Metabolomics

Ch14 Metabolomics / Introduction

引言

本书的大部分内容介绍了促进基因组学、转录组学和蛋白质组学研究所需的计算工具与数据库。换言之，所关注的主要分子对象是蛋白质、RNA 和 DNA 等大分子或巨型聚合物。那么，氨基酸、核苷酸和脂质等小分子呢？在过去十年中，越来越多的生物信息学研究者通过一个新兴的科学领域——代谢组学（metabolomics）——将目光投向了这些小分子。

代谢组学是"组学"（omics）科学的一个分支，侧重于对代谢组（metabolome）中的小分子代谢物进行全面表征。代谢组定义为在细胞、生物体液、器官或生物体中发现的所有小分子（分子量 <1500 Da）的完整集合（Wishart 2005）。这些小分子包括内源性代谢物，如短肽、氨基酸、核酸、碳水化合物、脂质、有机酸、维生素和矿物质。它们还包括外源性化学物质或异生素（xenobiotics），如食品添加剂、植物源化学物质、药物、化妆品化学成分、染料、清洁剂、污染物，以及生物体可以摄入或暴露于其中的几乎任何其他小分子化学物质。

小分子对生命至关重要。它们是细胞的砖瓦与灰浆，作为所有大分子（蛋白质、RNA 和 DNA）的构建模块参与基本细胞功能。它们还为细胞过程提供燃料，为维持细胞完整性提供屏障，为帮助细胞耐受环境压力提供缓冲，并为许多细胞内和细胞间信号传递事件充当信使。由于许多小分子代谢物由特定基因"编码"，并且它们在几乎所有细胞过程中都发挥如此关键的作用，代谢物有时被称为"基因组的金丝雀"（canaries of the genome）。正如金丝雀曾作为煤矿中有毒气体或其他问题的敏感指示器，小分子代谢物也可以作为基因组问题的极其灵敏的指示器。事实上，基因中单个碱基的改变即可导致某些代谢物浓度发生高达 10 000 倍的变化（Wishart et al. 2007）。这种非凡的灵敏性是新生儿筛查的基础——代谢物检测已被用于发现遗传缺陷（如苯丙酮尿症）达数十年之久（Levy 2010）。

代谢物水平不仅对基因组中发生的变化极其敏感，对环境中的变化也同样极其敏感。事实上，代谢物水平受到营养、活动、有害化学物质暴露、一天中的时间甚至外界温度的强烈影响（Bassini and Cameron 2014; Brown 2016）。由于代谢物是细胞内部事件（基因组）与细胞外部事件（环境）之间复杂相互作用的终产物，代谢组学方法使得对基因与环境之间相互作用的全面评估成为可能。既然生物体基因型与其环境相互作用的终产物（即基因型 × 环境）被定义为其表型，代谢组学就为科学家提供了一条理想的途径，可以实时测量生物体的表型或生理状态（Fiehn 2002）。这代表了代谢组学相对于基因组学的一个重要优势：基因组可以告诉你可能发生什么，而代谢组则能告诉你正在发生什么。

分析化学和计算数据分析技术的持续进步，正在使代谢组学对更广泛的学科领域变得更为可及。事实上，代谢组学如今已被常规用于疾病筛查、生物医学研究、药物发现、食品与营养分析、兽医学研究、作物评估、生物材料生产和环境监测（Holmes et al. 2008; Viant 2008; Kim et al. 2016; Wishart 2016）。这些代谢组学研究已取得一些引人注目的发现，例如鉴定出微生物来源的氧化三甲胺（TMAO）是动脉粥样硬化的关键驱动因素之一（Wang et al. 2011a），以及确定高血清支链氨基酸水平可以在 2 型糖尿病实际发病前 10–15 年预测谁将罹患该病（Wang et al. 2011b）。因此，代谢组学经历了迅猛增长——1999 年仅有两篇代谢组学论文发表，而到 2016 年已超过 3100 篇。

图 14.1 展示了代谢组学实验典型工作流程的示意图。首先，收集生物样品（如组织、器官、植物、细胞培养物中的细胞，甚至环境样品）。然后，使用液氮或其他快速冷冻技术对其进行代谢淬灭（metabolic quenching），随后进行提取或匀浆，以产生含有数百种代谢物的液体混合物。在大多数情况下，收集生物体液（如血液、尿液、树液或细胞培养基）要容易得多，因为这可以免去组织粉碎/提取的过程。一旦获得了合适的……

Figure 14.1 代谢组学实验典型工作流程示意图。实线框表示所有代谢组学实验中均需执行的步骤。虚线框表示依赖于样品类型的步骤。首先收集样品（如组织、器官、细胞或生物体液），然后快速"淬灭"以终止所有代谢反应。如果使用组织，则必须将样品研磨成细粉（在冷冻状态下）。随后对样品进行提取以获取代谢物，再进行分离或过滤（并非所有样品都需要分离/过滤）。此步骤之后，可通过核磁共振（NMR）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）或其他分析化学技术对样品进行分析。所得谱图随后被处理，代谢物被注释。注释后的数据使用各种统计和可视化技术进行进一步分析。最后，将代谢组学数据与其他类型的信息整合，进行进一步的生物学解释。FTIR，傅里叶变换红外光谱；MeOH，甲醇；PCA，主成分分析；PLS-DA，偏最小二乘判别分析；U/HPLC，超高效液相色谱。

Ch14 Metabolomics / Data Formats

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数据格式

代谢物提取物或生物体液获得后，需要通过一种或多种分析化学平台进行检测。这些分析平台可以是配备液相色谱（LC）或气相色谱（GC）系统的质谱（MS）仪器，也可以是核磁共振（NMR）仪器。偶尔也会使用其他类型的分析工具，如傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）或库仑阵列（电化学）系统。这些分析工具能够从复杂的化学混合物中分离、检测和表征数百甚至数千种化合物。在几乎所有情况下，NMR、GC-MS 或 LC-MS 仪器产生的谱图或色谱图都包含数百至数千个峰。因此，代谢组学的首要生物信息学挑战是拥有合适的软件工具来确定谱图中的哪些峰对应哪些化合物（即图 14.1 中的代谢物注释）。次要的生物信息学挑战是拥有合适的软件来确定哪些化合物或谱峰发生了显著变化及其原因（即图 14.1 中的数据分析与生物学解释）。

本章旨在概述进行代谢组学分析所需的生物信息学工具和数据库。全章分为六个部分：代谢组学简介、代谢组学不同数据格式的描述、主要代谢组学数据库的简要综述、代谢物鉴定或注释常用生物信息学工具的描述、多变量数据分析与可视化精选生物信息学工具的总结，以及代谢物和/或生物学解释的若干生物信息学工具的描述。希望深入了解代谢组学技术和分析工具的读者，可参阅涵盖这些主题的综述文献（Dunn et al. 2005; Wishart 2008; Naz et al. 2014）。

数据格式

代谢组学数据在本质上不同于基因组学或蛋白质组学数据。如第 1 章所述，基因组或蛋白质组学数据通常由 FASTA 格式（序列文件）或 FASTQ 格式（序列读段）的基因或蛋白质序列构成。而代谢组学数据一般由化学名称、化学标识符、化学结构及其对应的 MS 或 NMR 谱图组成。因此，代谢组学数据的大部分数据格式和格式规则归属于化学（而非分子生物学）以及化学信息学（而非生物信息学）范畴。这些化学数据标准遵循国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）制定的规则和建议。

在基因组学或蛋白质组学中，若鉴定出一个新基因或新蛋白质，通常根据其功能命名（例如"醇脱氢酶"）。如果功能尚不明确，也可以赋予一个完全随意的名称，如"Sonic Hedgehog"或"Reaper"。而若鉴定出一个新化合物，其正式名称则由其结构按照严格的 IUPAC 命名规则来定义。这些命名规则设计得足够完善，几乎任何化合物都可以仅凭其结构通过计算机程序自动命名。近年来，支持逆向过程（即由名称生成结构）的软件也已开发出来。若干商业软件包以及一些开放获取的软件工具和 Web 服务器（如 Openmolecules.org 和 OPSIN Web 服务器）可以执行名称到结构和结构到名称的转换操作。虽然 IUPAC 命名规范已被普遍采用，但在代谢组学中，许多化合物仍广泛使用通用名（common names）、品牌名（brand names）和同义名或俗名（trivial names）。鉴于通用名或俗名的歧义性，许多代谢组学研究者转向使用化学结构或标准化化学标识符来消除这种歧义。下面概述其中一些标识符。

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化学表示与交换格式

代谢组学研究者可以使用多达四种不同的数据格式选项来表示化合物或化学结构：文本字符串表示、指纹表示、二维（2D）结构（或连接图）表示和三维（3D）结构表示。

文本字符串表示是代谢组学中最简单且最广泛使用的化学表示方式，主要因其紧凑性和与常见编程语言的兼容性。最常用的文本字符串格式包括 SMILES 格式（Simplified Molecular Input Line Entry System；Weininger 1988）、InChI 字符串（International Chemical Identifier）和 InChI 键（Heller et al. 2015）。这三种格式在许多代谢组学软件包和数据库中广泛使用，不过 InChI 表示的优势在于完全规范化（canonicalized，标准化），并且可以在 Web 上进行完整查询。本质上，这三种格式都使用可编程规则将化学结构转换为描述原子类型和键连接关系的简单文本字符串。例如，氨基酸 L-丙氨酸可以用 SMILES 字符串"CC@HC(O)=O"、InChI 字符串"InChI=1S/C3H7NO2/c1-2(4)3(5)6/h2H,4H2,1H3,(H,5,6)/t2-/m0/s1"和 InChI 键"InChIKey=QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N"来表示。这些文本字符串表示相当于化学领域的 FASTA 序列格式。然而，通常无法通过 SMILES 或 InChI 标识符执行化学相似性搜索。与序列相似性搜索不同，化学相似性搜索必须通过子结构匹配和指纹表示来完成。

与化学结构的文本字符串表示不同，指纹表示能够编码足够的化学子结构信息，从而允许化学相似性搜索与匹配。这些指纹作为二元化学片段描述符，能够比文本字符串匹配更快速、更精确地进行结构匹配（类似于生物信息学中的序列或结构匹配）。L-丙氨酸的 Molecular Design Limited（MDL）或 Molecular ACCess System（MACCS 166）化学指纹示例如图 14.2 所示。在该表示中，共有 166 个位（0 和 1），每一位指示某一特定结构模式在该分子中存在（1）或不存在（0）。因此，大多数现代化学数据库将指纹作为其化学相似性搜索功能的基础。最常见的指纹格式包括 MDL 键（Durant et al. 2002）、Daylight 片段表示（Daylight Solutions）以及 Chemistry Development Kit（CDK）提供的指纹（Steinbeck et al. 2006）。

