路数量减少多达50%。HUMAnN（Abubucker等，2012）将MinPath作为管道的一部分，用于预测然后过滤预测的功能和通路，并报告通路的存在和相对丰度。

统计关联

与标记基因分析一样，宏基因组学的一个重要目标是发现生物多样性推断模式与环境参数之间的统计关联。分类学关联和共现模式可以与功能多样性和具有不同生态作用的近缘生物相对丰度的变化相结合。Jonsson等（2016）最近综述了用于比较宏基因组样本之间功能分布的统计检验和应用范围。该研究发现，用于评估两个或多个样本之间差异表达的转录分析工具DESeq2（Love等，2014）和edgeR（Robinson等，2010）与标准统计程序（如t检验）相比最为有效。功能数据的可用性也为代谢网络比较分析提供了机会。BiomeNet（Shafiei等，2014）使用无监督贝叶斯方法识别区分宏基因组样本类型的子网络。由于将代谢网络划分为通路可能有些武断，不预设通路特定边界的方法可能对功能变异更敏感。

宏基因组学是一项强大的技术，可以从微生物群落样本生成综合图谱。采样序列的多样性可以揭示关键的菌株水平多样性和变异，上述组装和注释方法已被用于从以前未表征的门中重建基因组。宏基因组分析的另一个有价值的应用是发现具有不同底物或活性水平的新基因变体。宏基因组数据继承了基因组分析的许多局限性，包括短reads组装和基于同源性的功能注释挑战。准确的長读长测序将显著减少组装问题。然而，鉴于长读长测序的成本相对较高，浪费在宿主DNA上的测序工作会产生大量额外成本。宏基因组学虽然非常有效地提供微生物组样本的功能横截面，但不提供关于对环境刺激或变化的转录反应的证据。与标记基因分析一样，可能很难识别推断存在于微生物群落样本中的哪些微生物是群落的"真正"成员——即代谢活跃并与其他生物互动的成员——与那些在给定生境中短暂存在的成员。做出这些区分需要针对考虑微生物组组成成分的功能和生态作用的方法。（Hanage 2014）概述了宏基因组数据分析中的一些数据解释挑战。

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图16.8 LEfSe中可视化两组肠道微生物组样本之间的差异。此例中，来自有（绿色）或无（红色）蠕虫定植个体肠道的操作分类单元的系统发育分布（a）。红点表示在蠕虫阴性组中被过度代表的系统发育群和特定分类群，而绿色分组表示相反情况。（b）根据线性判别分析（LDA）评分的效应量大小。来源：Lee等（2014；doi.org/10.1371/journal.pntd.0002880.g003）。

Ch16 Metagenomics and Microbial Community Analysis / Other Techniques to Characterize the Microbiome

Other Techniques to Characterize the Microbiome

表征微生物组的其他技术

所谓的 multi-omic datasets（多组学数据集）旨在解决 marker-gene analysis（标记基因分析）和 metagenomic analysis（宏基因组分析）的一些局限性。例如，这类数据集包括转录本表达和蛋白质表达的测量。由相似宏基因组谱所反映出的稳定多样性，可能掩盖微生物组在药物处理、快速温度变化、昼夜模式以及其他环境参数响应中的显著转录变化。其他方法，如 metabolomics（代谢组学），追踪的是微生物组的代谢输出，而不是分子序列数据（见第 14 章）。最后，一些用于解析宏基因组复杂性的方法，可以更精确地表征微生物组的子集以及单个组成成员。Franzosa et al. (2015) 对这些多组学技术中的许多方法进行了详细概述。

