Biological Networks and Pathways

Ch13 Biological Networks and Pathways / Introduction

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引言

生物学家面临的一项重大挑战，是通过整合分子与细胞生物学各领域的现有信息，构建准确的细胞模型，并利用该模型生成可检验的假说，从而理解细胞的运作机制。特别是，如今对生物样本中 DNA、RNA 和蛋白质的常规全面测量所产生的数据量呈指数级增长，为发现新的生物功能、基因型–表型关联以及疾病致病的底层机制提供了丰富的机会。令人振奋的是，如利用 RNA-seq 方法测量转录本表达水平（第10章）和通过质谱鉴定蛋白质（第11章）等实验方法，灵敏度不断提高，能够在生物样本中检测数以万计的分子，且成本不断降低。这导致了关于生物系统的海量数据被收集起来。然而，对所有这些数据的分析与解读是许多研究者面临的一大挑战。分析结果往往列出大量基因，若要通过人工文献检索来解读这些基因，工作量可能大到难以实际执行。生物通路与网络分析为应对这一数据整合、建模与解读的挑战提供了一种有效途径。通路与网络分析方法利用关于通路（代表详细的生物过程）以及网络（通常代表分子相互作用网络，如蛋白质–蛋白质或蛋白质–DNA 相互作用网络）的信息，辅助数据解读。

为了说明通路与网络分析能够揭示生物机制中哪些有价值的洞见，来看两个成功案例。通路分析被用于鉴定由 polycomb 抑制复合体（PRC2）介导的组蛋白与 DNA 甲基化，作为室管膜瘤（ependymoma，在儿童脑肿瘤中常见）的首个理性治疗靶点（Mack et al. 2014）。该通路可被现有药物靶向，例如 5-azacytidine，该药以同情用药（compassionate use）方式用于一位终末期患者，并阻止了肿瘤的快速转移性生长。这一有前景的结果促成了两项临床试验的启动。在另一案例中，对自闭症中罕见拷贝数变异（copy number variant）数据的通路分析鉴定出数条受基因删除影响的显著性通路，而仅对单个基因或基因组位点进行病例–对照关联检验时，只发现了少数显著性结果（Pinto et al. 2010）。纳入通路信息提升了分析方法的统计功效（statistical power），并在上述两个疾病领域中揭示了原本隐藏的生物学方面。

简要回顾历史背景：通路信息学（pathway informatics）领域始于1990年代，以代谢通路的计算表示方面的研究为开端（Karp and Riley 1993）。生物网络信息学在2000年代初被引入，其推动因素是首批大规模细胞蛋白质–蛋白质和遗传相互作用图谱的出现（Ito et al. 2000; Schwikowski et al. 2000; Walhout et al. 2000; Tong et al. 2001）。针对大基因列表的通路富集分析（pathway enrichment analysis），如今已成为最流行的通路分析类型，于1990年代末被引入（Tavazoie et al. 1999），并在2000年代中期得到推广。

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虽然已相当成熟，通路与网络数据仍在持续增长，该领域也仍在受到大量研究。鉴于该领域不断发展变化的性质，本章覆盖了一系列有用且可免费获取的工具与方法，同时也聚焦于应适用于未来新资源的基础理论。通用理论先行介绍，然后是工具。第一个主题是通路与分子相互作用数据，包括数据的来源及其表示、存储与访问方式。第二个主题是通路与网络可视化与分析，涵盖基本概念以及最流行、最有用的分析方法与工具。所选取的分析方法旨在说明将通路与网络数据与其他数据类型整合后可以回答的有趣生物学问题，但并未深入覆盖该领域的所有方面。因此，在全章相关之处，提供了指向在线描述以及其他通路与网络相关数据库和软件工具列表的指引。

通路与分子相互作用映射：实验与预测

在解释通路与分子相互作用数据的存储与使用方式之前，了解存在哪些类型的数据以及这些数据如何被收集是十分重要的。理想的生物学实验会告诉我们什么？答案不亚于一切：哪些分子在细胞中的什么时间、什么位置存在，有多少分子，它们与哪些分子相互作用，以及相互作用的动态变化。理想情况下，人们不仅希望获取细胞周期及其他基于时间的细胞过程中的这些信息，还希望在所有重要的环境条件和所有已知疾病状态下获取这些信息。为帮助阐明细胞系统并确定哪些细胞组分参与其中以及它们如何组合在一起，已发明了广泛的生化、分子生物学和遗传学实验方法。然而，当前的实验方法虽然有用且逐年改进，仅触及细胞或组织内部真实发生的表面。它们通常只覆盖一个层面的信息（例如蛋白质–蛋白质相互作用），且大多数是不完整的（Pouliot and Karp 2007; Braun et al. 2009）。在使用通路与网络信息时，这一点值得牢记。

代谢通路是最早的通路模型，由一系列酶促反应组成。酶促反应已被研究了数个世纪，最初考察的是诸如发酵等过程。实验性地映射代谢（主要由蛋白质酶组成）的基本原理，是鉴定一个酶促过程（例如酵母中葡萄糖转化为乙醇），并逐步纯化细胞提取物以找到参与其中的酶。验证步骤是检验纯化后的酶能否将给定底物转化为产物。这一过程需要蛋白质分离与纯化技术，以及分子鉴定方法，以识别参与反应的酶、辅因子、底物和产物。

该领域的重要进展得益于各种形式的色谱法、凝胶分离技术、核磁共振（NMR）和质谱（见第11章和第14章）。色谱与凝胶分离的基本原理是，分子混合物可根据各组分的理化性质（如大小或电荷）进行拆分。NMR 与质谱可分别基于原子距离测量和质量，直接鉴定小分子和蛋白质。酶学家进一步表征酶的反应速率（动力学）以及催化中涉及的详细酶促机制（Voet and Voet 2004）。

与代谢通路不同，信号转导通路涉及更高比例的直接蛋白质–蛋白质关系，如一个蛋白质被另一个蛋白质磷酸化（由蛋白激酶催化），可通过蛋白质–蛋白质相互作用检测方法来映射。其他分子类型，如脂质和小分子，也参与信号转导，因此蛋白质相互作用本身只能反映部分情况。许多用于测定蛋白质–蛋白质

Ch13 Biological Networks and Pathways / Pathway and Molecular Interaction Mapping: Experiments and Predictions

Pathway and Molecular Interaction Mapping: Experiments and Predictions

在过去几十年中，人们开发了多种实验方法来鉴定通路与分子相互作用。其中一类广泛使用的实验基于共纯化（co-purification），其原理即前述方法。强相互作用的蛋白会以复合物的形式被纯化出来，随后可用更剧烈的纯化条件将该复合物进一步拆解，最终分离并鉴定复合物的各组分。值得注意的是，这意味着蛋白质复合物的定义取决于所使用的纯化条件，而纯化条件衡量的是蛋白质–蛋白质相互作用强度的连续谱。现代生化共纯化的一个实例是利用亲和层析（affinity chromatography）从细胞提取物中纯化蛋白质复合物，然后用质谱（mass spectrometry）鉴定所得复合物的组分（见 Chapter 11）。

酵母双杂交（Yeast two-hybrid）方法常用于确定两种蛋白质是否能够相互作用。将转录因子的激活结构域和 DNA 结合结构域分别连接到两个待测蛋白上。如果两个待测蛋白发生相互作用，激活结构域和 DNA 结合结构域也会随之结合，形成有功能的转录因子，从而驱动工程化报告基因的表达。报告基因的存在即表明发生了结合。目前已有大型项目正在利用该技术全面绘制人类细胞和组织中的相互作用图谱（Luck et al. 2017）。

另一种常用方法是分子交联（molecular cross-linking），这是一种实验方法：将一种具有两个反应性末端、长度确定的线性分子加入含有潜在复合物的混合物中，使距离相近的蛋白质发生交联；能够检测到相互作用的距离取决于所用交联剂的长度（Li et al. 2017）。由于蛋白质复合物被共价键连接在一起，而不仅仅是静电结合，后续的纯化和复合物鉴定会更加容易。此外还有许多其他测定蛋白质–蛋白质相互作用的实验方法（Phizicky and Fields 1995）。每种实验各有优缺点，必须采用多种类型的实验来提高结果在体内（in vivo）相关性的可信度。

由于这类实验通常昂贵且耗时，许多计算方法已被开发用于预测通路和相互作用。这些方法很少能达到详细"湿实验"（wet lab）分析的精度，因此应将其视为需要实验验证的假说。然而，这些方法能够快速进行预测，且通常具有较高的准确率；这在实验不可行的情况下尤为有用，例如在难以进行实验研究的生物体中。