虽然 ASCII（American Standard Code for Information Interchange）文本字符串和二元指纹对计算机而言是理想的，但结构图像更适合人类使用。事实上，大多数代谢组学研究者以 2D 结构来思考化学物质。由于需要生成和共享化学结构的 2D 可视化表示，已经开发了若干用于化学结构表示的数据交换格式。所有这些格式都包含化合物的组成原子、键或键类型、原子连接关系及其分子坐标等信息。最常用的 2D 结构格式是 Structure Data Format（SDF）和 Molfile（MOL）文件格式（Dalby et al. 1992）。L-丙氨酸的 2D MOL 文件格式示例如图 14.3 所示。小分子的 3D 结构也可以用 SDF 和 MOL 文件格式来表示。在许多方面，SDF 和 MOL 格式相当于用于表示蛋白质、DNA 和 RNA 结构的 Protein Data Bank（PDB）格式（Westbrook and Fitzgerald 2003）。有趣的是，PDB 格式也广泛用于表示小分子的 3D 结构。此外，通常可以使用免费的数据交换工具（如 Open Babel；O'Boyle et al. 2011）将 PDB 格式文件转换为 SDF 或 MOL 格式文件。

Figure 14.2 L-丙氨酸的 Molecular Design Limited（MDL）化学指纹示例，旁边绘制了 L-丙氨酸的结构。指纹是二元位字符串，旨在生成特定分子特征的"位模式"。指纹编码不同的分子描述符集合、结构片段、分子内的原子连接路径或不同的药效团（pharmacophores）。

Figure 14.3 L-丙氨酸二维表示的 MOL 文件示例。前几行是标识符。前三列给出了 x,y,z 坐标，其中丙氨酸氮原子的坐标为 0.6740, −0.6740, 0.0000。连接表（六个原子之间的连接关系）位于坐标列表下方。例如，原子 2（α碳）通过单键与原子 1（氮）连接，连接表记录为 2 1 1（连接表的第一行）。同样，原子 4（羰基碳）通过双键与原子 6（氧原子）连接，连接表最后一行记录为 4 6 2。

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谱图表示与交换格式

除了明确的名称、文本表示和 2D（或 3D）结构之外，大多数小分子还需要关联特定的"参照性" NMR 或 MS 谱图。这些参照谱图不仅为化合物的存在提供实验证据，还提供一种独特且通常易于解读的信号特征，可在含有许多化合物的生物样本的复杂谱图中清晰地鉴定该化合物。谱图数据在代谢组学领域的重要性不可低估。事实上，在大多数代谢组学实验中，感兴趣的代谢物最终必须通过参照谱图库的谱图匹配来鉴定。这些谱图库包含数千条经过精心收集的单一、高纯度化合物的谱图。然而，为了使谱图匹配算法正常工作，谱图库的数据格式需要与查询谱图的格式兼容。幸运的是，现在已有多种用于存储、查询和共享 NMR 和 MS 谱图数据的通用数据交换格式。

历史上，交换小分子 NMR 和 MS 谱图数据的"官方"格式称为 JCAMP-DX，即 Joint Committee on Atomic and Molecular Physical Data eXtension。该数据格式由原子与分子物理数据联合委员会在 1980 年代开发（McDonald and Wilks 1988）。然而，JCAMP-DX 现已相当过时，正被多种更现代的可扩展标记语言（XML）格式所取代。这些格式包括：较为通用的 Chemical Markup Language（CML）（Kuhn et al. 2007）；用于处理质谱数据的 mzML（Deutsch 2017）；以及用于处理 NMR 谱图数据的 nmrML（Schober et al. 2018）。L-丙氨酸 nmrML 数据文件的一部分示例如图 14.4 所示。

Figure 14.4 L-丙氨酸的 nmrML 数据文件示例。实际文件长达数百行，包含 L-丙氨酸核磁共振（NMR）谱图的数字（字节格式）表示。nmrML 格式的价值在于头部信息，其中提供了关于 NMR 谱图采集和处理方式的丰富数据。

这些较新的谱图数据格式能够捕获更多元数据（metadata，即关于数据的数据），并能更好地反映 MS 和 NMR 光谱学的最新技术发展和现有需求。这些标记语言格式也专门针对代谢组学研究者的需求而设计，可用于捕获更多信息并注释纯化合物参照谱图以及复杂生物体液混合物的谱图。

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分子编辑器

如第 12 章所述，拥有合适的工具来可视化和编辑蛋白质、DNA 和 RNA 等大分子结构对于理解其功能、结合位点、作用机制、进化和整体架构至关重要。对小分子而言也是如此。由于代谢物结构比蛋白质或 RNA 结构小得多，通常可以使用一类称为"分子编辑器"（molecular editor）的软件程序手工绘制代谢物。分子编辑器不仅允许用户绘制结构，还允许用户交互式地编辑、操控和可视化化学结构。它们通常支持一种或多种标准文件格式（如 MOL 或 SDF）的读写和/或行记法（如 SMILES 或 InChI）的处理。所有分子编辑器都能显示 2D 化学结构，部分还支持 3D 化学结构和 3D 数据格式（如 PDB 或 PDBx/mmCIF）的转换与显示。大多数分子编辑器设计有大型中央绘图画布和专用面板或结构图标，允许用户选择、拖拽并放置子结构、原子或键到画布中。许多编辑器还允许将结构文件或 SMILES 文本字符串拖入绘图画布，即时将其渲染为结构以便进一步查看、操控或保存。表 14.1 提供了部分免费可用的分子编辑器和可视化工具列表。其中一些是独立程序，另一些则以 Web 应用形式提供。无论选择哪种程序，学会使用至少一款高质量分子编辑器对任何在代谢组学实验室工作的人来说都是必不可少的。

Table 14.1 免费可用的分子编辑器与可视化工具列表

2D，二维；3D，三维；IR，红外；NMR，核磁共振。

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谱图查看器

在代谢组学领域，化学谱图与化学结构同样重要。因此，拥有合适的工具来显示、注释和操控谱图对代谢组学的发展尤为重要。许多高质量的谱图查看工具随现代 MS 或 NMR 仪器一起销售。此外还有众多独立的第三方商业谱图查看/操控软件供应商。因此，专门用于查看红外（IR）、MS 和 NMR 谱图的免费独立程序相对较少。许多商业工具使用各自供应商的专有格式，但几乎所有谱图查看工具也支持一种通用谱图交换格式——JCAMP-DX（或 *.jdx）格式。两个使用 JCAMP-DX 的免费谱图查看工具是 JCAMP-DX Data Viewer 和 JDXview（见 Internet Resources），它们仅兼容 Windows 操作系统。一个开源 Java 版本 JSpecView 也已开发（Lancashire 2007），目前已成为 JSmol 的一部分。JSpecView（和 JSmol）是易于使用的、跨平台的谱图查看、注释和操控工具。

虽然兼容 JCAMP-DX 的查看器仍然主导该领域，但也有推动开发能够处理更现代数据格式（如 mzML 和 nmrML）的化学谱图可视化与编辑工具的趋势。其中两个较知名的免费工具包括 mMass（Niedermeyer 2016）——一个质谱处理工具，以及 JSpectraViewer（见 Internet Resources）——一个 NMR 谱图分析工具。mMass 是一个可下载的跨平台软件包，支持 mzML、mzXML 和 mzData 格式的读写，不仅允许质谱可视化和注释，还支持谱图平滑、基线校正、峰拾取（peak picking）和谱图去卷积（deconvolution）。JSpectraViewer 是一个基于 Web 的 JavaScript 工具，允许一维（1D）NMR 谱图的可视化和注释，以及傅里叶变换、相位校正、平滑、基线校正和峰标注。L-丙氨酸的 JSpectraViewer 截图如图 14.5 所示。JSpectraViewer 已与 Bayesil Web 服务器（Ravanbakhsh et al. 2015）集成，以支持各种生物体液的自动化 NMR 谱图去卷积分析。Web 化的结构和谱图查看工具或应用（如 Jmol、MarvinView 和 JSpectraViewer）的可用性，也在积极影响多个代谢组学数据库所提供的可用性和可视化功能。

Ch14 Metabolomics / Databases

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数据库

数据库是生物信息学的基石。如果没有 GenBank、UniProt 或 PDB 这样的数据库，基因组学或蛋白质组学领域就不会存在。同样，如果没有专门的代谢组学数据库，代谢组学领域也不会存在。在过去十年中，许多高质量的代谢组学或化合物数据库已被开发出来，以满足代谢组学界日益增长的数据需求。这些数据库包括：Human Metabolome Database (HMDB; Wishart et al. 2007)、PubChem (Wheeler et al. 2006)、Chemical Entities of Biological Interest database (ChEBI; Hastings et al. 2013)、LIPID MAPS (Fahy et al. 2007)、METLIN (Tautenhahn et al. 2012)、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; Kanehisa et al. 2014)、MetaboLights (Haug et al. 2013) 以及 Toxic Exposome database (Wishart et al. 2015)。这些数据库可大致分为四类：化合物数据库、光谱数据库、代谢通路数据库和物种特异性代谢组学数据库。Table 14.2 详细列出了各类别中的主要数据库及其内容简介。以下将对这些数据库的性质与内容作更详细的说明。

化合物数据库

化合物数据库是可搜索的化学名称和结构数据库，旨在尽可能广泛地覆盖已知化学"空间"。一般而言，化合物数据库更注重覆盖广度而非深度。鉴于其庞大体量，几乎所有现代化合物数据库都支持名称/文本搜索，以及用于结构相似性搜索的化学子结构或指纹匹配。世界上最大的公共化合物数据库是 PubChem (Wheeler et al. 2006)，由美国国家生物技术信息中心 (NCBI) 维护。PubChem 是一个归档型数据库，包含来自许多不同组织、实验室和公司提交的数据——最新统计已超过 350 家。目前，PubChem 包含超过 8000 万个独特化合物。每个条目包含化学结构信息、名称、同义词和标识符、物理性质以及供应商或来源信息。如有可用数据，PubChem 条目还包括药物与用药信息、用途与制造数据、安全数据、毒性信息、文献引用、通路数据和生物分子相互作用，以及化学分类信息。Figure 14.6 展示了 PubChem 数据库的一组截图。PubChem 与 PubMed 有广泛链接，许多 PubChem 化合物通过 PubMed 摘要提供了其生物活性的描述。鉴于其规模、可访问性和高标准，PubChem 在代谢组学研究者中尤为流行。然而，必须牢记的是，PubChem 中发现的化学物质中，真正属于生物化合物的不到 0.1%。

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Figure 14.5 L-alanine 的 JSpectraViewer 图像。JSpectraViewer 是一个 Java 小程序，也嵌入在 Human Metabolome Database 中。它正在显示 Figure 14.4 中所示的 nmrML 文件。

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Table 14.2 开放访问的化学、光谱、通路与代谢组学数据库列表

DB, database; MS, mass spectrometry; NMR, nuclear magnetic resonance.