Metatranscriptomic datasets（宏转录组数据集）最早在 21 世纪初得到开创性应用，其利用 RNA-seq 等方法表征全球范围的微生物基因表达。Metatranscriptomics（宏转录组学）使用 differential expression analysis（差异表达分析）来识别表达基因以及样本之间的差异。DESeq2 (Love et al. 2014) 是一种常用程序，用于在多个样本之间识别具有差异丰度的转录本；其方法是先将序列 reads 映射到参考序列，然后计算差异的 fold change（倍数变化）和 statistical significance（统计显著性）。Metaproteomics（宏蛋白质组学）绕过核苷酸测序，使用蛋白质消化和质谱分析来识别可映射到参考基因组序列和宏基因组序列的片段。蛋白质组学技术（见第 11 章）可以是 discovery based（发现型）的，即试图获取所有蛋白质是否存在的信息；也可以是 targeted（靶向型）的，即选择性监测一小部分蛋白质。后者能够提供关于某些蛋白质的更精确信息，这些蛋白质可能对群落功能至关重要，或可作为候选 biomarkers（生物标志物）。

在许多环境中，微生物的一个关键作用是产生 metabolites（代谢物），这些代谢物可作为其他生物的能量来源。通过其酶促活性，微生物还可以转化细胞外化合物，从而改变这些化合物的功能和作用。Meta-metabolomics（宏代谢组学）识别系统中由不同代谢物生成的独特光谱模式，然后通过与参考数据库比较，将这些模式匹配到已知代谢物。代谢物谱的表征方式是识别 spectral peaks（光谱峰），并使用 XCMS (Smith et al. 2006) 等软件将这些峰与参考光谱数据库进行匹配，如第 14 章所述。

Stable isotope probing（稳定同位素探针技术）可用于追踪群落成员之间的代谢物流动。代谢过程中广泛使用的原子同位素，如 13C 和 15N，可用作 tracers（示踪剂）；当某一生物获得这些同位素时，会将其整合进自身生物分子中，随后再转移给其他生物。Berry et al. (2013) 使用稳定同位素探针技术追踪代谢物从小鼠宿主流向肠道微生物群的过程，并使用 fluorescent in situ hybridization (FISH，荧光原位杂交) 来测量特定标记基因的表达，从而确定 Akkermansia muciniphila 和 Bacteroides acidifaciens 是宿主蛋白的重要消费者。

鉴于许多环境具有高度多样性，一些微生物分类单元在宏基因组样本中代表性不足是不可避免的，这会导致只能获得部分组装结果，甚至无法组装，并造成表征不完整。对微生物组样本进行细分或亚采样，可以提高目标分类群的回收率。即使单个 isolates（分离株）不能在纯培养中生长，在许多情况下仍可培养多样性较低的 enrichment cultures（富集培养物）。如果某一富集培养物无法进一步纯化，那么其中相应的较小微生物集合可能存在 obligate interactions（专性相互作用），例如代谢途径中的 cross-feeding（交叉供养），以及 oxygen scavenging（清除氧气）等环境功能。微生物组也可以通过 cell sorting（细胞分选）进一步划分为更易处理的子集。微生物可以按大小进行分离，也可以基于其他性质，使用 FISH 靶向目标基因来进行划分。这种方法曾被用于发现并描述此前未被检测到的、来自地中海最深处的超小型 Actinobacteria（放线菌门细菌）(Ghai et al. 2013)。在极端情况下，分选可以获得单个细胞，随后可使用 multiple displacement amplification (MDA，多重置换扩增) 等单细胞技术对其进行测序。虽然 MDA 不能产生完整的基因组序列，并且容易受到污染，但所获得的序列仍具有信息价值，并可作为组装更多宏基因组数据的 scaffolds（支架）。

近年来，细胞培养技术的进展促进了 “culturomic”（培养组学）方法的发展。在这种方法中，微生物组样本被转移到一系列不同类型的培养基上，不同的生长条件会有利于不同微生物的生长。将微生物组中的多种谱系分离培养，可以开展实验筛选和测试，从而补充分子层面的分析。