代谢通路（metabolic pathways）可以通过直系同源（orthology）关系将一个生物体中已知通路的蛋白质（酶）映射到另一个生物体来准确预测，并在此基础上应用额外步骤来构建通路。这是可行的，因为代谢通路在物种间通常高度保守，因此可以做出相当准确的预测。预测代谢通路可使用多条规则。例如，关键反应必须存在。属于多个通路的酶不能被毫无歧义地视为某条通路存在的标志。然后通过检查通路的输入和输出质量是否平衡来验证通路。如果通路不平衡或因缺少酶而断开，则可在被注释的基因组中更彻底地搜索这些酶，这一过程称为"漏洞填补"（hole filling）。与基于直系同源的预测方法一样，当所使用的实验已知通路来自与被注释物种亲缘关系较近的物种时，重建结果会更好。BioCyc 数据库家族（见 EcoCyc 一节）所使用的 PathoLogic 算法（Karp et al. 2011）正是利用这一方法，基于某生物体的基因组预测该生物体的完整通路数据库。该预测系统的最终结果是一个质量良好的代谢模型初稿，但仍需人工审校（manual curation）来修正所得通路中的错误，以获得高质量模型。

信号传导和基因调控通路目前无法以这种方式准确预测，因为它们远不如代谢通路保守。

分子相互作用可以使用多种方法进行预测。预测的分子相互作用理想情况下应代表直接的物理结合，但大多数分子相互作用预测方法并不能保证预测出的是直接物理相互作用。例如，预测结果可能包含"功能性相互作用"（functional interactions），即同一通路内蛋白质之间或功能相似基因之间的相互作用。这仍然是有用的，因为通路内或功能相关蛋白质之间发生相互作用的可能性高于随机选取的蛋白质对。

多种模式已被发现与蛋白质–蛋白质相互作用相关联，并可用于预测这些相互作用。具有相似转录谱（transcription profiles）的基因被证明比预期更常发生物理相互作用（Ge et al. 2001; Grigoriev 2001; Jansen et al. 2002），而且蛋白质表达谱（protein expression profiles）的这种效应更强（Kim et al. 2014）。蛋白质相互作用也可以跨物种映射。如果两种蛋白质在某一生物体中的相互作用已知，就有可能成功预测它们的直系同源蛋白在另一生物体中也会结合（Matthews et al. 2001; Tien et al. 2004），不过这种模式对保守蛋白质和蛋白质复合物更为相关（Brown and Jurisica 2007）。

蛋白产物发生物理相互作用的基因有时在染色体上保持彼此相近的物理位置（Tamames et al. 1997; Dandekar et al. 1998; Overbeek et al. 1999）。该现象最典型的例子是细菌和古菌中的操纵子（operons），其蛋白产物在同一生物学过程中发挥作用的基因被转录在同一条多顺反子信使 RNA（polycistronic mRNA）上。基因组演化的两大主要驱动力是基因产生（gene genesis）和基因丢失（gene loss）（Snel et al. 2002）。一对基因在许多不同物种中保持在一起，往往代表了将它们维持在一起的协同演化努力，正如它们可能在同一生物学过程中发挥作用的情况一样。系统发育谱（phylogenetic profiles）展示了基因在来自多个物种的完整基因组中的有无（Ouzounis and Kyrpides 1996; Rivera et al. 1998; Pellegrini et al. 1999），具有非常相似系统发育谱的基因对是物理相互作用的候选者。

基因融合事件（gene fusion event）是指两个独立的父本基因发生物理融合，成为一个单一的多功能基因。这是基因共定位的终极形式：相互作用的基因不仅在基因组中保持相近位置，而是作为单一实体物理连接在一起。有观点认为，这些事件背后的驱动力是降低多个相互作用基因产物的调控负荷（Enright et al. 1999）。因此，基因融合事件提供了一种通过计算来检测蛋白质间功能相互作用和物理相互作用的方法（Enright et al. 1999; Marcotte et al. 1999）。

上述每种计算方法各有优缺点。基因邻近（gene neighborhood）和系统发育谱方法随着所用完全测序基因组数量的增加，预测效果更好。基因融合方法预测效果好但不可推广，因为实际检测到的融合事件数量通常很少。这些基于基因组的方法在原核生物基因组中往往效果更好。基因共表达分析（gene co-expression analysis）的预测能力较弱。所有方法在使用更多数据（如基因组和基因或蛋白质表达谱）时都能提高可靠性。解决这一问题的一种途径是利用机器学习方法整合所有可用预测方法的数据。每种证据来源根据其准确预测已知相互作用的能力被自动加权。该类型的首个蛋白质–蛋白质相互作用预测方法使用贝叶斯网络机器学习来预测芽殖酵母中的蛋白质相互作用（Jansen et al. 2003）。给定所有来源中关于某蛋白质相互作用的可用证据，可以计算出该相互作用的概率值。以这种方式预测的蛋白质相互作用已被证明与高通量实验技术同样可靠，且覆盖更大比例的基因（Kotlyar et al. 2015）。近期方法扩展了这一途径，纳入了更多证据来源，包括能够预测蛋白质–蛋白质相互作用结合位点的来源，至少对某些蛋白质类别如此（Jain and Bader 2016）。

Ch13 Biological Networks and Pathways / Pathway and Molecular Interaction Databases: An Overview

通路与分子相互作用数据库：概述

鉴于来自小规模和大规模实验的通路与分子相互作用网络信息在广度和深度上都极为丰富，且这些信息对于理解生物系统的运作方式具有重要价值，因此已经建立了多个数据库来表示和存储这些信息，也就不足为奇了。事实上，在 Pathguide 链接目录（Bader et al. 2006）中列出了超过 700 个通路与分子相互作用相关的数据库资源。这些资源在形式和内容上差异很大，包括功能完备的通路数据库、专注于蛋白质–蛋白质或其他分子相互作用的数据库，以及特定物种或疾病的通路数据库。本节首先介绍通路和相互作用网络在数据库中如何定义和表示的一般理论，然后介绍一些最大的、最常用的和可免费获取的数据库资源。

在计算机中表示生物通路和相互作用网络

细胞是一个由分子构成的大型、复杂且动态的连接网络。由于其复杂性，将细胞组织为亚结构和子系统（如细胞器、通路和复合物）有助于理解其整体结构。虽然细胞器和复合物可以在显微镜下直接观察，但通路无法直接观察，因此重要的是认识到通路是人类构建的模型，是更大的、相互连接的分子相互作用网络的一部分。通路可以被视为一系列分子相互作用和反应（通常形成网络），用于执行某种特定过程。通路通常基于已识别的生化或信息处理现象来定义。例如，一系列代谢反应可以从环境中摄取一个代谢物开始，然后不可逆地将其转化为其他物质。例如，糖酵解通路（glycolysis pathway）分解葡萄糖以产生能量（三磷酸腺苷，adenosine triphosphate）。此外，信号转导通路中一系列步骤的信号传播可以被证明遵循特定通路，例如当一个配体（ligand）结合到细胞表面受体后，信号通过细胞质中的蛋白激酶级联（protein kinase cascade）传播到细胞核，从而激活转录响应。在这些情况下，通路的起点和终点通常通过在刺激或扰动后观察易于检测的表型来定义，例如在用肽类生长激素刺激细胞后观察基因表达。

通路可以分为不同类型，每种主要类型在现有的各种通路数据库中通常有不同的计算表示方式。主要的通路表示类型包括代谢通路、信号转导通路（也称为细胞信号通路）和基因调控通路。代谢通路通常由一系列化学作用及其化学结果来定义，目的是将一种分子物质转化为另一种（例如糖酵解）。信号转导通路通常由结合事件（例如蛋白质–蛋白质相互作用）来定义，有时涉及化学作用（例如磷酸化事件），目的是将信息从细胞内的一个位置传递到另一个位置。表皮生长因子受体通路（epidermal growth factor receptor pathway）是信号转导通路的常见示例，它将信息从外部激活的细胞表面受体传递到细胞核，以响应外部信号而改变基因表达。最后，基因调控网络涉及转录因子或其他调控因子激活或抑制基因（包括其他转录因子）的表达。每种通路类型通常使用特征性的表示风格来描述，其中包括对更复杂生物过程的便捷简写记法。例如，在基因调控通路中，基因调控被抽象为单一关系（例如"NOTCH regulates HES1"），而如果以代谢通路的方式表示，则将是一个大型的多步骤过程。当试图整合来自不同来源、表示方式不同的通路时，这可能导致困难。因此，了解数据库如何表示其所存储的信息对于查询数据库和理解其优势与局限性至关重要。

当分子相互作用是通路的一部分时，它们被表示为蛋白质复合物形成事件。由于高通量实验方法可以映射数千种分子相互作用（其中许多不属于通路），因此为这些相互作用开发了单独的便捷简写表示方式。分子相互作用可以发生在任何分子类型之间。相互作用通常表示为二元（成对）关系，尽管有时相互作用涉及两个以上的参与者。相互作用的类型根据参与者类型自动定义。例如，两种蛋白质之间的相互作用即为蛋白质–蛋白质相互作用（protein–protein interaction）。分子相互作用表示方案包括参与分子的类型和定义，以及用于确定该相互作用的实验细节。这也是通路与相互作用的另一个区别——通路描述的是基于许多实验建立的模型，通常不随通路一起描述实验细节；而分子相互作用通常由单个实验直接确定，这些实验提供了关于相互作用数据质量水平的重要信息。分子相互作用的集合被表示为网络（见 Network Visualization）。相互作用组（interactome）被定义为细胞或生物体中所有相互作用的集合，类似于"基因组"（genome）的概念。