在工业制造中使用过或曾释放到环境中的化合物更是少之又少。这意味着，在 PubChem 中搜索代谢组学或暴露评估实验的化合物匹配，将导致 99.9% 的假阳性率。

当然，PubChem 并非唯一可公开访问的化合物数据库。其他更专业化的化合物数据库也存在。这些数据库通常包含 PubChem 不常收录的不同类型的数据。

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(a)

(b)

Figure 14.6 PubChem 网页上分子 L-alanine 的两幅截图。(a) 大多数 PubChem 条目中可见的头部数据。(b) 为 L-alanine 收集的生物分子相互作用数据。PubChem 中 L-alanine 的实际条目还包含许多其他图像、超链接、化学/生物描述符和参考文献。

例如，ChemSpider (Williams 2008) 是一个备受好评的开放访问化合物数据库，包含超过 3000 万化合物。它以精心整理的化学同义词集合和丰富的光谱数据集合而闻名。然而，与 PubChem 类似，ChemSpider 中绝大多数化合物不是生物化合物，也不存在于环境中。其他值得关注的数据库包括 LIPID MAPS (Fahy et al. 2007)，一个包含超过 30 000 种生物脂质的综合性数据库；ChEBI (Hastings et al. 2013)，一个包含 40 000+ 生物相关化合物的数据库；以及 KNApSAcK (Nakamura et al. 2013)，一个包含近 30 000 种植物次生代谢物的数据库。LIPID MAPS、ChEBI 和 KNApSAcK 是较小的天然产物数据库的典型代表，对代谢组学研究者而言，它们通常比 PubChem 或 ChemSpider 更有用。

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光谱数据库

光谱数据库主要包含纯化合物的实验性一维 NMR、电子轰击离子化 (EI)-MS 或电喷雾离子化 (ESI) 串联质谱 (MS/MS) 光谱。这些参考光谱集合对于化合物鉴定或确认化合物身份至关重要。这种鉴定过程在代谢组学中尤为重要。虽然 Wiley、Aldrich、ACD/Labs 和 Bio-Rad 等公司出售若干优秀且非常全面的商业光谱库，但也有越来越多的免费开放访问光谱数据库。其中许多资源支持子光谱峰搜索或全局光谱匹配，以及标准文本查询。

开放访问的参考性 1H 和 13C NMR 光谱（在不同 NMR 场强下）可在 NMRShiftDB 和 NMRShiftDB2 (Steinbeck and Kuhn 2004)、BioMagResBank (Markley et al. 2008) 和 HMDB (Wishart et al. 2007) 中找到。NMRShiftDB2 包含超过 40 000 种化合物的近 52 000 条 1H 和 13C 光谱。遗憾的是，这些光谱中的大多数 (>90%) 并非来自生物化合物（即代谢物），而且大多数并非在水溶液中采集（水是大多数代谢组学实验的标准溶剂）。这种溶剂差异会导致化学位移和光谱峰的差异，使得通过光谱匹配进行化合物鉴定变得有一定困难。BioMagResBank 和 HMDB 包含约 1000 种常见代谢物的数千条高场 (400–700 MHz) NMR 光谱。几乎所有这些光谱都来自已知代谢物，且几乎全部在水溶液中采集。虽然目前可用于代谢组学的参考 NMR 光谱数量令人印象深刻，但与目前已公开可用的 EI-MS 或 ESI-MS/MS 光谱数量相比，这个数字就显得微不足道了。数十万条 ESI-MS/MS 和 EI-MS 光谱可通过 NIST（由美国国家标准与技术研究院维护的 MS 数据库）、MassBank of North America (MoNA; Kind et al. 2017)、MzCloud、METLIN (Tautenhahn et al. 2012) 和 Golm Metabolome Database (Kopka et al. 2005) 进行访问、查看和搜索。MoNA 是代谢组学的重要资源，包含来自 80 000 多种不同代谢物的超过 190 000 条实测和预测光谱。MoNA 还支持用户提交实测的 MS 和 MS/MS 光谱。Figure 14.7 展示了 MoNA 中 L-alanine 条目的一组截图。

使用这些 MS 数据库光谱的挑战在于，每种化合物通常由数十条不同的 MS 光谱表示，这些光谱是在不同的 MS 仪器上、在不同离子化条件或不同碰撞能量下、或经不同化学修饰后采集的。因此，虽然实验采集的 MS 光谱数量庞大，但这一多样化集合所代表的独特（母体）化合物实际数量可能不到 30 000。这只占已知或预期代谢物的一小部分（可能 <15%），而后者据估计超过 200 000 (Psychogios et al. 2011)。鉴于实验采集的 MS/MS 或 EI-MS 光谱严重短缺，且现有 MS 数据库在短期内不太可能有显著扩展，一些研究者已开始使用计算工具来预测 MS/MS 和 EI-MS 光谱，预测精度令人瞩目 (Allen et al. 2015, 2016)。许多这类 in silico MS 光谱现已可通过 Competitive Fragmentation Modeling and Identification (CFM-ID) 数据库 (Allen et al. 2014) 获取。无论 MS 光谱是实验采集的还是计算预测的，MS 数据库通过与 MS 光谱处理工具的整合，在化合物鉴定和化合物确认中发挥着日益重要的作用。

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(a)

(b)

Figure 14.7 MassBank of North America (MoNA) 中 L-alanine 的气相色谱-质谱联用 (GC-MS) 数据页面的两幅截图。(a) 化合物查询的典型结果页面。(b) L-alanine 的展开 GC-MS 光谱。

代谢通路数据库

代谢通路数据库提供一组集中的通路示意图，描绘当前关于细胞、组织或生物体内代谢过程（即分解代谢、合成代谢或信号传导过程）的知识状态。从这个意义上讲，代谢

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通路数据库在代谢组学数据的生物学解释和可视化中发挥着关键作用。一些最受欢迎的小分子通路数据库包括基于 Web 的资源，如 KEGG (Kanehisa et al. 2014)、Reactome database (Croft et al. 2011)、"Cyc" 系列数据库 (Karp et al. 2000)、WikiPathways (Kelder et al. 2012) 和 Small Molecule Pathway Database (SMPDB; Jewison et al. 2014)。此外还有一些商业通路数据库，如 BioCarta、TransPath（来自 BioBase, Inc.）和 Ingenuity Pathway Analysis（来自 Ingenuity Systems, Inc.）。

大多数代谢通路数据库的设计旨在促进跨多种物种的代谢和代谢物探索。这在增进我们对代谢诸多方面的演化与保守性的理解方面发挥了关键作用。覆盖物种范围广泛的通路数据库，如 KEGG 和 Reactome，倾向于使用非常通用且高度简化的通路图；而更具物种特异性的数据库，如 SMPDB，倾向于使用更丰富、更有细节色彩和内容的通路图。大多数通路数据库支持交互式图像映射，带有超链接信息内容，允许用户查看化学信息（点击化合物时）或基因/蛋白质简要摘要（点击蛋白质或酶时）。几乎所有通路数据库都支持某种有限的文本搜索，少数数据库如 Reactome、SMPDB 和 Cyc 系列数据库支持将基因、蛋白质和/或代谢物表达数据映射到通路图上。大多数通路数据库还以常见的机器可读数据交换格式提供其通路数据，如 BioPAX (Demir et al. 2010)、Systems Biology Markup Language (Hucka et al. 2003) 或 Systems Biology Graphical Notation Markup Language (van Iersel et al. 2012)。其他数据库，如 KEGG，则有自己独特的数据交换格式（称为 KGML 或 KEGG Markup Language）。更多关于通路数据库的信息可在第 13 章找到。

物种特异性代谢组学数据库

现代代谢组学数据库通常将化合物数据库、光谱数据库和通路数据库的所有功能整合到单一资源中。换言之，综合性代谢组学数据库必须是"一站式"资源，支持特定物种代谢组学研究的几乎所有环节。历史上，大多数代谢组学研究者对光谱或化合物数据库的需求如此迫切，以至于他们并不太关心数据来源于哪个物种。然而，如果不适当考虑所研究的物种，许多代谢组学发现和初步化合物鉴定很可能是不正确的。

目前有六个广泛使用的综合性代谢组学数据库。其中两个是代谢组学数据提交的归档资源，四个是精心整理的参考性数据库，旨在覆盖特定物种或特定环境的代谢组。两个归档数据库是 Metabolomics Workbench (Sud et al. 2016)，由加州大学圣地亚哥分校维护，以及 MetaboLights (Haug et al. 2013)，由欧洲生物信息学研究所 (EBI) 运行。MetaboLights 和 Metabolomics Workbench 是代谢组学领域对应于 GenBank 或 PDB 数据库的等效资源。两者都接受原始和经处理的代谢组学数据，并都支持代谢组学数据分析。两者还从提交的数据（及其他外部资源）中挖掘信息，提供参考性数据，如化合物结构、化合物名称、化合物浓度（如可用）和单个代谢物的光谱信息。这一"参考层"对代谢组学研究者具有重大价值，因为它提供了比较和确认初步化合物鉴定所需的数据。它还允许研究者开发代谢组学研究预测工具，并进行大规模代谢比较。

另一组精心整理的参考性代谢组学数据库包括 Human Metabolome Database (HMDB; Wishart et al. 2007)、E. coli Metabolome Database (ECMDB; Guo et al. 2013)、Yeast Metabolome Database (YMDB; Jewison et al. 2012) 和 Toxic Exposome Database (T3DB; Wishart et al. 2015)。HMDB 是一个综合性

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在线资源，包含关于人体中所有已知或预期的小分子代谢物的参考性信息。数据库包含四种类型的数据：化学数据、光谱数据、临床数据和分子生物学/生物化学数据。Figure 14.8 展示了 HMDB 的一组截图。该数据库最新版本包含超过 114 000 种化合物、5700 个蛋白质靶标、酶或转运蛋白、>18 000 条浓度数据、>45 000 通路图和 >330 000 条 MS/NMR 光谱（包括实验和预测光谱）。HMDB 还具有丰富的光谱与质量匹配工具以辅助化合物鉴定，以及文本、序列和化学结构搜索工具。HMDB 中的许多化合物是内源性代谢物，但大约四分之一的条目实际上来源于人类消费的食品（包括生鲜和加工食品）。另有 3% 的化合物来源于药物和药物代谢物。

ECMDB 和 YMDB 在结构、设计和内容上与 HMDB 相似。然而，Escherichia coli 和 Saccharomyces cerevisiae 是比人类更简单的生物，基因组更小、代谢过程更不复杂。因此，这些数据库中的信息量显著较少。具体而言，ECMDB 仅包含 3700 种化合物的数据，而 YMDB 包含不到 12 000 种化合物的数据。然而，对微生物代谢的了解远多于对人类代谢的了解。因此，ECMDB 有近 1600 条图示代谢通路，覆盖了近 90% 的代谢组；相比之下，HMDB 有 25 000 条通路，仅覆盖了人类代谢组的 20%。

与其他代谢组学数据库不同，T3DB 是一个暴露组数据库。暴露组 (exposome) 指的是一个生物体在其一生中可能接触的化学物质（主要是毒性或异源物质）的集合 (Wild 2005)。从这个意义上讲，T3DB 包含关于毒性环境化学物质的综合信息，如除草剂、杀虫剂、污染物，以及某些内源性毒素，如尿毒症毒素（干扰肾脏功能）或肿瘤代谢物 (oncometabolites，与癌症相关)。因此，T3DB 并非物种特异性数据库，而是环境特异性数据库。T3DB 中大多数关注的化学物质可在（或影响）人类、其他哺乳动物、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和植物中发现。T3DB 还包含关于生物靶标、结合常数、毒性机制和毒性浓度的详尽数据。所有这些物种特异性代谢组学数据库都配备了光谱和质量匹配软件以辅助化合物鉴定，以及文本、序列和化学结构搜索工具。