结合不同类型数据的研究能够揭示微生物组中调控过程及其他过程的作用。虽然细菌中的基因表达通常被认为是在转录水平实现的，但近期研究提示，post-translational modification（翻译后修饰）可能具有尚未被充分认识的调控作用。Chen et al. (2016) 整合了 1000 多个宏转录组和宏蛋白质组数据集，提出在 Mycoplasma genitalium 中，基因组大小与 post-transcriptional regulation（转录后调控）重要性之间存在反向关系。McHardy et al. (2013) 结合宏基因组分析和宏代谢组分析，识别出肠道微生物组中特定属的存在与所观察到的特定代谢物之间的相关性。在其他观察结果中，他们发现 Roseburia 和 Faecalibacterium 与预测的 short-chain fatty acid（短链脂肪酸）合成酶之间存在强关联；鉴于短链脂肪酸在炎症和免疫中具有重要作用，并且可作为 colonocytes（结肠细胞）的营养来源，这一发现突出了这些属在人类肠道中的重要性。

Ch16 Metagenomics and Microbial Community Analysis / Summary + Internet Resources + Further Reading + References

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本章小结

不同生境中微生物组的评估与表征工作面临巨大挑战，这从已开发出的多种微生物采样与分析方法中便可窥见一斑。微生物组分析不仅继承了微生物基因组分析中的所有挑战与局限，还叠加了高多样性、时间动态不稳定、以及分类单元与生态单元不确定等难题。采样与分析过程中引入的偏倚往往会歪曲研究结果。然而，过去十年间生物信息学技术的快速发展已产生了稳健可靠的研究结论，并开辟了微生物组结构与功能研究的新领域。

微生物组采样与分析技术的预期改进将深化我们对多种环境中微生物群落的认识。在技术层面，长读长DNA测序将革新宏基因组数据的组装与分析工作。虽然长读长序列也能增强标记基因分析的稳健性，但随着鸟枪法测序和单细胞测序方法的成本持续降低、可行性不断上升，16S rRNA基因分析法的热度能否延续尚待观察。基因组参考数据库（包括从宏基因组数据中组装获得的基因组）的增长，将有助于提高群落结构推断的分类分辨率。然而，未来五年内最重要的转变将是元组学技术及其数据集的采纳与整合日益增多，从而将遗传潜能与代谢活性、群落成员间的明确联系耦合起来。这些方法的交叉融合将是近期生物信息学技术关注的重点领域。

网上资源

主要数据资源

功能信息资源

标记基因分析工具

宏基因组分析工具

延伸阅读

Franzosa, E.A., Hsu, T., Sirota-Madi, A. et al. (2015). Sequencing and beyond: integrating molecular 'omics' for microbial community profiling. Nat. Rev. Microbiol. 13: 360–372. 本综述展望了新兴的DNA依赖型及互补性元组学方法，及其对未来微生物组研究的启示。

Hanage, W.P. (2014). Microbiome science needs a healthy dose of scepticism. Nature 512: 247. 本文简要阐述了宏基因组数据解读中的若干关键陷阱，以及如何从数据中识别具有生物学意义的变化趋势。

Sczyrba, A., Hofmann, P., Belmann, P. et al. (2017). Critical assessment of metagenome interpretation – a benchmark of metagenomics software. Nat. Methods 14: 1063. 最近一项对宏基因组数据组装和分类归属技术的比较评估研究。

Sharpton, T.J. (2014). An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front. Plant Sci. 5: 209. 综述了宏基因组分析的各种技术方法，列举并引用了广泛的分析策略。

参考文献

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Altschul, S.F., Madden, T.L., Schäffer, A.A. et al. (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402.

Baas-Becking, L.G.M. (1934). Geobiologie; of inleiding tot de milieukunde. [In Dutch.]. The Hague, Netherlands: WP Van Stockum & Zoon NV.

Baichoo, S. and Ouzounis, C.A. (2017). Computational complexity of algorithms for sequence comparison, short-read assembly and genome alignment. Biosystems 156: 72–85.

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Berry, D., Stecher, B., Schintlmeister, A. et al. (2013). Host-compound foraging by intestinal microbiota revealed by single-cell stable isotope probing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110: 4720–4725.

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