通路与相互作用数据表示的考量

由于表示通路和相互作用的方式有很多，回顾一些基本的数据表示原则是有益的，以便更好地理解为什么表示这些信息相比于例如生物序列（见第 1 章）如此复杂。表示系统（也称为数据模型或抽象）是一种发明，可用于描述和组织一组信息。同一类型的信息通常可能有多种不同的表示方案，两个独立承担发明抽象任务的人很容易创建不同的系统，尤其是对于复杂且部分未定义的生物信息（如通路）。必须就单一表示方案达成一致后才能用于数据交流，尽管这样的决定需要权衡多种利弊。理想的表示系统能够紧凑且高效地描述对系统用户有用的确切信息，促进具有相同广泛共同知识的人员（例如特定子领域的科学家，他们都能理解该领域的术语和概念）之间的交流。之所以能够实现紧凑性，是因为共同知识可以被视为理所当然的，因此不必在每次交流信息时都明确表示。这种紧凑性可以极大地减少交流时间和精力，使其非常有用。然而，使用紧凑表示在不共享相同共同知识的人群之间进行交流效果并不理想。这些人除非将共同知识明确表示出来，否则将难以相互理解。这种情况在科学界不同子领域的人员交流时经常发生。类似地，未编程大量定义共同知识规则的计算机程序通常无法正确"理解"非常紧凑的表示，需要额外编码信息和逻辑才能执行诸如查询或可视化紧凑数据等操作。

一个相关的权衡是表示的简单性与复杂性之间的取舍。捕获数据基本属性的简单模型的优势在于易于创建、理解和使用，但它无法表示关于系统的所有可能已知的细节。复杂模型可能能够表示所有已知信息，但在某些情况下可能过于笨重而无法实用。生物系统中许多可能有用的表示方面会显著增加表示方案的复杂性，例如详细程度、上下文以及追踪原始信息来源（其来源信息，provenance，下文将进一步讨论）。以下分别讨论每一个方面。

在数据建模中增加详细程度对于在不同知识或理解水平上表示数据是有用的。当相关细节已知时，详细的数据模型应该能够表示它们。在包含多个详细程度的模型中，可以选择在低、中或高详细程度表示相同的信息。根据目标不同，可能需要更多或更少的细节。例如，我们可能知道一个蛋白质磷酸化事件是由酪氨酸激酶在特定氨基酸位置催化的。或者，研究蛋白质相互作用网络全局性质的人可能只对一种蛋白质与另一种蛋白质相互作用这一事实感兴趣，而认为翻译后修饰的信息是干扰性的。增加生物知识的复杂性……

Ch13 Biological Networks and Pathways / Pathway Databases

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通路数据库

在细胞图谱的表示中，细节的层次可以在时间和空间的极大跨度（尺度）范围内加以考虑，这意味着组织层级中的每一层可能都需要自己的抽象体系。以空间尺度为例，细胞的分子部件已有广泛建立的表示体系，例如蛋白质序列的 20 字母氨基酸编码，以及三维蛋白质结构中的原子、键长（以埃为单位，10⁻¹⁰ m）和原子连接关系。这两种抽象体系都不能很好地描述细胞的更大亚结构，例如细胞核或完整细胞（以微米为单位，人类神经元甚至可达米的尺度）。类似地，在时间尺度上，生化反应中超快的电子流动，以阿秒（10⁻¹⁸ s）为单位测量，在已知时可以被描述，但任何用于描述电子流动的实用抽象体系，都不适用于描述以分钟到小时为尺度的细胞周期事件。

背景信息十分重要，因为分子相互作用和反应依赖于参与分子在允许条件下的存在，例如在同一细胞的同一时间、同一位置出现。同一组参与分子在不同细胞、不同发育阶段或不同生物体中，反应可能发生也可能不发生。类似地，捕获所表示的通路知识的实验证据，以及定义通路所用的信息来源，也是有意义的。这种知识追踪信息称为溯源（provenance），简单来说就是来源与真实性的证明。描述背景、证据和溯源会增加表示模型的复杂性。

Reactome

Reactome 是一个经人工审校的人类通路数据库（Fabregat et al. 2018）。Reactome 采用生化范式来表示通路，将通路建模为不同类型事件的集合。Reactome 是最大的人类通路数据库之一，涵盖信号传导、代谢、基因调控和疾病通路；它还包含了超过半数人类蛋白质组的通路信息。每条通路都有手工绘制的图形展示可供浏览（Figure 13.1）。数据可下载为多种格式，各种通路分析和查询系统均可免费使用。

EcoCyc

EcoCyc 是一个基于文献推导并经人工审校的大肠杆菌（Escherichia coli，菌株 K12）代谢百科全书（Keseler et al. 2017）。它是所有物种特异性代谢通路数据库中覆盖最全面的（Figure 13.2）。MetaCyc（Caspi et al. 2018）是另一个基于文献推导、经人工审校的数据库，覆盖广泛的生物类群；它包含数千个物种的通路信息，包括微生物、植物和动物，其中大肠杆菌的覆盖最为丰富。BioCyc 是一个通路数据库集合，包含 EcoCyc 和 MetaCyc，以及利用 PathoLogic 算法（Karp et al. 2011）对数千个已测序基因组生物（包括人类）做出的额外代谢通路预测，如"通路与分子相互作用映射：实验与预测"一节所述。EcoCyc 和 MetaCyc 可免费获取，而 BioCyc 中其余数据库的访问需要订阅，有时可通过大学图书馆获得。Pathway Tools 软件可供学术用户免费下载，可用于为新测序基因组创建代谢通路数据库。一些数据库已使用 Pathway Tools 来审校其自身物种特异性的通路数据库（Evsikov et al. 2009）。

Figure 13.1 Reactome 数据库通路视图。中央视图展示通路参与者，如蛋白质、基因和复合物，各以方框表示。它们参与的反应以各种类型的连接线表示。底部面板展示主视图中被选中参与者的信息，可通过点击选择。被选中的参与者以黄色高亮，反应以棕色高亮。主窗口中某些参与者方框上的红色圆圈中的数字表示涉及这些参与者的物理相互作用已可用但未显示。点击红色圆圈可切换这些相互作用的显示与隐藏。左侧面板展示 Reactome 中所有通路的层级组织视图。

KEGG

京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路数据库包含经人工审校的代谢、信号传导和疾病通路（Kanehisa et al. 2002）。酶促反应、酶、小分子和基因的信息也可获取。通路以可搜索和可点击的图像形式提供，称为图谱（maps），这是 KEGG 最为人所知的特点（Figure 13.3a）。通路图谱可描绘代谢、调控通路和大型复合物（如核糖体）、疾病相关基因集以及其他基因集合。每种类型的图谱有自己的图形表示风格。大多数代谢通路图谱是参考图谱（reference maps），描绘的是通用通路（generalized pathways）。通用通路并非物种特异性，因此可能永远不会在单一物种中完整出现。物种特异性图谱通过将参考通路以直系同源（orthology）关系映射到给定物种而自动生成（Figure 13.3b）。

KEGG 通路图谱链接到多种底层 KEGG 数据库，包括用于酶、反应和化合物的 LIGAND 数据库，以及基因组信息。通路可通过 KEGG 网站进行搜索和浏览。各相互链接的 KEGG 数据库可通过万维网免费访问，但下载需要许可证。

Ch13 Biological Networks and Pathways / Molecular Interaction Databases

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1. Molecular Interaction Databases (chapter header)
2. Figure 13.2 caption about EcoCyc
3. BioGRID subsection
4. IntAct subsection
5. Figure 13.3 (a), (b), (c) captions about KEGG and BioCyc pathway reconstruction

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1. Molecular Interaction Databases (chapter header)
2. Figure 13.2 caption about EcoCyc
3. BioGRID subsection
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分子相互作用数据库

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Figure 13.2 EcoCyc 数据库的大肠杆菌（Escherichia coli）代谢细胞总览图。中央视图展示了总览图的放大局部。节点代表代谢物分子，连线代表反应。选中分子或反应后会以红色高亮显示，并弹出包含进一步描述的信息框。顶部和右侧工具栏与菜单提供指向 EcoCyc 及相关数据库（如 BioCyc）中多种功能的链接。

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BioGRID

Biological General Repository for Interaction Datasets，即 BioGRID，收录了人工审编的蛋白质-蛋白质相互作用、遗传相互作用以及多种物种的化学关联（Chatr-Aryamontri et al. 2017）。BioGRID 以基因为中心组织数据，即网站围绕单个基因呈现相互作用信息（Figure 13.4）。用户可搜索感兴趣的基因；对每个基因，物理相互作用（即蛋白质-蛋白质相互作用）、遗传相互作用（如合成致死，synthetic lethal）和化学相互作用（如抑制，inhibition）以表格形式呈现，并附带每项相互作用的实验证据。蛋白质翻译后修饰位点及基本基因描述信息亦可获取。数据以 Proteomics Standards Initiative–Molecular Interactions（PSI-MI）XML 和制表符分隔文本格式免费提供（见"通路与分子相互作用的标准数据格式"一节）。