代谢物鉴定的生物信息学

绝大多数代谢组学实验以病例-对照研究的形式开展，旨在鉴定疾病的因果或预测性生物标志物。在代谢组学病例-对照研究中，对一定数量 (10–1000) 的正常或健康对照样本和近乎等量的"病例"（患病、经处理、受扰动）样本采集 NMR 和/或 MS 数据。在某些情况下，可能有两个或更多病例组。比较两组（或多组）并寻找区分各组的重要差异，通常是这类病例-对照研究的主要目标。无论研究如何设计，典型的代谢组学实验几乎总是会生成大量 MS 或 NMR 光谱数据（通常达数 GB）。分析和解释代谢组学数据的过程实际上与分析或解释转录组学（微阵列或 RNA-seq）数据或蛋白质组学数据的过程非常相似。这三种方法都需要：将原始数据转化为"特征"列表；使用多元统计将特征列表缩减为显著特征的

Ch14 Metabolomics / Bioinformatics for Metabolite Identification

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代谢物鉴定的生物信息学

在线资源，包含人类已知或预期的小分子代谢物的参考信息。该数据库包含四种类型的数据：化学数据、光谱数据、临床数据以及分子生物学/生物化学数据。HMDB的一组截图如图14.8所示。该数据库的最新版本包含超过114,000种化合物、5,700种蛋白靶标、酶或转运蛋白、>18,000条浓度记录、>45,000张通路图以及>330,000张MS/NMR谱图（包括实验谱图和预测谱图）。HMDB还拥有丰富的光谱匹配和质谱匹配工具，以促进化合物鉴定，以及文本、序列和化学结构搜索工具。HMDB中的许多化合物是内源性代谢物，但大约四分之一的条目实际上来源于人类食用的食品（包括原料和加工食品）。HMDB中另有3%的化合物来源于药物及药物代谢物。

ECMDB和YMDB在结构、设计和内容上与HMDB类似。然而，Escherichia coli和Saccharomyces cerevisiae比人类更为简单，基因组更小，代谢过程也更不复杂。因此，这些数据库中的信息量显著较少。具体而言，ECMDB仅有约3,700种化合物的数据，而YMDB的数据不足12,000种化合物。然而，人们对微生物代谢的了解远多于人类代谢。因此，ECMDB拥有近1,600条配图代谢通路，覆盖了近90%的代谢组；相比之下，HMDB拥有25,000条通路，仅覆盖人类代谢组的20%。

与其他代谢组学数据库不同，T3DB是一个暴露组（exposome）数据库。暴露组指生物体在其一生中可能接触到的化学物质（主要是毒性物质或外源性物质）的集合（Wild 2005）。在这方面，T3DB包含关于有毒环境化学物质的全面信息，如除草剂、杀虫剂、污染物，以及某些内源性毒素如尿毒症毒素（干扰肾功能）或肿瘤代谢物（与癌症相关）。因此，T3DB不是物种特异性的数据库，而是环境特异性的数据库。T3DB中关注的大多数化学物质存在于（或影响）人类、其他哺乳动物、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和植物。T3DB还包含关于生物靶标、结合常数、毒性机制和毒性浓度的详尽数据。所有这些物种特异性的代谢组学数据库都配备光谱匹配和质谱匹配软件以促进化合物鉴定，以及文本、序列和化学结构搜索工具。

代谢物鉴定的生物信息学

绝大多数代谢组学实验以病例-对照研究的形式进行，旨在鉴定疾病的因果性或预测性生物标志物。在代谢组学病例-对照研究中，对一定数量（10–1000）的正常或健康对照样本和几乎等量的"病例"（患病、接受处理、受到扰动）样本采集基于NMR和/或MS的数据。在某些情况下，可能有两个或更多病例队列。比较两组（或更多组）并寻找区分各组的重要差异，通常是此类病例-对照研究的主要目标。无论研究如何设计，典型的代谢组学实验几乎总会产生大量的MS或NMR光谱数据（通常达数GB规模）。分析和解释代谢组学数据的过程实际上与用于分析或解释转录组学（微阵列或RNA-seq）数据或蛋白质组学数据的过程非常相似。三种方法都要求：将原始数据转换为"特征"列表，使用多变量统计将特征列表缩减为显著性特征短列表，并确定这些显著性特征如何参与各种生物通路或过程。本章后续部分将描述如何进行这三个分析步骤。本节将聚焦于与靶向和非靶向代谢组学均相关的代谢物鉴定（Box 14.1）。

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Figure 14.8 Human Metabolome Database (HMDB) 中 L-alanine 条目的两张截图。(a) HMDB中化合物的典型metabocard条目。L-alanine的实际条目包含超过120个数据字段，涵盖该化合物的化学、生化及生物医学信息。(b) 与 L-alanine 相关的实验气相色谱（GC）和/或液相色谱-质谱联用（LC-MS）谱图列表。

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Box 14.1 靶向与非靶向代谢组学

代谢组学有两种不同的策略。在一种策略（称为非靶向代谢组学，untargeted metabolomics）中，化合物最初并不被鉴定。相反，首先提取（未命名或未鉴定的）光谱特征或光谱峰并进行统计分析，以识别最显著的特征或峰。只有在显著特征/峰被识别之后，才尝试鉴定对应这些峰的化合物。在另一种策略（称为靶向代谢组学，targeted metabolomics）中，首先通过仔细分析峰及其位置或模式来鉴定和定量特定化合物。然后将所得的化合物及浓度列表用多变量统计分析以识别最显著的代谢物。换言之，靶向代谢组学在第一步就鉴定代谢物，而非靶向代谢组学在最后一步才鉴定代谢物——如果真的能鉴定的话（Wishart 2011）。通常，非靶向代谢组学方法用于代谢物发现和假设生成，而靶向代谢组学方法用于生物标志物发现和假设确认。

两种策略各有优缺点。非靶向代谢组学高度适合自动化，并能产生对代谢物数据的无偏评估。然而，非靶向代谢组学不太擅长提供代谢物的绝对定量，这限制了其可重复性。此外，通过非靶向代谢组学发现的许多"重要"特征不易被鉴定。事实上，非靶向代谢组学研究中检测到的液相色谱-质谱联用特征中，通常仅有<2%被鉴定（da Silva et al. 2015）。这限制了可得出的结论以及以生物学有意义的方式解释数据的能力。与非靶向代谢组学相比，靶向代谢组学聚焦于化合物鉴定和绝对定量。这使得靶向代谢组学在不同实验室间更具可重复性。另一方面，靶向代谢组学对代谢组的视角更为有限或更有偏向，因为仅测量或鉴定了某些预先选定的代谢物。典型的靶向代谢组学研究可产生50至200种化合物的定量数据。然而，随着该领域最近的进展，许多靶向研究中通常测量的代谢物数量正在增加。因此，越来越多的偏好倾向于使用靶向代谢组学而非非靶向代谢组学（Wishart 2011）。

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代谢物鉴定的等级

并非所有代谢物都能同等程度地被鉴定——至少使用代谢组学方法不行。根据代谢组学标准倡议（Metabolomics Standards Initiative, MSI）（Sumner et al. 2007），代谢物鉴定分为四个等级：确定性鉴定化合物（等级1）、推定性鉴定化合物（等级2）、推定性鉴定为某化合物类别的化合物（等级3）和未知化合物（等级4）。确定性鉴定化合物指那些具有名称、已知结构、Chemical Abstract Services编号或InChI标识符的化学物质。要归入此类别，化合物必须在相同或近乎相同的数据采集条件下，使用纯化的真实标准品（authentic standard），通过两个独立的正交参数（至少对于MS而言）进行鉴定。这些正交参数包括：保留时间/指数 + 质谱图、精确母离子质量 + MS/MS谱图，或精确母离子质量 + 同位素丰度模式。对于NMR，与真实标准品的1H NMR谱图精确匹配（通过光谱反卷积）或与真实加标标准品的谱图匹配即可达到等级1标准。推定性鉴定化合物（等级2）指仅有一个分析测量值与真实化合物匹配（仅保留时间或仅精确母离子质量）的化合物，或其NMR谱图特别简单（一两个峰）以致其真实身份存在一定模糊性的化合物。当然，如果该化合物已知存在于所研究的生物体液或提取物中（如大量文献报告所表明），则这些推定性化合物鉴定更为可靠，可被视为"近确定性"鉴定。

化合物鉴定的第三等级是许多脂质的典型情况，其确切结构无法完全确定，但已知属于特定的脂质类别（磷脂或甘油三酯），或者已知一个模糊的化学结构（即PC(38:3)——意为一种磷脂酰胆碱，具有两条酰链，总共38个碳原子和3个不饱和键）。化合物鉴定的第四等级是"未知"类别。在代谢组学中，既有"已知未知"（known unknowns），也有"未知未知"（unknown unknowns）。"已知未知"指先前已有描述（在文献或数据库中）但在所研究样本中尚未确定性或推定性鉴定的代谢物。而"未知未知"是真正的新代谢物，从未在文献中被描述或被任何人正式鉴定（据其所知）。通常，一种化合物被标注为"未知"仅仅是因为研究者在其分析中不够彻底，或其用于化合物鉴定的软件/数据库不够充分、不完整或太小。这些未知物在技术上属于"已知未知"。在代谢组学论文、海报或报告中报告化合物时，始终建议在表格中注明每种化合物被鉴定的确切等级（1、2、3或4）。

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基于NMR的化合物鉴定

在NMR中进行代谢物鉴定的标准方法是使用光谱反卷积（spectral deconvolution）。光谱反卷积的思路是将复杂谱图简化为各个"纯"化学成分的单独谱图。NMR中的这一过程如图14.9所示。在代谢组学中，光谱反卷积意味着将对应复杂化学混合物（如血液或尿液等生物体液）的谱图还原为其各个（纯）化学成分的谱图。该过程通常需要专门构建的光谱数据库，以及专门开发的光谱拟合软件。光谱反卷积中使用的光谱数据库应由已知或预期存在于所研究生物样本中的纯化合物参考谱图组成。这些参考谱图必须在与生物体液分析完全相同的条件（即相同的pH、相同溶剂、相同盐浓度和相同温度）下采集。

如图14.10b（下方图像）所示，典型的生物混合物的1H NMR谱图由数百至数千个尖锐峰组成。该混合物中的单个化合物平均包含10–15个不同的峰或峰簇（具有不同的强度、自旋偶合和线形），分布在NMR谱图的不同位置。通过将单个参考谱图库与观测的混合物谱图进行适当匹配和拟合，可以同时鉴定和定量混合物中的大多数化合物（Wishart 2008）。光谱反卷积对NMR特别有效的一个原因是，大多数代谢物具有独特的、几乎不变的化学位移指纹，由多个化合物特异性峰组成。与单个化合物相关的NMR峰的多重性有助于减少光谱冗余问题。换言之，在NMR中，随机选取的两个化合物不太可能具有相同数量的峰以及相同的化学位移、峰强度、自旋偶合或线形。

有多款商业软件支持NMR光谱反卷积用于代谢物鉴定，包括AMIX（Bruker）和NMR Suite（Chenomx）。两款软件包都拥有包含数百种代谢物的大型NMR光谱库。用户必须手动点击、拖拽和调整参考谱图的大小以获得良好的光谱拟合。这些软件包的新版本现在支持半自动反卷积以实现更高通量的分析。最近，Bruker推出了WineScreener和JuiceScreener软件包，可对葡萄酒、果汁甚至蜂蜜的NMR谱图进行全自动反卷积。然而，该软件必须与专门设计的NMR谱仪一起购买，这使得投资成本非常高。

除NMR光谱反卷积的商业软件包外，最近还有几款免费软件包或Web服务器可用。这些包括Bayesil（Ravanbakhsh et al. 2015）和BATMAN（Hao et al. 2014）。BATMAN是一个可下载的软件包，使用贝叶斯统计自动反卷积1D 1H NMR谱图。它可以同时鉴定和定量化合物；但要求用户在拟合过程之前手动对NMR谱图进行相位校正、化学位移参比和基线校正。这可能导致不同用户之间代谢物定量结果的显著差异。BATMAN使用的拟合算法也相当慢（需要数小时才能完成），且仅能处理20–25种化合物的混合物（排除了大多数生物体液）。另一方面，Bayesil非常快速（<2分钟）且可处理多达60种化合物的混合物。Bayesil还自动执行光谱相位校正（调整NMR峰的形状使其完全出现在基线之上）、化学位移参比（定义0.00 ppm原点）和基线校正（使基线或无峰区域完全平坦），从而确保更高的可重复性和实验室间一致性。Bayesil Web服务器支持对血清、血浆、唾液、脑脊液和粪便水在多种NMR谱仪频率（500、600、700 MHz）下的自动反卷积。Bayesil Web前端的一组截图如图14.10所示。

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Figure 14.9 基于核磁共振（NMR）的代谢组学中光谱反卷积工作原理的简化示意图。化合物A、B和C的NMR谱图是顶部所示混合物谱图的组成部分。

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Figure 14.10 Bayesil Web服务器的两张截图。(a) 人血清的核磁共振谱图。(b) 葡萄糖的光谱拟合（及相应的反卷积结果），在该血清样本中葡萄糖浓度被测定为4579.9 μM。

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基于GC-MS的化合物鉴定

GC-MS和LC-MS的光谱反卷积过程如图14.11所示。从图中可以看出，来自代谢物混合物的典型GC-MS谱图或总离子色谱图（total ion chromatogram, TIC）由数十个尖锐峰（对应离子计数）组成，覆盖约30–45分钟的洗脱时间。每个峰可能包含一个或多个来自一种或多种化合物的EI（电子轰击离子化，electron ionization）质谱图（图14.11）。多种商业GC-MS反卷积工具可用于反卷积GC-MS和EI-MS谱图，如自动质谱反卷积与鉴定系统（Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System, AMDIS）、反卷积与报告软件-DRS（Agilent）、ChromaTOF（Leco）和AnalyzerPro（SpectralWorks）。提取EI-MS谱图后，代谢物鉴定的方式与NMR类似。即：将混合物中提取的EI-MS谱图逐个与包含数千种纯化、衍生化和验证化合物的EI-MS谱图的光谱参考库进行比较。EI-MS谱图通常由多个不同强度或丰度的m/z峰组成。与具有特征峰形和多重峰（multi-peak）模式的NMR谱图不同，MS谱图可视为对应于质量和强度的单线或细条。因此，查询MS谱图与参考MS谱图的相似性可以更简单地使用称为匹配因子（match factor, MF）的指标来评估，其定义为查询谱图和参考谱图强度的归一化、质量加权乘积，公式如下：

MF = 1000 × (∑_wM [I_qry × I_ref]^1/2)² / (∑I_qry^M × ∑I_ref^M)

其中，I_ref对应参考谱图的强度，I_qry对应查询谱图的强度，M对应质量（m/z），w为用于惩罚不确定峰的加权项（Stein 1999）。一般规则是，EI-MS谱图之间的初步匹配需要在0–1000的量表上得分>600，1000为完美匹配。

基于GC-MS的化合物鉴定有三个关键因素：提取的查询谱图质量、光谱匹配算法的质量或复杂程度，以及参考光谱数据库的质量和全面性。查询谱图的质量取决于仪器（其色谱柱、灵敏度和分离参数）以及光谱反卷积软件。假设仪器条件已优化，关键问题通常是反卷积软件的性能。与NMR中假阳性峰极其罕见不同，GC-MS经常充斥大量假阳性峰。在某些情况下，GC-MS谱图中多达50%的特征是来自色谱柱基质、衍生化试剂或代谢物本身的碎片、加合物或衍生物。一项有趣的研究（Lu et al. 2008）使用由35种浓度变化范围很大的化合物组成的定义混合物，比较了三种最常用的GC-MS反卷积软件包（AMDIS、ChromaTOF和AnalyzerPro）。这些作者发现AMDIS和ChromaTOF软件包产生了异常多的假阳性或假/不纯谱图，而AnalyzerPro软件包总体表现最佳。

最终，决定GC-MS化合物鉴定成功（或失败）的主要因素是光谱参考数据库的大小和质量。最常用和最广泛使用的资源是NIST的质谱数据库。最新版本包含近200,000种化合物或衍生化化合物的EI-MS谱图，以及另外21,800种化合物的保留指数值。然而，NIST中的大多数化合物并非代谢物或并非来自生物材料。这可能导致许多假阳性鉴定，特别是如果不使用真实标准品验证化合物身份时。其他数据库虽然规模较小，但可能更适合代谢物鉴定。这些包括Golm Database（Kopka et al. 2005）、Fiehn Metabolome Database（BinBase）和HMDB（Wishart et al. 2007）。所有这些数据库均以AMDIS兼容格式提供保留指数数据和EI-MS数据。Golm数据库主要面向植物，而BinBase和HMDB更面向哺乳动物。

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Figure 14.11 基于气相色谱（GC）和/或液相色谱-质谱联用（LC-MS）的代谢组学中光谱反卷积工作原理的示意图。从色谱图中提取峰，然后将MS、电喷雾离子化（ESI）-串联质谱（MS/MS）或电子轰击离子化（EI）-MS谱图与已知化合物谱图库（在MS或MS/MS数据库中）进行比较以鉴定化合物。

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基于LC-MS的化合物鉴定

如图14.11所示，来自代谢物混合物的典型LC-MS谱图由许多尖锐峰（对应离子计数）组成，覆盖约10–35分钟的洗脱时间。每个峰可能包含来自一种或多种化合物的一个或多个ESI m/z值。因此，LC-MS代谢组学研究很容易产生大量的光谱特征或推定性化合物（>10,000）。这远多于NMR或GC-MS所见。这些LC-MS特征中有许多实际上是噪声峰、色谱柱污染物、源内碎片、加合物和同位素变体。因此，LC-MS数据通常需要大量的后处理和峰整合以将峰数减少到可靠的可计数数量（优选<2000种推定性化合物）。

LC-MS数据通常还因液相色谱数据逐次运行间的变异性显著大于NMR或GC-MS数据而更加复杂。因此，通过LC-MS技术获取的代谢组学数据通常需要额外的去噪、对齐和平均处理，以确保选择和比较正确的峰。进一步的数据缩减通常使用更复杂的统计方法（将在

Ch14 Metabolomics / Multivariate Statistics

多变量统计 459

利用母离子的精确质量测量（单独使用），也可以通过将 MS/MS 碎片模式与相应的 MS/MS 光谱库进行匹配来尝试鉴定代谢物。通过精确母离子质量（或者更准确地说，质荷比 m/z）测量进行代谢物鉴定，需要使用超高分辨质谱仪器，如 QTOF、Orbitrap 或傅里叶变换离子回旋共振（FT-ICR）质谱仪。如果母离子质量被测量到小数点后四到五位，对应质量精度 <5 ppm，通常可以通过化学式计算器确定该离子的分子式及其推定身份（level 3 鉴定）。目前有多种商业 MS 化学式计算器，包括 SigmaFit（Bruker）、Formula Predictor（Shimadzu）和 MassHunter（Agilent），以及若干免费软件包，如 7-Golden-Rules（Kind and Fiehn 2007）和 SIRIUS（Böcker et al. 2009）。通过限制代谢物中常见的元素类型（即 C、N、O、S、H 和 P），以及对氢碳比、同位素丰度和其他若干专家规则提出要求，通常可以进一步缩小可行化学式的数量，常常可缩小 15 倍或更多（Kind and Fiehn 2010）。遗憾的是，即使有了这些改进，基于母离子的代谢物鉴定仍然风险很高，因为在现有化合物数据库中，仍有许多质量或分子式可以匹配数十种代谢物。对于大多数 LC-MS 代谢组学研究者而言，首选的代谢物鉴定途径是同时使用母离子（或分子式）匹配和 MS/MS 光谱匹配。MS/MS 光谱具有特征性的碎片模式，可提供关于分子及其化学结构的重要信息。LC-MS/MS 光谱匹配的成功与否，关键在于是否有仪器特异性或条件特异性的 MS/MS 产物离子碎片库。其中许多库与前面提到的仪器配套软件捆绑在一起。另一方面，公共 MS/MS 数据库，如 METLIN（Tautenhahn et al. 2012）、MoNA 和 HMDB（Wishart et al. 2007），通常由免费软件包（XCMS、MS-DIAL 和 MZmine）用于执行 MS/MS 光谱匹配。即使拥有最好的光谱数据库和最好的光谱处理工具，通过非靶向 LC-MS 代谢组学方法，仍然很难有信心地鉴定（MSI level 2）并部分定量超过 200–300 种代谢物。靶向 LC-MS 代谢组学（使用多反应监测和同位素稀释分析）通常可以鉴定并准确定量约 150–250 种代谢物。

多变量统计

靶向代谢组学在每次样品运行中可以轻松产生数十到数百种代谢物，而非靶向代谢组学则可以轻松产生数千个特征或峰。无论使用哪种方法，代谢组学实验都会产生包含数千个变量的庞大列表——这与蛋白质组学或转录组学实验十分类似。因此，代谢组学研究者经常借助蛋白质组学或转录组学中常用的计算机工具和计算机统计分析方法。由于每个生物体液样品通常关联数百到数千个变量（即代谢物、代谢物浓度或峰值），因此必须使用的统计技术称为多变量统计（multivariate statistics）。在多变量统计中，变量被称为"维度"（dimensions）。多变量统计的主要目标之一是减少变量或维度的数量，从而使问题可以用传统的单变量统计方法更简单地处理，例如 Student t 检验或方差分析（ANOVA）技术（见第 18 章）。具体而言，多变量统计使用一类称为降维（dimensionality reduction）的数学技术，使多变量数据看起来更像单变量数据。降维使我们能够识别大型多变量数据集中包含最大信息量或最大化组间差异的关键成分。因此，降维将一长串代谢物（或基因或蛋白质）缩减为最显著的代谢物（或基因或蛋白质）的较短列表。降维最常见的形式称为主成分分析（principal component analysis, PCA）。