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IntAct

IntAct 由欧洲生物信息学研究所（European Bioinformatics Institute）维护，是一个蛋白质相互作用数据库，包含人工审编数据和用户提交数据。数据库记录围绕相互作用、实验和文献组织，并提供图形化网络浏览器（Figure 13.5）。IntAct 数据模型与大多数其他蛋白质-蛋白质相互作用数据库的一个区别在于：相互作用可以包含两个以上的参与者。使用集合存储相互作用的优势在于，它们可以表示源自蛋白质组学的蛋白质复合物数据——在纯化实验中共纯化的一组蛋白质已知，但这些实体之间的直接物理相互作用可能未知（Gavin et al. 2002; Ho et al. 2002）。使用集合的劣势在于，包含两个以上参与者的相互作用数据必须映射为成对相互作用才能进行网络可视化与分析。这通常采用"辐条"（spoke）扩展方式实现，即将实验中的诱饵蛋白（bait protein）与纯化实验中鉴定的所有蛋白质相连，即使它们可能并非直接物理相互作用（Bader and Hogue 2002）。IntAct 还维护一个审编的蛋白质复合物数据库（Meldal et al. 2015）。数据以 PSI-MI XML 和制表符分隔文本格式免费提供。

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Figure 13.3 从京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）和 BioCyc 进行代谢通路重建的示例：人体中缬氨酸降解通路的重建。

(a) KEGG 中的缬氨酸降解参考通路。KEGG 参考通路是所有已知物种缬氨酸降解通路组成部分的超集。

(b) KEGG 在已测序的人类基因组中发现的酶以绿色高亮显示。在 KEGG 中，酶由其酶委员会编号（Enzyme Commission number, EC number）表示（如 2.6.1.42），该编号定义了酶的功能。EC 系统是酶功能的层级分类体系，类似于较新的 Gene Ontology 分子功能受控词汇表。请注意，并非参考通路中的所有酶都以绿色高亮。这是因为 KEGG 未能在人类基因组中找到这些酶。一个典型的例子是 3-羟基异丁酰辅酶 A 水解酶（3-hydroxyisobutyryl coenzyme A hydrolase, EC 3.1.2.4），它理应存在于人类缬氨酸降解通路中，因为参考通路中没有其他酶可以替代其功能。因此，该缺失的酶代表通路中的一个"空洞"（hole）。这并不意味着该酶不存在于人类基因组中。它可能因进化过程中的序列分化或基因预测不准确而难以识别。来自 BioCyc 数据库家族的 HumanCyc 通路重建能够填补该空洞。

(c) HumanCyc 能够填补空洞。注意 EC 3.1.2.4 酶已存在并与 HIBCH 基因关联。在 HumanCyc 中点击该基因可链接到包含该基因的多个序列数据库，以及提供 HIBCH 基因为 EC 3.1.2.4 酶证据的相关文献。HumanCyc 额外的计算与审编工作使得空洞得以填补。

Ch13 Biological Networks and Pathways / Functional Interaction Databases

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功能性相互作用数据库

功能性相互作用（functional interaction）将基因联系起来，前提是这些基因预期具有相似的功能，其中"功能"可以以多种方式定义。功能性相互作用数据库从多种来源收集或预测大量（数百万条）此类关联。这些资源可用于通过考察某基因（或一组基因）所相互作用的其他基因的功能，来探索该基因的功能。

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图 13.4 BioGRID 数据库记录。对人类 MDM2 基因进行 BioGRID 搜索的结果页面截图。页面顶部汇总了 MDM2 的相关信息，包括 BioGRID 为该基因收录的相互作用数量统计（右上角）。提供五种不同视图：interactors（相互作用因子），显示与 MDM2 相互作用的其他基因的表格；interactions（相互作用），展示每条实验相互作用证据；网络视图（本图所示）；化学相互作用因子表格；以及翻译后修饰（post-translational modification）表格。

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图 13.5 IntAct 数据库中对人类 MDM2 基因的搜索。页面以表格形式显示了所有提及 MDM2 的相互作用摘要，同时提供了在其他相互作用数据库中匹配到的信息。还可以查看相互作用因子表格和结果的网络视图。通过点击每行左侧的小放大镜图标，可以获取每个相互作用的详细信息；使用表格顶部的工具栏，可将信息以标准格式下载。

STRING

STRING 资源（Szklarczyk et al. 2015）以图形化、用户友好的方式，为超过 2000 个基因组提供多种功能性及实验性相互作用信息。提供的相互作用类型包括：基因邻域（gene neighborhood）、基因融合（gene fusion）、系统发育谱（phylogenetic profile）、共表达（co-expression）、文献报道（publication article）、基因名称共提及（gene name co-mentions）以及实验确定的蛋白质–蛋白质相互作用（protein–protein interaction）。STRING 支持按基因名称、 accession 编号和目标序列进行搜索。结果以图形方式呈现，并使用 STRING 特有的评分方案进行评分，该评分与已验证的蛋白质–蛋白质相互作用和已知通路相关联。STRING 的一个独特功能是能够详细考察支持某一相互作用的每种独立证据来源。图 13.6 展示了 STRING 结果的截图。所有 STRING 功能性相互作用均可免费下载供本地使用。

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图 13.6 STRING 主要查询结果页面的示例。图中展示了涉及查询基因（此处为芽殖酵母基因 FAA4）及一组功能相关基因的关系网络，不同颜色的连线表示支持各条关联的预测或实验方法。图中以图形方式提供了图例说明。底部表格汇总了每个相互作用的总体强度评分，以及各证据来源对该评分的贡献。点击最左侧的 Viewers 按钮，可访问每种证据来源的专用图形与文本报告。通过点击 Analysis 按钮，可查看通路（及其他基因集）富集分析结果。网络图下方的 More 和 Less 按钮可增加或减少所显示的相关基因数量。

GeneMANIA

GeneMANIA（Franz et al. 2018）与 STRING 类似，但侧重于九种主要模式生物，且从不同于 STRING 的来源收集数据。GeneMANIA 还使用一种搜索算法，根据查询内容计算每个功能性相互作用网络的相关性，并支持用户上传的自定义网络。给定单个查询基因时，GeneMANIA 根据相互作用关系查找可能具有相似功能的基因。给定一组基因时，GeneMANIA 利用一种机器学习算法查找与该基因集功能相似的基因，该算法类似于热门电影网站根据用户此前观看过的影片来推荐其可能喜欢的电影。例如，如果查询的是一组激酶（kinase），GeneMANIA 将查找相似的激酶，并对蛋白质域相似性网络赋予更高权重。如果查询的是某通路的成员，GeneMANIA 将预测该通路的其他成员，其依据可能是物理相互作用和共表达相互作用（图 13.7）。GeneMANIA 中发现的全部功能性相互作用均可免费下载。

Ch13 Biological Networks and Pathways / Strategies for Navigating Pathway and Interaction Databases

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通路与互作数据库的导航策略

通路与互作数据库的数量和多样性可能令人困惑。从通用和实用的角度来看，用户应优先使用上述数据库进行检索，因为它们是规模最大、开发最为活跃的资源。用户还应了解元数据库（meta-databases），这类资源从多个其他数据库收集信息，提供便捷的单一访问入口。此类整合资源的例子包括：用于通路的 Pathway Commons（Cerami et al. 2011）、用于蛋白质互作的 iRefIndex（Razick et al. 2008），以及用于信号通路中激活/抑制互作的 OmniPath（Turei et al. 2016），当然还有更多类似资源。探索更广泛的通路与互作数据库集合的一个良好起点是 Pathguide 链接目录（Bader et al. 2006）。

本节提供可用于评估通路与互作数据库质量和实用性的标准。这些标准包括范围（scope）、数据质量（data quality）、数据"新鲜度"（freshness）、数据量（data quantity）、可用性（availability）和技术架构（technical architecture），我们将逐一讨论。数据库的范围（即它收集哪些类型的记录）在检索信息之前非常重要。例如，BioGRID 数据库包含蛋白质-蛋白质互作（protein–protein interactions）和遗传互作（genetic interactions）的信息，这两种相关数据类型具有截然不同的性质。用户可能检索蛋白质互作，却发现了遗传互作，如果不了解数据库的范围，就可能将后者误判为蛋白质互作。

数据质量在很大程度上取决于整理（curation）和验证（validation）的水平，且可能难以独立评估。一般而言，应关注是否存在人工整理的证据——这通常意味着更高的数据质量——而仅包含未经人工审核的计算预测信息的数据库则质量较低。虽然专家整理的数据库是金标准（gold standard），但质量较低的信息集合仍然有用，不过通常需要用户具备专业知识和时间来筛选。例如，通过文献提取技术（text mining，文本挖掘）自动创建的蛋白质-蛋白质互作数据库可能仅有约70%的准确率，但仍可能包含其他数据库中没有的正确信息。