主成分分析

PCA 是一种无监督聚类技术。聚类是将一组对象分组的过程，使得同一组内的对象彼此之间比与其他组的对象更加相似。聚类有助于根据代谢、基因组或蛋白质组参数区分不同组别，如病例组和对照组。PCA 也称为奇异值分解（singular value decomposition）或特征向量分析（eigenvector analysis），它基于数据中的相关特征进行聚类。PCA 可以使用多种免费或近乎免费的软件程序轻松完成，如 MATLAB 或 R 编程语言（使用 R 的 prcomp 或 princomp 命令）。PCA 也可以使用可免费下载的软件包执行，如 XCMS（Smith et al. 2006）、MS-DIAL（Tsugawa et al. 2015）、MAVEN（Melamud et al. 2010）和 Galaxy-M（Davidson et al. 2016），这些软件包均常用于处理 LC-MS 数据。处理 NMR 数据可使用 MVAPACK（Worley and Powers 2014）执行 PCA。还有一些免费可用的网络服务器支持 PCA 及其他常用多变量统计技术，包括 Meta-P 服务器（Kastenmüller et al. 2011）、MeltDB（Kessler et al. 2013）和 MetaboAnalyst（Xia et al. 2015）。这些网络服务器提供易于使用的图形界面，允许用户通过简单的点击操作执行复杂的多变量统计分析，或生成彩色的交互式图表。MetaboAnalyst 在代谢组学界尤其流行，近三分之一的已发表代谢组学论文使用了这一免费网络服务器。

PCA 是一种统计方法，它为一组数据点确定最优线性变换，使得该样本的属性沿少数坐标轴（或主成分轴）最为清晰地呈现。PCA 使代谢组学研究者能够基于代谢物及其浓度的共有特征的线性组合，轻松绘制、可视化和聚类多组代谢物列表。Figure 14.12 给出了 PCA 的简化图解说明。这里我们使用手电筒在墙上投射阴影的类比来寻找某个对象的"最大信息投影"。在此例中，我们试图将一个三维对象降为一系列最大信息量的二维投影，从而使我们能够重建原始对象的适当模型。如果感兴趣的对象是一个厚环或圆环面（torus），那么将手电筒正对着环面照射，就会产生特征性的"环形"阴影。另一方面，如果手电筒对准环的边缘照射，所产生的阴影将是信息量较少的香肠状。如果单独使用这个香肠状阴影，很可能会导致观察者对对象的形状做出错误判断。然而，通过将环形阴影与香肠状阴影（即两个主成分）结合起来，就可以重建原始三维环或圆环面的形状和厚度。

Figure 14.12 使用简化的手电筒投影类比来说明主成分分析的概念。

虽然这个例子展示了三维对象如何将其关键成分缩减为二维，但 PCA 的强大之处在于它对超维（多维）对象同样适用。

PCA 在代谢组学中最常用于确定一个或多个样品是否与其他样品不同。它还可以识别哪些变量对这种差异贡献最大，以及这些变量是以相同方式（即相关）还是独立地（即不相关）起作用。PCA 特别有吸引力的原因在于它允许直观地检测样品聚类或分组。具体而言，PCA 的结果通常从得分（scores）和载荷（loadings）两个方面进行讨论。得分表示新坐标系中的原始数据，载荷是投影过程中应用于原始数据的权重。使用两组得分（一组用于 X 轴，一组用于 Y 轴）绘制数据将产生"得分图"（scores plot）。Figure 14.13 展示了使用 MetaboAnalyst 生成的三维 PCA 得分图示例（Xia et al. 2015）。

Figure 14.13 三维主成分分析（PCA）"得分"图，显示对四组饲喂不同日粮的牛的瘤胃液进行分析所获得的分离。每个主成分对解释方差的百分比贡献标注在三个轴上。

要了解该图像是如何生成的，我们简要概述其过程。首先，进入 MetaboAnalyst 主页（见 Internet Resources）。在主页顶部，选择 Click here to start，然后在 Module Overview 页面左上角点击 Statistical Analysis 按钮（Figure 14.14）。

Figure 14.14 MetaboAnalyst Module Overview 页面。该页面允许用户选择分析模块来处理或可视化其数据。

然后，在 Data Upload 页面向下滚动，在页面下半部分找到 Try our test data 部分。使用单选按钮选择第二个浓度数据集（标注为 Metabolite concentrations of 39 rumen…），然后点击页面底部的 Submit 按钮（Figure 14.15）。

Figure 14.15 MetaboAnalyst Data Upload 页面。该页面允许用户上传自己的数据或选择要使用的测试数据集。在此特定示例中，已选择 Try our test data 中列出的第二组数据。

此操作将数据集加载到 MetaboAnalyst 中。跳过数据完整性检查后，导航至 Data Normalization 页面。该页面允许用户对数据进行缩放和归一化，使其更适合标准统计分析。对于此特定数据集，在归一化选项中选择 Normalization by a pooled sample from the group，并从下拉菜单中选择 group 0。将 Data transformation 设为 None，Data scaling 保持 Auto scaling（Figure 14.16）。

Figure 14.16 MetaboAnalyst Data Normalization 页面。已选择最优的归一化和缩放操作。

点击页面底部的 Normalize 按钮，然后点击 View Result 按钮。归一化和缩放操作的结果以弹出窗口显示（Figure 14.17）。

Figure 14.17 MetaboAnalyst Data Normalization and Scaling 结果，在点击 Figure 14.16 所示 Data Normalization 页面底部的 View Result 按钮后生成。弹出窗口可以通过点击右上角的 X 关闭，也可以应用替代的归一化或缩放函数。尝试找到比文中建议的更好的缩放/归一化函数组合。

注意，之前非常"偏斜"的浓度数据（左侧）现在在右侧的分布中看起来更呈钟形（即高斯分布）。将数据变换为这种形态很重要，这样才能进行标准统计分析。查看结果后，关闭弹出窗口并点击 Proceed 按钮（Figure 14.16）。完成这些早期数据处理步骤后，就可以开始进行 PCA 分析了。

MetaboAnalyst 包含 16 种支持代谢组学数据分析的统计方法。这些统计方法分为五个类别：单变量分析（univariate analysis）、多变量分析（multivariate analysis）、显著特征鉴定（significant feature identification）、聚类分析（cluster analysis）以及分类与特征选择（classification and feature selection）。多变量方法包括 PCA 和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）等。

要对所考虑的数据集执行 PCA，在点击 Proceed 按钮后出现的页面上（位于 Chemometrics Analysis 标题下）点击 PCA 超链接。几秒钟后，PCA 结果将呈现在一个多面板页面中。默认面板显示前五个 PC 之间的成对得分图。每个 PC 解释的方差显示在相应的对角线单元格中。点击页面顶部的 2D Scores Plot 选项卡可获得更详细的得分图，默认为 PC1-PC2（Figure 14.18）。

Figure 14.18 二维主成分分析（PCA）"得分"图，显示对四组饲喂不同日粮的牛的瘤胃液进行分析所获得的分离。每个主成分（PC）对解释方差的百分比贡献标注在两个轴上。详见正文。

这两个成分解释了样品中 >70% 的变异。我们可以看到组 0、15、30 和 45 之间的主要分离方向。组 0 和组 45 分离良好，而组 30 与组 15 和组 45 均有显著重叠。点击 3D Scores Plot 选项卡将生成 Figure 14.13 所示的图像。

在某些情况下，无论使用多少个 PC，PCA 都无法识别出任何明显的分组。如果是这种情况，明智的做法是接受该结果，并假设推定的类别或组别无法区分。一般而言，如果 PCA 分析连适度的组间分离都未能实现，那么使用其他统计技术来尝试分离它们可能也不值得。

PCA 也是量化数据中有效信息含量的非常有用的技术。这通常通过在 PCA"载荷图"（loadings plot）中绘制各成分的权重来实现。要通过 MetaboAnalyst 生成载荷图，可以使用与上述完全相同的流程，但不要点击 2D Scores Plot（生成 Figure 14.18 的选项），而应点击 Loadings Plot 选项卡，该选项卡显示 PC1 和 PC2 的载荷（Figure 14.19）。

Figure 14.19 主成分分析（PCA）"载荷"图，显示驱动 Figure 14.18 中"得分"图所见分离的最具信息量或统计显著的代谢物。详见正文。

注意，原始得分图中的分离方向是从左下到右上（对角线方向）。通过观察载荷图中位于右上和左下区域的化合物，可以识别驱动分离的最有影响力的化合物。可以通过点击图中的各个点来实现，这会在图的右上角生成一个箱线图。在此例中，位于右上方的天冬氨酸（aspartate）、异丁酸（isobutyrate）和 3-苯基丙酮酸（3-phenylpyruvate），以及位于左下方的内毒素（endotoxin）、葡萄糖（glucose）和甲胺（methylamine）是驱动此分离的关键代谢物。需要注意的是，这种显示特定代谢物身份的载荷图只有在化合物已通过靶向代谢组学方法鉴定和定量的情况下才可能实现。如果化合物在分析前未被鉴定（如非靶向代谢组学），则载荷图可用于将特征或峰列表缩小到仅少数需要鉴定的重要特征。

偏最小二乘判别分析

PCA 是可用于鉴定重要代谢物或光谱特征的众多多变量统计方法之一。另一种可用于此目的的多变量统计方法称为有监督分类（supervised classification）。有监督分类器要求在运行分析之前提供关于类别身份的信息。换言之，利用关于哪些样品属于"病例"以及哪些样品属于"对照"的先验知识来标记每个样品。有监督分类器的例子包括软独立建模类类比（Soft Independent Modeling of Class Analogy, SIMCA）、PLS-DA 和正交潜在结构投影–判别分析（Orthogonal Projection of Latent Structures – Discriminant Analysis, OPLS-DA）。所有这些技术都可用于将大量的 NMR、LC-MS/MS 和 GC-MS 代谢物列表（针对靶向代谢组学）或其对应的光谱特征（针对非靶向代谢组学）转化为短得多的、高度显著的代谢物和/或特征列表。

PLS-DA 常在 PCA 技术未产生预期聚类时使用。具体而言，PLS-DA 可用于增强 PCA 得分图中数据点之间的分离，其方式本质上是旋转 PCA 成分以使各类别之间获得最大分离。这种分离增强使我们能够更好地理解哪些变量对分离所观察到的（或表观的）类别最为重要。PLS-DA 的基本原理与 PCA 类似。然而，在 PLS-DA 中使用了第二部分信息——标记的类别身份集合。这一额外信息用于优化 PC 并训练聚类过程。形式上，PLS-DA 是 PCA 的分类扩展，它利用先验类别信息来尝试最大化测试变量与训练变量之间的协方差。

继续前面描述的 MetaboAnalyst 示例，在生成和分析 PCA 图之后，可以轻松生成 PLS-DA 图。为此，返回 MetaboAnalyst 分析页面并点击页面上的 PLSDA 超链接。注意有多个 PLS-DA 选项（regular PLS-DA、sparse PLS-DA 和 orthogonal PLS-DA），请确保选择常规版本。等待 5–10 秒让 MetaboAnalyst 完成其默认分析。结果随后呈现在多面板页面中，默认显示前五个成分的成对得分图。点击页面顶部的 2D Scores Plot 选项卡查看前两个 PLS 成分之间的得分图（Figure 14.20）。PLS-DA 获得了比 PCA（Figure 14.18）好得多的分离。由此可以对 PLS-DA 分离质量进行额外评估，方法包括置换检验或绘制下文讨论的 R2/Q2 数据。

Figure 14.20 偏最小二乘判别分析（PLS-DA）图，显示对四组饲喂不同日粮的牛的瘤胃液进行分析所获得的分离。详见正文。

使用 PLS-DA 方法时必须谨慎，因为这些分类技术可能被过度训练。也就是说，PLS-DA 可能产生看似令人信服的聚类或类别，但它们在训练数据之外不可推广（即对数据过拟合）。避免这些问题的最佳方法是在独立数据集上测试所得模型。然而，独立数据并非总能获得，因此解决过拟合问题的一个实用方法是使用 N 折交叉验证（N-fold cross-validation）方法或置换（随机重标记）方法来评估 PLS-DA 所导出的数据聚类的可推广性。许多免费可用的代谢组学软件包和网络服务器（如 MetaboAnalyst 和 Galaxy-M）可以执行这些检验。

评估 PLS-DA 模型的另一种定量方法是报告 R2 和/或 Q2 值。代谢组学网络服务器和软件包（如 MetaboAnalyst 或 SIMCA）通常同时报告 R2 和 Q2。Figure 14.21 展示了 MetaboAnalyst 生成的 R2/Q2 图示例。

Figure 14.21 MetaboAnalyst 使用正文中 MetaboAnalyst 示例所描述的牛饲喂实验相同数据生成的 R2/Q2 图示例。

R2 是相关指数，指拟合优度或解释变异（explained variation）。另一方面，Q2 指预测变异或预测质量（predicted variation）。R2 是一个定量指标（最大值为 1，最小值为 0），指示 PLS-DA 模型在数学上再现数据集中数据的能力。拟合较差的模型 R2 约为 0.2 或 0.3，而拟合良好的模型 R2 约为 0.7 或 0.8。为防止过拟合，通常还需确定 Q2（其最大值也为 1，最小值为 0）。Q2 通常通过交叉验证或置换检验来估计，以评估模型相对于 PLS-DA 模型中所用成分数的预测能力。在实践中，Q2 通常与 R2 非常接近。然而，如果 PLS-DA 模型出现过拟合，Q2 达到最大值后便会开始下降。一般而言，Q2 > 0.5 被认为是良好的，而 Q2 为 0.9 则是出色的。

从 PLS-DA 分析中，可以利用所得数据生成另一种图，称为投影变量重要性（variable importance in projection, VIP）图。Figure 14.22 展示了 VIP 图示例。用于创建此 VIP 图的数据与本节开头 PCA 和 PLS-DA 示例中使用的数据相同。每个代谢物的重要性沿 X 轴以数值表示（VIP 得分或回归系数），而代谢物名称及其排名（按重要性排序）显示在 Y 轴上。一般而言，VIP 得分大于 1.0 为显著，VIP 得分大于 2.0 为非常显著。从该图中可以看到，通过 PCA 载荷图识别出的相同显著代谢物再次通过 VIP 图被识别，天冬氨酸、异丁酸、3-苯基丙酮酸、内毒素、葡萄糖和甲胺位于 VIP 图的顶部，因此最为重要。

还有多种其他分类方法和代谢物/特征选择程序，它们使用统计方法（如 OPLS-DA）或机器学习协议（如支持向量机、随机森林技术和人工神经网络）来帮助从代谢物或光谱特征的起始列表中鉴定显著代谢物/特征。这些相同技术可以与逻辑回归或线性回归技术结合使用，以鉴定重要的代谢物生物标志物。许多此类高级分析可以通过 MetaboAnalyst 等工具轻松访问。关于 MetaboAnalyst 及其如何辅助代谢组学数据分析、生物标志物检测和数据缩减的更详细综述，参见 Xia and Wishart (2016)。

Ch14 Metabolomics / Bioinformatics for Metabolite Interpretation

┌─ Reasoning ──────────────────────────────────────────────────────────────────┐

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代谢物解读的生物信息学

识别显著性代谢物可以使研究者排除代谢组学研究中无关或无意义的代谢物噪声。一旦确定了相对较少的一组显著性代谢物，解读代谢组学数据就变得更加容易。代谢物解读通常涉及确定所识别的代谢物是否属于同一个通路

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或一组相关的通路。在许多情况下，这需要搜索或仔细阅读各种在线代谢组学数据库，如 HMDB、YMDB 或其他数据库。这可能还涉及进行文献综述，以了解这些代谢物的已知信息以及它们如何可能导致所观察到的表型。

几乎所有主要的通路数据库——包括 KEGG、Reactome、Cyc 数据库、WikiPathways 和 SMPDB——都允许用户加载代谢物数据，并生成在给定通路中突出显示关键代谢物位置的图。所研究的生物体类型和需要展示的通路类型通常决定了选择哪个数据库更为合适。大多数代谢物/代谢数据库（如 KEGG、Cyc 数据库、WikiPathways 和 Reactome）仅包含与内源性代谢物合成或降解相关的合成代谢或分解代谢通路。几乎没有提供关于代谢物信号通路（如花生四烯酸的信号效应）、疾病代谢通路（如 Warburg 效应）、代谢性疾病（如苯丙酮尿症）或药物作用通路（展示阿司匹林如何起效）的信息。因此，许多代谢组学通路分析仅限于以最简单的术语（即分解代谢或合成代谢反应）来解读复杂的代谢物数据。一个重要的例外是 SMPDB。该资源包含超过 700 条代谢物通路，包括数百条合成/分解代谢通路、数十条信号通路，以及数百条疾病和药物通路。目前，SMPDB 是唯一涵盖如此广泛通路多样性的开放获取数据库——尤其针对小分子。然而，SMPDB 仅包含与人类（及其他高等哺乳动物）相关的通路，因此对于在植物、微生物、寄生虫、鱼类或昆虫中开展代谢组学研究的研究者来说，其用处不大。

虽然将代谢物归入已知代谢通路可以提供关于其生物学角色的重要洞见，但同样重要的是考虑它们在特定通路中的上下文位置。在这方面，一种名为 MetPA（Xia and Wishart 2010a）的新型软件工具已被开发出来，以进一步促进通路分析。MetPA 是一个免费访问的 Web 服务器，它将多种通路富集分析程序与通路拓扑特征分析相结合，帮助识别与给定代谢组学研究最相关的代谢通路。与许多代谢组学 Web 服务器应用一样，MetPA 使用简单的点击操作，允许用户执行复杂的统计分析。MetPA 支持三种类型的分析：通路富集分析、通路拓扑分析和通路影响分析。（有关通路富集分析的更多信息，参见第 13 章

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）通路富集分析可以通过过度表征分析进行，也可以通过代谢物集合富集分析（MSEA）使用 Fisher 精确检验、超几何检验和 GlobalAncova 来实现（Xia and Wishart 2010a）。通路拓扑分析基于代谢物在给定代谢网络中的中心性度量。中心性是代谢物相对于通路中其他代谢物位置的定量度量，可用于估计代谢物在通路或网络图中的相对重要性或角色。由于代谢网络或通路是有向图，MetPA 使用相对"中介中心性"（betweenness centrality）和"出度中心性"（out-degree centrality）度量来计算代谢物的相对重要性。这意味着位于通路边缘或参与副反应的代谢物影响较小，并不特别"核心"。另一方面，位于通路瓶颈处或作为多个反应枢纽或前体的代谢物通常更具核心性。通过计算给定通路中不同代谢物的拓扑重要性，以及某些代谢物在通路中的富集程度，可以计算通路影响评分（pathway impact score）。形式上，通路影响评分是匹配代谢物重要性度量之和除以该通路中所有代谢物重要性度量之和的归一化值。通过将通路影响评分与该通路中出现的显著性代谢物数量（以 –log(P) 值表示，使用代谢物集合富集标准）作图，可以生成如图 14.23 所示的图。

该图展示了在给定代谢组学实验中从约 30 个显著变化的代谢物集合中检测到的最重要通路。通路影响评分绘制在 X 轴上，通路的显著性（由高度显著代谢物的富集水平衡量）绘制在 Y 轴上。圆圈的大小代表特定通路中代谢物的数量，圆圈的颜色表示其整体显著性，红色为最显著，淡黄色或白色为最不显著。点击圆圈可以看到通路的可缩放视图，展示通路名称、通路组分及其拓扑关系。每个检测到的代谢物也可点击，允许生成箱线图（box-and-whisker plot），展示病例与对照样本之间代谢物浓度和范围。MetPA 最近已整合到 MetaboAnalyst 中，目前拥有从 21 个不同模型生物收集的近 900 条不同通路的数据库。最近还出现了几种其他通路映射或代谢物网络方法，包括 MetaMapp（Barupal et al. 2012）和 MetaMapR（Grapov et al. 2015）。MetaMapp 将来自 KEGG 的生化反应与化学相似性和质谱相似性评分相结合。这种方法允许构建扩展的代谢物网络，将已识别和未识别的代谢物映射到潜在通路和网络聚类。MetaMapR 将这一概念进一步推进，允许用户在程序内直接计算结构相似性和质谱相似性，同时支持交互式网络可视化。

除通路分析和/或网络分析之外，还有多种其他方法可用于解读、可视化或探索代谢组学数据。一种特别有用的方法是使用 MSEA（Xia and Wishart 2010b）。MSEA 是一种功能富集分析形式，类似于基因集合富集分析（GSEA）。要使代谢物集合富集分析有效，软件需要拥有以下之一：综合性代谢通路数据库、健康/疾病代谢物水平数据库，或代谢物与单核苷酸多态性（SNP）之间关联的数据库，或代谢物与基因表达水平之间关联的数据库。理想情况下，一个好的 MSEA 系统应拥有所有这些数据库并支持所有这些功能分析。另一种解读代谢组学数据的方法是将其与基因表达或蛋白质表达数据相结合（Xia et al. 2013）。有多种新兴方法支持这种整合，包括 MetScape（Karnovsky et al. 2012）。MetScape 是一个广泛使用的开源网络分析和可视化工具 Cytoscape 的插件（见第 13 章）。MetScape 通过整合 KEGG 和 Edinburgh Human Metabolic Network 数据库，支持代谢物和基因表达数据的交互式、基于网络的探索与可视化。MetScape 允许用户从基因或代谢物表达谱数据中识别富集通路，构建和分析基因或代谢物网络，并交互式可视化基因或代谢物数据的变化。另一种提供类似功能的整合"组学"方法称为整合代谢组学与表达分析（INMEX; Xia et al. 2013）。这一基于 Web 的工具现已通过 MetaboAnalyst 可用。与 MetScape 类似，INMEX 利用 KEGG 通路数据库以及 SMPDB 的多条通路。