数据新鲜度同样重要，维护良好且定期更新的数据库往往表明更高的数据质量。用户应在数据库主页及记录中查找日期信息，或在下载站点查看数据集的创建时间（如有），以了解数据的时效性。衡量数据库实用性的另一个指标是数据量——在数据质量良好的前提下，可用数据越多越好。用户还应关注数据库的可用性，即许可条款，因为某些数据库存在知识产权限制。幸运的是，许多数据库要么对所有人免费开放，要么对学术研究者免费使用。最后，如果计划对某个数据库进行批量分析，则应考虑其技术架构（Helmy et al. 2016）。理想情况下，数据库应以标准格式提供（详见"通路与分子互作的标准数据格式"一节），并提供应用程序编程接口（APIs）。

Ch13 Biological Networks and Pathways / Standard Data Formats for Pathways and Molecular Interactions

通路与分子相互作用的标准数据格式

本节概述标准数据交换格式。理想情况下，人们应能从一个便捷的数据源获取解决某个研究问题所需的所有相关通路和网络信息。然而在现实中，每个数据库团队都创建了自己的数据表示方式，使得整合数据并将其用于综合分析变得极为困难。幸运的是，已经开发出了许多数据库支持的标准数据格式，使得以一个（或少数几个）兼容格式访问来自不同数据源的数据变得容易。

BioPAX

Biological Pathway Exchange（BioPAX）格式是表示生物通路的标准语言（Demir et al. 2010）。BioPAX 可以表示代谢通路和信号通路、分子相互作用与遗传相互作用，以及基因调控网络（Figure 13.8）。BioPAX 用 Web Ontology Language（OWL）编写，OWL 是一种 XML 语言，能够描述类（class）、类的属性（property）及其相互关系。BioPAX 的顶层类是 Entity，包含四种类型：Pathway、Interaction、Gene 和 PhysicalEntity。Pathway 是 Interaction 的集合，可选按步骤排序。Interaction 包含基因或物理实体：蛋白质、DNA、RNA、小分子和复合物。BioPAX 涵盖四种主要的表示风格和数据类型：生化反应与信号通路……

AKT AKT PDK1 AKT Thr308 Ser473 PP2A hsp90 P P P P P

rAKT1 is a ProteinReference

has standard-name "AKT1"

has name "PKB"

has xref Uniprot-P31749

p@308 is a ModificationFeature

has featureLocation AKT1-308

has modificationType phosphorylation

AKT1.1 is a Protein

has proteinReference rAKT1

has notFeature p@308

has notFeature p@473

reaction1 is a BiochemicalReaction

has left AKT1.2

has right AKT1.1

is left-to-right.

catalysis1 is a Catalysis

has controller PP2A.1

has controlled reaction1

has direction irr-left-to-right

AKT1.2 is a Protein

has proteinReference rAKT1

has feature p@308

has notFeature p@473

assembly1 is a ComplexAssembly

has left HSP90.1

has left AKT1.3

has right complex1

is reversible

complex1 is a Complex

has component AKT1.4

has component HSP90.2

HSP90.2 is a Protein

has proteinReference rHSP90

is boundTo AKT1.4

AKT1.4 is a Protein

has proteinReference rAKT1

has feature p@308

has feature p@473

is boundTo HSP90.2

HSP90 HSP90 AKT1 AKT1 AKT1 AKT1 308 473 308 473 308 473 308 473 P P P P P PDK2 PP2A PDK1

Figure 13.8 AKT 通路的三种表示方式：传统方法（左上，来自 www.biocarta.com）、形式化的 SBGN 图（左下，来自 www.sbgn.org），以及使用 BioPAX 语言的表示（右侧）。来源：经 Springer 许可转载自 Demir et al. (2010)。

Ch13 Biological Networks and Pathways / Pathway Visualization and Analysis

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通路可视化与分析

通路由转换（conversion）和控制（control）两类交互类型构成，其物理实体参与者可维护状态信息（如翻译后修饰、细胞定位和蛋白质复合物结合状态）。转换类型捕获生化反应、转运、降解和复合物组装等过程。控制类型捕获催化和调控作用。催化描述催化某一生化反应的酶，因此在代谢通路中捕获一个步骤需要两种交互（催化交互和生化反应交互）。基因调控通路由 TemplateReaction 和 TemplateReactionRegulation 交互构成。模板反应（template reaction）是指中心法则中分子之间的转换，如 DNA 到 RNA 或 DNA 到蛋白质。TemplateReactionRegulation 类型的交互对此进行控制，例如捕获调控基因表达（描述为 TemplateReaction）的转录因子。MolecularInteraction 类捕获蛋白质-蛋白质或其他分子间交互，遵循 PSI-MI 标准的风格（见 PSI-MI）。GeneticInteraction 类表示遗传交互，如基因间的合成致死（synthetic lethal）或上位性交互（epistatic interactions）。许多数据库以 BioPAX 格式提供数据，包括 Reactome（Fabregat et al. 2018）、BioCyc 数据库家族（Caspi et al. 2018）和 Pathway Commons（Cerami et al. 2011）。BioPAX 提供编程库以支持软件开发者加载、保存和查询 BioPAX 文件（Demir et al. 2013），并提供验证器服务（Rodchenkov et al. 2013）以支持内容提供者创建新的 BioPAX 文件。

PSI-MI

PSI 开发了一种基于 XML 的蛋白质-蛋白质交互交换格式，称为 PSI-MI（Hermjakob et al. 2004）。该格式的数据模型包含一个"交互"记录，由一组发生交互的蛋白质（可以超过两个）、"实验条件"受控词汇表、以及出版物参考文献和蛋白质特征信息（如结合位点和翻译后修饰位点）组成。PSI-MI 工作组还维护了一个广泛的术语本体，用于描述交互类型和实验方法类型等概念，作为 PSI-MI 中的受控词汇表使用（Mayer et al. 2014）。图 13.9 展示了 PSI-MI 记录的顶层结构。许多数据库和工具支持 PSI-MI，与 BioPAX 类似，也有软件库、Web 服务和验证器可供软件开发和数据库团队支持该标准。PSI-MI 和 BioPAX 开发工作组协同工作以确保格式之间的兼容性，使 BioPAX 中的 MolecularInteraction 类可与 PSI-MI 格式互相转换。PSI-MI 还提供了一种制表符分隔的格式版本，称为 MITAB（molecular interaction tab delimited），便于在脚本中处理文件。

SBML

系统生物学标记语言（Systems Biology Markup Language, SBML）是一种基于 XML 的数学通路模拟模型交换格式（Hucka et al. 2003）。数学通路模型的一个例子是描述通路中所有反应速率的常微分方程系统。给定正确的参数（如分子初始浓度和反应动力学常数），计算机可以计算通路中各分子物种随时间变化的浓度。许多模拟工具支持这些格式。BioModels 数据库包含许多通路的 SBML 模型（Le Novere et al. 2006），许多软件工具可用于模拟 SBML 模型。

通路可视化与分析

通路可视化工具是能够自动绘制通路图的计算机程序。自动通路可视化工具，尤其是用于浏览代谢通路的工具，在第一批代谢数据库建立后不久即已出现。例如，ACeDB 数据库（Eeckman and Durbin 1995）和 EcoCyc（Karp et al. 2002）中都包含通路绘制工具。许多这类工具显示静态图片，其中的组件（如酶或小分子）可以点击以从源数据库获取更多关于该组件的信息。静态可点击通路图片的示例可在 Reactome 数据库中找到（图 13.1）。更先进的工具能够从底层数据库动态生成通路图，允许用户改变通路的查看方式。例如，EcoCyc 数据库包含的通路可视化工具可以显示通路的不同细节层次，从概览到显示通路中所有小分子化学结构的详细视图（图 13.10）。PathVisio 可以显示来自多个来源的通路图，并能通过将基因表达和其他基因组数据叠加在通路图上来辅助数据解读（图 13.11; Kutmon et al. 2015）。一般而言，PathVisio 及类似工具必须能够加载通路信息和基因表达数据，并将一个数据集中的基因与另一个匹配。这通常要求两个数据集之间的基因标识符相匹配，虽然许多工具提供了将标识符从一种类型映射到另一种类型的功能以帮助数据集间的基因匹配，但这有时可能出错（Zeeberg et al. 2004）。

系统生物学图形符号（Systems Biology Graphical Notation, SBGN）是通路图的标准格式（Le Novere et al. 2009）。存在三种版本以捕获不同的通路表示范式。过程描述（Process Description, PD）图可视化生化风格的代谢和信号通路（图 13.12 和 13.13）。实体关系（Entity Relationship, ER）图显示涉及参与者的交互网络。活动流（Activity Flow, AF）图展示通路内信息流动的方式，包括激活和抑制关系。SBGN-ML 是交换 SBGN 图的标准 XML 格式（van Iersel et al. 2012），许多编辑器和可视化工具支持自动绘制 SBGN 图（Sari et al. 2015; Hartmann and Jozefowicz 2018）。

通路分析的主要类型是通路富集分析（pathway enrichment analysis），用于解读基因组和其他基因组规模的数据。它识别在大基因列表中比预期更富集或更不富集的通路，这些基因列表通常来源于高通量转录组或蛋白质组方法。在此分析中，对通路在实验基因列表中高于随机预期的过度代表性进行统计检验。例如，一个实验推导的基因列表中包含 50% 的细胞周期基因，这令人意外地富集，因为只有 8%的人类蛋白质编码基因参与此过程。

通路富集分析涉及三个主要步骤。第一步，利用可用的高通量数据定义感兴趣的基因列表。此类实验的原始数据通常需要计算处理，如标准化和评分以识别感兴趣的基因。例如，可以从 RNA-seq 数据推导出两组样本之间差异表达的基因列表。第二步，执行通路富集分析。使用统计方法识别第一步基因列表中相对于随机预期富集的通路。对给定数据库中的所有通路在基因列表中进行富集检验，所得 p 值经过多重假设检验校正以识别显著富集的通路。第三步，对通路富集分析结果进行可视化与解读。第二步可能识别出许多富集通路，通常包括同一通路的多个相关版本。可视化可以帮助识别此列表中的主要生物学主题及其关系，以便聚焦研究。

许多统计方法已被提出用于执行通路富集分析（Khatri et al. 2012），但主要有两种类型针对特定类型的基因列表而设计。第一种设计用于分析包含数十到数千基因的基因列表，如在癌症基因组学实验中可能定义的列表（即与正常样本相比，癌样本中所有突变基因的集合）。这类基因列表可以使用 Fisher 精确检验来计算输入列表中的基因与通路中的基因之间非随机关联的概率。该检验对数据库中的所有通路基因集重复进行，使用 Benjamini–Hochberg 错误发现率（FDR）方法校正重复检验（多重假设）（Hochberg and Benjamini 1990）。结果是一组在基因列表中显著富集的通路基因集及其关联的校正 p 值（也称为 q 值）。执行此分析的有用工具是基于 Web 的 g:Profiler 系统（图 13.14; Reimand et al. 2016）。

第二种重要的基因列表类型是按实验评分排序的。典型例子是在 RNA-seq 实验中比较一种条件与另一种条件时测量的所有差异表达基因组列表。此基因列表按差异表达评分排序，条件 A 与 B 相比最正差异表达（上调）的基因位于列表顶部，未差异表达的基因位于中间，负差异表达（下调）的基因位于底部。通常没有自然的方法对此列表设定阈值以定义适合输入基于 Fisher 精确检验的分析方法的较小基因列表。此外，设定阈值可能移除生物学相关信号，因为弱差异表达的基因可能为给定富集通路贡献信号。为解决这一问题，排序型通路富集分析方法已被开发；这些方法不需要定义阈值，而是考虑列表中的所有基因。此类方法中最常用的是基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA），主要实现为可在桌面本地安装的免费软件（Subramanian et al. 2005）。GSEA 方法搜索其基因在排序基因列表顶部或底部比随机预期更富集的通路。例如，如果最顶部差异表达的基因涉及细胞周期，则提示细胞周期通路在实验中受到调控。相比之下，如果细胞周期基因在整个排序列表中随机散布，则细胞周期通路可能未受到显著调控。为计算通路的富集评分（enrichment score, ES），GSEA 从排序列表顶部到底部逐步检查基因，如果基因属于该通路则增加富集评分，否则减少评分。这些运行累加值经过加权，因此排名最高（和最低）基因的富集被放大，而排名更居中的基因的富集不被放大。ES 计算为运行累加值的最大值，并相对于通路大小进行标准化，得出标准化富集评分（normalized enrichment score, NES），反映通路在基因列表中的富集程度。正和负 NES 值分别代表列表顶部和底部的富集（图 13.15）。此过程对数据库中的每个通路重复进行。最后，计算基于置换的 p 值并校正多重检验以产生基于置换的 FDR q 值，范围从 0（高度显著）到 1（不显著）。置换 p 值通过多次使用随机基因集或随机分配实验类别标签（如"病例"和"对照"）重复分析来计算，若有超过五个样本则推荐后者。从排序基因列表底部开始执行同样的分析以识别列表底部富集的通路。所得通路使用 FDR q 值阈值（如 q < 0.05）筛选，并使用 NES 排序。检查在富集评分达到峰值之前促使其增加的"前沿基因"（leading edge genes）也很有用。

在上述两种分析类型中，显著富集的通路通常以表格展示。通路信息本身具有冗余性，因为基因通常参与多个通路，且来自不同数据库的通路可能重复。通路富集分析因此经常突出同一通路的多个版本。将冗余通路折叠为单一生物学主题可简化解读。

Enrichment Map 可视化软件是 Cytoscape 网络可视化和分析软件（见"网络可视化"部分）中的一个应用，旨在解决此问题（Bindea et al. 2009; Merico et al. 2010）。富集图是一种表示富集通路之间重叠的网络（图 13.16）。通路表示为圆形（节点），按富集评分着色，以连线（边）连接，边的大小基于相连通路共享的基因数量。网络布局和聚类算法用于自动显示并将相似通路分组为主要生物学主题。可以交互式地探索通路富集评分（过滤节点）和通路之间的连接（过滤边）。如果可选地加载了基因表达数据，点击通路节点将显示该通路中所有基因的基因表达热图。多个富集分析结果可以同时在一个富集图中可视化以进行比较，此时每个富集结果使用不同颜色标记节点（Reimand et al. 2019）。

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图 13.9 Proteomics Standards Initiative–Molecular Interactions (PSI-MI) 数据模型中描述蛋白质-蛋白质交互的主要组成部分。方框表示定义的 XML 数据类型。虚线表示可选元素。六边形方框表示其下方元素的集合。小方框中的减号和加号符号分别代表每个元素的折叠和展开视图。折叠方框内部有更多未显示的元素。PSI-MI 的完整 schema 可在 PSI-MI Web 网站上获取。

图 13.10 由支持 BioCyc 数据库家族的 Pathway Tools 软件动态绘制的缬氨酸生物合成通路。自动通路图布局的优势在于可以根据用户偏好绘制图。此处展示了同一通路的两个视图，(b) 中的视图比 (a) 提供更多细节。注意 (b) 中小分子结构的存在。通路图中的节点代表代谢物，连接代表酶。

图 13.11 PathVisio 软件的输出，显示了叠加了三个乳腺癌细胞系样本基因表达数据的人类细胞周期通路的一部分。矩形代表基因或通路（如标注所示），并根据右侧图例按基因表达水平着色，其中黄色代表低 mRNA 基因表达，蓝色代表高 mRNA 基因表达。

图 13.12 系统生物学图形符号（SBGN）过程描述（PD）格式中可用的符号类型集合。

图 13.13 使用系统生物学图形符号（SBGN）过程描述（PD）绘制的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）细胞周期，并着色以增加视觉吸引力。来源：转载自 Toure et al. (2018)。

图 13.14 使用 g:Profiler 工具进行通路富集分析的结果。屏幕顶部显示输入表单，包括输入基因列表的文本框（左上）、可选择的各种分析选项（中上）和可选的基因集数据库（右上）。富集结果以表格形式显示在图底部。每行包括通路名称（左列）、富集统计信息（中间列）和查询基因及其所属通路的图形视图（右图）。

图 13.15 基因集富集分析（GSEA）富集图。图的下半部分代表完整的排序基因列表，从高（左）到低（右）排序。排序列表中匹配某通路（基因集）的基因以黑色垂直线显示。运行富集评分以绿色线绘制在顶部。这是一个高度富集通路的示例，因为绿色线迅速上升到高水平后才下降。展示了三个图：(a) 排序基因列表顶部有良好富集，(b) 富集较差（通路基因在排序列表中随机分布），(c) 列表底部有良好富集。

图 13.16 富集通路之间重叠的网络表示（Enrichment Map）。

Ch13 Biological Networks and Pathways / Network Visualization and Analysis

网络可视化与分析

蛋白质定位于细胞边缘的正调控

蛋白质定位于膜的正调控

质膜组织

蛋白质定位于质膜的调控

蛋白质定位于膜的调控

蛋白质定位于膜的建立

凋亡信号通路的调控

凋亡相关的线粒体变化

线粒体组织的调控

内源性凋亡信号通路

凋亡信号通路的负调控

凋亡信号调控

质膜组织

Figure 13.16 展示两个富集主题的富集图（enrichment map）。每个节点代表一个通路基因集，名称如标签所示。节点大小与该通路中的基因数量成正比。节点颜色代表富集分数（enrichment score），颜色越深表示分数越好。边代表两条通路之间共享的基因，边越粗表示共享基因越多。相关通路已使用 Cytoscape 的 AutoAnnotate 应用自动分组为图中以大型标签和阴影圆圈标注的主题。

网络可视化与分析

虽然查看单条通路对于详细的机制研究很有用，但对于可视化和分析大量分子相互作用以及已知的、研究充分的通路之外的知识映射，它并不适用。因此，人们开发了网络可视化与分析工具。网络可视化与分析依赖于计算机科学领域图论（graph theory）的概念，因此本节首先简要讨论图论的基本概念。

图论基于图（graph）的概念——将连接数据表示为一组节点（node，或称顶点 vertex）和一组连接边（edge）（Figure 13.17）。边可以是有方向的，此时可称为弧（arc）。节点和边可以关联权重或其他数据值。图有不同的类别；例如，不包含任何环（cycle）的图称为无环图（acyclic graph，也称树）。树图具有根节点（root node）和叶节点（leaf node），树的集合称为森林（forest）。生物信息学中有向无环图的一个例子是 Gene Ontology（参见 Chapter 7; Ashburner et al. 2000），其中最一般的注释术语是根节点，最具体的术语是叶节点。在无向图中，与一个节点相连的边数称为度（degree）。对于有向图，入度（in-degree）和出度（out-degree）分别是输入和输出某个节点的弧数。图是一个抽象的数学概念，可以映射到任何能够想象出映射关系的问题；因此，方向、权重和连通性在被映射之前并不具有任何特定的生物学（或其他领域）含义。

Figure 13.17 计算机科学图论领域中使用的术语和视觉标记介绍。蓝色圆圈是节点或顶点（vertex，单数形式），无向线（红色和绿色）称为边（edge），有向线（青色）称为弧（arc）。节点或边可以有关联属性，例如权重。此处显示了两个边权重：5 和 −7。一系列形成闭合环路的边称为环（cycle，红色线）。此图中的颜色仅用于标注图的结构，并非常规视觉标记的一部分。图是一个抽象的数学概念。边的方向、权重和其他属性在被映射到具体问题之前没有任何含义。

直觉上，生物分子相互作用网络可以映射到图，其中生物分子表示为节点，相互作用表示为边。其他信息也可以被映射；例如，边的方向可以代表激活关系，边的权重可以从相互作用的置信度信息映射而来。某些类型的生物相互作用信息无法忠实地映射到图，或者可能存在多种模糊的映射方式，或映射会导致信息丢失。例如，在免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）实验中检测到的大于两个分子的蛋白质复合物，不容易用图中的二元关系来描述；相反，它们只能准确地表示为一个集合，因为实验并不提供复合物中蛋白质之间直接物理连接的信息。该集合可以用不同的方式映射到图，例如将集合中所有蛋白质在团（clique，即完全连接的图）中彼此连接，或者创建一个代表该集合的节点并将每个蛋白质链接到该新节点（Bader and Hogue 2002）。

使用图论来表示生物网络的原因在于它有助于回答许多有意义的生物学问题。例如，如果想知道某一蛋白质是否与蛋白质相互作用网络中的另一蛋白质相连，可以运行一种算法（称为广度优先搜索，breadth-first search），该算法在数学上保证能找到两个节点之间的最短路径（如果存在）。许多其他有用的图算法可用于操作、查询、分析和可视化图。关于图论的更多信息见 Box 13.1 以及专门讨论图论算法的著作（Bollobás 1998; Mehlhorn and Näher 1999; Cormen 2001）。

Box 13.1 高级图论应用

图论与线性代数之间存在天然的关联。任何图都可以表示为一个 N × N 矩阵，称为邻接矩阵（adjacency matrix），其中行和列代表图中的节点，如果节点 i 与节点 j 相连，则在矩阵位置 (i,j) 处放置"1"。如果图中的边有权重，则权重可以记录在位置 (i,j) 处，而不用"1"。由于生物信息学中许多类型的矩阵是 N × N 的方阵，它们可以表示为图，有时进行这种转换以可视化矩阵是有用的。一个有趣的例子是蛋白质序列相似性矩阵，它以全对全（all-against-all）的方式记录一组序列的序列相似性（例如由 BLAST 计算，参见 Chapter 3）。相似性矩阵的行和列代表被比较的对象集合；在本例中是蛋白质序列，矩阵位置 (i,j) 记录蛋白质 i 与蛋白质 j 相比对的相似性分数。通过将这些数据可视化为网络而非矩阵，相似蛋白质聚类之间的连接在视觉上更为明显（Akiva et al. 2014）。

数学家也可以将图转换为邻接矩阵，以对矩阵应用代数矩阵运算来求解特定的图问题。有时，矩阵运算比使用标准算法直接在图上执行的相同运算更快。例如，邻接矩阵平方后的条目 (i,j) 对应于图中节点 i 与节点 j 之间长度为 2 的路径数量。这可以推广到邻接矩阵的更高次幂。如果矩阵是稀疏的（填充了大量零），对矩阵求平方可以快速得到答案；但如果图是稠密的，则不会那么快。幸运的是，生物学中的许多问题可以转化为稀疏图。生物信息学中利用这种数学问题求解策略对相似性矩阵进行聚类的一种算法是 Markov 聚类（MCL）算法（Enright et al. 2002）。通过对相似性图的邻接矩阵进行一系列乘法及其他数学运算，可以检测出相似蛋白质的聚类。同一相似性聚类中的蛋白质之间的路径比它们到其他聚类中蛋白质的路径更多。矩阵平方运算涉及计算从一个蛋白质到另一个蛋白质的路径数量。

网络可视化

网络可视化工具依赖于计算机科学领域中的网络布局（network layout）算法。通常，网络布局算法试图使图看起来美观；也就是说，它们尽量减少节点的重叠和边的交叉，使图尽可能多地清晰可见。网络布局是实用的，通常在中小型网络（如在典型大小的显示区域——如计算机显示器——上，节点数从几十到几千）上效果良好。比这更大的网络需要超出常规的显示区域，或者需要降低网络复杂度才能查看，例如通过过滤边或放大感兴趣的节点区域。

网络布局算法有很多类型，例如层级排列节点、环形排列或较不结构化的格式。重要的是，最适合的布局算法类型取决于输入网络的类型。例如，高度连接的网络以层级方式布局时显示效果不佳；只有真正具有层级结构的网络（如树）才能在这种情况下良好布局。因此，网络可视化工具包含多种布局方法，应全部尝试以确定哪种方法能为特定网络生成美观的布局。

最常用的布局类型之一是弹簧嵌入算法（spring-embedded algorithm），它源力于力导向布局算法（force-directed layout algorithm）的一般类别，并有许多变体。在典型情况下，网络被建模为物理系统，其中边是弹簧，节点是带同种电荷的粒子相互排斥。布局开始时将所有节点随机放置，然后计算每个节点的位置——长边如同被拉伸的弹簧，会将相连的节点拉近，而节点之间越接近则相互排斥力越强。通过随时间迭代，网络可以在最终布局上稳定下来，此时边相对较短，节点相对不重叠。可以将此想象为将一堆带同种电荷的珠子（节点）用弹簧（边）连接，抛到空中，看它们落地时如何排列。

网络布局完成后，需要进行解读。在生物相互作用网络中有三种主要模式值得关注（Merico et al. 2009）。第一种模式表现为"关联即有罪"（guilt by association），描述了功能相似的基因在蛋白质或基因相互作用网络中通常彼此相连的现象。这对于根据邻近基因的功能来预测未知基因的功能很有用。第二种模式呈现密集连接的区域，即聚类（cluster），它们经常指示通路、系统或分子复合物。第三种分析模式是关注全局特征，例如密集连接区域之间的组织关系，这可能有助于理解哪些区域彼此密切相关。

Cytoscape 是一款免费开源的基于 Java 的网络可视化与分析工具，也是同类工具中使用最广泛的（Shannon et al. 2003）。Cytoscape 能够在其他类型数据（例如基因组数据）的背景下可视化和分析网络数据，并对网络进行布局。Cytoscape 的网络是交互式的，可以编辑；可以使用鼠标选择、拖动和旋转节点。还可以通过基于用户定义的已加载属性与网络拓扑的组合过滤来进行精细的节点和边选择。Cytoscape 的一个主要优势是能够通过从 Cytoscape 应用商店下载"apps"来添加新功能（Lotia et al. 2013）。任何人都可以使用 Java 编程语言开发应用。已有数百个实现了各种可视化和分析方法的应用被开发并贡献给该项目。使用 R、Python 或其他脚本语言自动化 Cytoscape 功能也是可行的（Demchak et al. 2018）。

Cytoscape 在整合和可视化网络上的信息时使用网络属性（network attribute）和视觉属性（visual attribute）的概念。网络属性有两种类型：节点属性和边属性。节点属性是与节点关联的数据值（通常通过从文件加载）。如果节点代表一个蛋白质，节点属性可以是该蛋白质的名称、描述该蛋白质功能分类的术语（可能来自 Gene Ontology），或蛋白质丰度测量值。类似地，边属性是与边关联的数据值。如果边代表两个蛋白质之间的相互作用，边属性可以是相互作用的强度或用于检测该相互作用的实验方法类型。只要每种类型具有不同的名称，就可以同时加载多种类型的节点和边属性。任一属性都可以是离散的（discrete）或连续的（continuous）。离散边属性的一个例子是相互作用检测实验方法的列表。连续节点属性的一个例子是范围从 0.0 到 1.0 的一组基因表达值。

Cytoscape 中的视觉属性是网络图可以用不同方式显示的方面（Figure 13.18）。对于节点，这些包括形状、大小、标签、字体、颜色、边框颜色和边框类型；对于边，这些包括标签、字体、颜色、线型（例如实线或虚线）、目标箭头和源箭头。一旦网络被加载到 Cytoscape 中，任何节点或边属性都可以使用 Cytoscape 的可视化映射器（visualization mapper），即"Style"系统，映射到视觉属性。蛋白质相互作用网络视觉样式的一个具体示例是将包含归一化基因表达值（范围从 0.0 到 1.0，其中 1.0 为该集合中的最高基因表达值）的节点属性映射到节点颜色，表达值 0.0 映射为绿色，1.0 映射为红色。Cytoscape 将随后根据样式自动对所有节点进行连续着色，表达值 0.5 将被着色为绿色和红色之间的中间色。Cytoscape 有数百种功能，记录在 Cytoscape 手册、在线教程和各种操作流程中，也可以通过涉及大量用户社区的邮件列表获取支持。

Figure 13.18 在 Cytoscape 中放大网络，展示了来自芽殖酵母的大型蛋白质和遗传相互作用连接网络的一部分。此视图旨在强调 Cytoscape 中可用的视觉自定义功能。节点代表基因，颜色按基因表达值着色（类似于 PathVisio），大小按节点度数设定。重要的是，Cytoscape 中的此视图可以使用 Cytoscape 的视觉映射器（左侧面板）进行高度自定义。

网络分析

许多类型的生物数据可以与生物网络整合，以深入了解特定生物学背景（如疾病）中活跃的机制。本节简要描述一系列已开发的网络分析方法，所有这些方法均可通过 Cytoscape 或其他系统免费获取。

拓扑分析（Topological analysis） 仅关注网络中节点和边连接的模式。最基本的拓扑分析是分析网络中所有节点的度（连接数）分布。生物网络的度分布倾向于遵循幂律（power law），即少数节点具有非常高的度（称为"枢纽"，hub），而多数节点具有较低的度。有人提出这种组织方式是生物系统鲁棒性（robustness）的基础（Barabasi and Oltvai 2004），且枢纽是这些系统中最重要的节点。衡量节点重要性的指标有很多，通常称为中心性度量（centrality measure）。例如，"聚类系数"（clustering coefficient）衡量节点邻域中边的密度。这些度量可以使用 Cytoscape 提供的 Network Analyzer 应用计算（Assenov et al. 2008），也可以通过其他工具计算。

其次，可以识别网络中的小模式，称为网络模体（network motif）（Alon 2007）。例如，前馈环（feed-forward loop）由至少三个节点组成，节点通过有向边串联连接（如 A → B → C），同时 A 也通过有向边连接到 C，其中方向表示"调控"。许多生物网络中特定模体类型富集，模拟表明这些模体具有特定的生物学属性，例如"延迟"或"放大"。网络模体可以使用 NetMatchStar Cytoscape 应用发现（Rinnone et al. 2015）。

再次，网络中更大的模式称为模块（module，也称系统或聚类），对应于彼此之间比与模块外节点连接更紧密的节点组。蛋白质-蛋白质相互作用网络中的模块往往是蛋白质复合物（Bader and Hogue 2003），模块化是生物系统的关键原则（Hartwell et al. 1999）。网络模块可以使用 ClusterMaker2 Cytoscape 应用推导（Morris et al. 2011）。

第二类网络分析是差异分析（differential analysis），即比较或比对两个或多个网络（Ideker and Krogan 2012）。这种分析方法有助于识别在进化时间中保守的区域，因此可能普遍重要。它还可以识别条件之间的差异区域，例如疾病特异性的区域，可能有助于理解潜在的疾病机制。DyNet Cytoscape 应用是这种网络比较工具的一个例子（Goenawan et al. 2016）。

第三类网络分析是预测分析（predictive analysis），即使用网络对样本进行分类或预测疾病结局。例如，根据突变模式对癌症样本进行分类依赖于将具有共同突变的样本分组。然而，许多癌症样本匹配对之间没有任何共同突变，从而无法进行任何分组。癌症被认为是一种通路疾病，其中癌症标志通路需要被激活（促肿瘤）或失活（抑肿瘤）；这些效应可以通过多种突变机制发生，而不仅仅是重复影响相同的基因（Hanahan and Weinberg 2011）。因此，即使两个样本具有不同的突变集合，受突变影响的基因可能在同一模块内相互作用，这些关系可以使用基因功能相互作用网络来检测。一种称为"网络平滑"（network smoothing）的方法被提出，用于在基因相互作用网络上"扩散"每个样本中突变的信息，从而增加样本之间在网络层面的相似性。由此得到的样本来源的相互作用网络可以比仅靠突变更有效地分组（Hofree et al. 2013）。

第四类是网络推断（network inference），即从现有数据预测网络边。已提出两种主要类型的网络推断：基于蛋白质序列的和基于相关性的。基于蛋白质序列的方法使用机器学习来识别蛋白质序列中预测物理相互作用的模式（Schoenrock et al. 2014）。基于相关性的方法识别给定数据集中的相关性来定义网络。例子包括加权相关网络分析（WGCNA），它计算基因表达数据集中所有基因对之间的表达谱相关分数（Langfelder and Horvath 2008）。相关分数被映射为相关网络中的加权边。网络经过过滤以保留最强的相关性，并进行聚类以识别模块。另一个例子是 ARACNE（Algorithm for the Reconstruction of Accurate Cellular Networks），它使用互信息度量和专门的过滤方法（数据处理不等式，data processing inequality）来构建富集已知调控因子（如转录因子）与潜在靶标之间直接相关性的相关网络。所得网络被预测对应于基因调控关系（Margolin et al. 2006）。Cytoscape 的 CyNI 工具包应用实现了此方法及相关方法（Guitart-Pla et al. 2015）。

最后一类是整合分析（integrative analysis），即使用多层数据执行上述任一分析类型。数据整合的优势在于，来自独立数据源的误差通常会被减少（增加置信度），因为每个数据源预计以不同方式产生误差；系统的覆盖范围可以增加，因为每个数据源可能包含系统不同方面的信息。挑战包括处理数据匹配以避免错误，包括匹配基因标识符或数据类型（例如连续型与离散型），以及考虑数据集偏差（例如某一数据源可能因其存在偏差或易出错而干扰整合）。数据整合已被应用于从多种数据类型预测蛋白质相互作用（Jain and Bader 2016）、网络模块识别（Wang et al. 2014）以及受癌症突变影响的网络模块识别（Wu and Stein 2012）。最后一种功能可在 ReactomeFIViz Cytoscape 应用中使用。该应用接受一个基因列表，然后在一个通过整合多种数据（包括蛋白质相互作用）创建的功能相互作用网络中进行查询；接着使用网络聚类算法检测模块；最后，使用通路富集分析方法对每个模块进行注释。

Figure 13.19 通路分析工作流程概览，总结了本章中的多种工具。最上层蓝色部分描绘了不同的基因组学数据类型。下一层浅橙色部分展示了从数据推导基因列表所需的数据处理步骤。基因列表由红色方框表示。绿色方框描述了数据分析和解读步骤，左侧为通路富集分析，右侧为网络分析。这两条并行途径都通向对通路、网络区域和感兴趣基因的聚焦分析（底部绿色部分）。黄色矩形突出显示本章讨论的工具。箭头连接方框以显示整体工作流程中的路径。ChIP，染色质免疫沉淀；CLIP，交联免疫沉淀；CNV，拷贝数变异；exp.，实验；GSEA，Gene Set Enrichment Analysis；mass spec.，质谱；miRNA，微小 RNA；SNP，单核苷酸多态性；TF，转录因子。

Ch13 Biological Networks and Pathways / Summary + Acknowledgments + Internet Resources + Further Reading + References

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总结

鉴于目前可用的通路和网络分析方法种类繁多，选择能够适用于任意或所有给定数据类型的适当分析方法是一项困难的工作。就基因列表解读而言，一个好的工作流程是：首先使用通路富集分析方法识别感兴趣的通路。由于通路分析聚焦于已知通路，它并不包含典型基因组中的许多基因，因此还应并行完成网络分析——在 Cytoscape 中使用 GeneMANIA 和 ReactomeFIViz 来识别感兴趣的网络区域。然后可以对选定的感兴趣通路和网络及其参与基因进行深入审视，同时手动考虑所有可用数据和文献，以生成可供实验验证的假设（Figure 13.19）。

网络和通路信息仍在快速增长，但这些信息通常以静态形式呈现，缺少关于动态性（例如钙波或反馈环路）、细节（例如原子级蛋白质结构）和上下文（例如细胞类型和发育阶段）的信息。仍需大量工作来开发能够综合考虑细胞中生物机制所有可用数据的表示和分析方法，以提高我们识别生物学模式和做出可检验的生物学系统预测的能力。除本章已涵盖的内容外，分子相互作用与通路领域还存在许多其他主题，例如数学通路建模（Bower and Bolouri 2001）、蛋白质与蛋白质以及蛋白质与小分子的分子对接（Ofran and Rost 2003），以及遗传相互作用（Boone et al. 2007）。

致谢

作者感谢 Anton Enright 共同撰写了本书上一版中本章的内容。

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