另一种可用于解读代谢组学数据的生物信息学技术涉及代谢模拟和代谢通量平衡分析（metabolic flux balance analysis; Lewis et al. 2012）。这些技术通常需要对整个生物体的代谢通路进行详细重建，考虑质量和电荷平衡、代谢物区室化（compartmentalization）以及已知或估计的代谢物浓度。它们还需要对所有酶促反应和代谢转运反应所需的基因、蛋白质和辅因子有详细了解。代谢重建和代谢模拟已在多种生物中被描述，包括 E. coli、酵母、Caenorhabditis elegans、Arabidopsis，甚至人类（Ruppin et al. 2010; Lewis et al. 2012; Swainston et al. 2016）。这些代谢重建已被用于预测代谢通路中突变的后果，解释某些代谢物在某些生理或疾病相关条件下的出现，并帮助预测此前未检测到或意料之外的化合物的存在。这些令人瞩目的模拟代表了将高级生物信息学与高级代谢组学相结合所能达到的最高成就。它们也是代谢组学如何作为基础工具、使生物信息学家能够开展系统生物学高级研究的绝佳范例。

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Figure 14.22 变量重要性投影图（variable importance in projection plot），展示在正文 MetaboAnalyst 示例中描述的牛饲养实验数据中，哪些代谢物对数据分离最为重要。该图使用 MetaboAnalyst 生成。

Figure 14.23 通路影响图（pathway impact plot），展示在正文 MetaboAnalyst 示例中描述的牛饲养实验中，发现显著性代谢物的不同通路的重要性。该图使用 MetaboAnalyst 的通路分析模块生成。

Ch14 Metabolomics / Summary + Further Reading + References

小结

代谢组学领域融合了基础生物学与分析化学的独特组合，并辅以大量的生物信息学、化学信息学和统计学方法。代谢组学方法已促成多项重要的生物医学发现（Wang et al. 2011a, b），并为更多发现打开了大门（Wishart 2016），这一事实使得这些方法在生命科学研究者中日益普及。事实上，过去十年间，代谢组学在规模、范围和技术水平上都有了显著发展。因此，对已开发的众多生物信息学/化学信息学工具、资源和技术进行详细描述，轻而易举就能写满好几本书。本章仅旨在作为一个易于入门的窗口，让那些有志从事代谢组学研究并希望使用生物信息学或化学信息学工具的人能够更好地了解现有的资源、可行的方向以及仍待解决的问题。

因特网资源

延伸阅读

Dunn, W.B., Bailey, N.J., and Johnson, H.E. (2005). Measuring the metabolome: current analytical technologies. Analyst 130: 606–625. 一篇关于代谢组学中不同分析技术的优秀综述。虽然论文发表时间较早，但其解释深入浅出、易于理解。此类文献永不过时。

Kind, T. and Fiehn, O. (2010). Advances in structure elucidation of small molecules using mass spectrometry. Bioanal. Rev. 2: 23–60. 一篇关于质谱如何以及应当如何用于代谢物表征的非常全面的综述。涵盖的许多主题都阐述得极为详尽。作者是备受推崇的质谱学家，开创了现代代谢组学中使用的许多技术和思想。

Wishart, D.S. (2016). Emerging applications of metabolomics in drug discovery and precision medicine. Nat. Rev. Drug Discov. 15: 473–484. 介绍代谢组学在医学应用中如何被（以及正在被）使用。重点介绍了过去10年间代谢组学领域产生的一些更重要、更有趣的生物医学发现，并展望了代谢组学的未来发展方向。

Xia, J. and Wishart, D.S. (2016). Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Curr. Protoc. Bioinf. 55: 14.10.1–14.10.93. 一份非常详细的分步说明（配有大量截图），描述了 MetaboAnalyst 中所有工具、技巧和窍门。任何希望从事代谢组学研究和使用 MetaboAnalyst 的人的必读文献。

参考文献

Allen, F., Pon, A., Wilson, M. et al. (2014). CFM-ID: a web server for annotation, spectrum prediction and metabolite identification from tandem mass spectra. Nucleic Acids Res. 42 (Web Server issue): W94–W99.

Allen, F., Greiner, R., and Wishart, D.S. (2015). Competitive fragmentation modeling of ESI-MS/MS spectra for putative metabolite identification. Metabolomics 11: 98–110.

Allen, F., Pon, A., Greiner, R., and Wishart, D. (2016). Computational prediction of electron ionization mass spectra to assist in GC/MS compound identification. Anal. Chem. 88: 7689–7697.

Barupal, D.K., Haldiya, P.K., Wohlgemuth, G. et al. (2012). MetaMapp: mapping and visualizing metabolomic data by integrating information from biochemical pathways and chemical and mass spectral similarity. BMC Bioinf. 13: 99.

Bassini, A. and Cameron, L.C. (2014). Sportomics: building a new concept in metabolic studies and exercise science. Biochem. Biophys. Res. Commun. 445: 708–716.

Bienfait, B. and Ertl, P. (2013). JSME: a free molecule editor in JavaScript. J. Cheminform. 5: 24.

Böcker, S., Letzel, M.C., Lipták, Z., and Pervukhin, A. (2009). SIRIUS: decomposing isotope patterns for metabolite identification. Bioinformatics 25: 218–224.

Brown, S.A. (2016). Circadian metabolism: from mechanisms to metabolomics and medicine. Trends Endocrinol. Metab. 27: 415–426.

Croft, D., O'Kelly, G., Wu, G. et al. (2011). Reactome: a database of reactions, pathways and biological processes. Nucleic Acids Res. 39 (Database issue): D691–D697.

da Silva, R.R., Dorrestein, P.C., and Quinn, R.A. (2015). Illuminating the dark matter in metabolomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112: 12549–12550.

Dalby, A., Nourse, J.G., Hounshell, W.D. et al. (1992). Description of several chemical structure file formats used by computer programs developed at Molecular Design Limited. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 32: 244–255.

Davidson, R.L., Weber, R.J., Liu, H. et al. (2016). Galaxy-M: a Galaxy workflow for processing and analyzing direct infusion and liquid chromatography mass spectrometry-based metabolomics data. GigaScience 5: 10.

Demir, E., Cary, M.P., Paley, S. et al. (2010). The BioPAX community standard for pathway data sharing. Nat. Biotechnol. 28: 935–942.

Deutsch, E.W. (2008). mzML: a single, unifying data format for mass spectrometer output. Proteomics 14: 2776–2777.

Dunn, W.B., Bailey, N.J., and Johnson, H.E. (2005). Measuring the metabolome: current analytical technologies. Analyst 130: 606–625.

Durant, J.L., Leland, B.A., Henry, D.R., and Nourse, J.G. (2002). Reoptimization of MDL keys for use in drug discovery. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 42: 1273–1280.

Ertl, P. (2010). Molecular structure input on the web. J. Cheminform. 2: 1.

Fahy, E., Sud, M., Cotter, D., and Subramaniam, S. (2007). LIPID MAPS online tools for lipid research. Nucleic Acids Res. 35 (Web Server issue): W606–W612.

Fiehn, O. (2002). Metabolomics – the link between genotypes and phenotypes. Plant Mol. Biol. 48: 155–171.

Grapov, D., Wanichthanarak, K., and Fiehn, O. (2015). MetaMapR: pathway independent metabolomic network analysis incorporating unknowns. Bioinformatics 31: 2757–2760.

Guo, A.C., Jewison, T., Wilson, M. et al. (2013). ECMDB: the E. coli Metabolome Database. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue): D625–D630.

Hanson, R.M., Prilusky, J., Renjian, Z. et al. (2013). JSmol and the next-generation web-based representation of 3D molecular structure as applied to Proteopedia. Isr. J. Chem. 53: 207–216.

Hanwell, M.D., Curtis, D.E., Lonie, D.C. et al. (2012). Avogadro: an advanced semantic chemical editor, visualization, and analysis platform. J. Cheminform. 4: 17.

Hao, J., Liebeke, M., Astle, W. et al. (2014). Bayesian deconvolution and quantification of metabolites in complex 1D NMR spectra using BATMAN. Nat. Protoc. 9: 1416–1427.

Hastings, J., de Matos, P., Dekker, A. et al. (2013). The ChEBI reference database and ontology for biologically relevant chemistry: enhancements for 2013. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue): D456–D463.

Haug, K., Salek, R.M., Conesa, P. et al. (2013). MetaboLights – an open-access general-purpose repository for metabolomics studies and associated meta-data. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue): D781–D786.

Heller, S.R., McNaught, A., Pletnev, I. et al. (2015). InChI, the IUPAC international chemical identifier. J. Cheminform. 7: 23.

Holmes, E., Wilson, I.D., and Nicholson, J.K. (2008). Metabolic phenotyping in health and disease. Cell 134: 714–717.

Hucka, M., Finney, A., Sauro, H.M. et al. (2003). The systems biology markup language (SBML): a medium for representation and exchange of biochemical network models. Bioinformatics 19: 524–531.

Jewison, T., Knox, C., Neveu, V. et al. (2012). YMDB: the yeast metabolome database. Nucleic Acids Res. 40 (Database issue): D815–D820.

Jewison, T., Su, Y., Disfany, F.M. et al. (2014). SMPDB 2.0: big improvements to the small molecule pathway database. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue): D478–D484.

Kanehisa, M., Goto, S., Sato, Y. et al. (2014). Data, information, knowledge and principle: back to metabolism in KEGG. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue): D199–D205.

Karnovsky, A., Weymouth, T., Hull, T. et al. (2012). Metscape 2 bioinformatics tool for the analysis and visualization of metabolomics and gene expression data. Bioinformatics 28: 373–380.

Karp, P.D., Riley, M., Saier, M. et al. (2000). The EcoCyc and MetaCyc databases. Nucleic Acids Res. 28: 56–59.

Kastenmüller, G., Römisch-Margl, W., Wägele, B. et al. (2011). metaP-server: a web-based metabolomics data analysis tool. J. Biomed. Biotechnol. 2011 https://doi.org/10.1155/2011/839862.

Katajamaa, M., Miettinen, J., and Oresic, M. (2006). MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics 22: 634–636.

Kelder, T., van Iersel, M.P., Hanspers, K. et al. (2012). WikiPathways: building research communities on biological pathways. Nucleic Acids Res. 40 (Database issue): D1301–D1307.

Kessler, N., Neuweger, H., Bonte, A. et al. (2013). MeltDB 2.0-advances of the metabolomics software system. Bioinformatics 29: 2452–2459.

Kim, S., Kim, J., Yun, E.J., and Kim, K.H. (2016). Food metabolomics: from farm to human. Curr. Opin. Biotechnol. 37: 16–23.

Kind, T. and Fiehn, O. (2007). Seven Golden Rules for heuristic filtering of molecular formulas obtained by accurate mass spectrometry. BMC Bioinf. 8: 105.

Kind, T. and Fiehn, O. (2010). Advances in structure elucidation of small molecules using mass spectrometry. Bioanal. Rev. 2: 23–60.

Kind, T., Tsugawa, H., Cajka, T. et al. (2017). Identification of small molecules using accurate mass MS/MS search. Mass Spectrom. Rev. https://doi.org/10.1002/mas.21535.

Kopka, J., Schauer, N., Krueger, S. et al. (2005). GMD@CSB.DB: the Golm metabolome database. Bioinformatics 21: 1635–1638.

Krause, S., Willighagen, E., and Steinbeck, C. (2000). JChemPaint – using the collaborative forces of the internet to develop a free editor for 2D chemical structures. Molecules 5: 93–98.

Kuhn, S., Helmus, T., Lancashire, R.J. et al. (2007). Chemical markup, XML, and the World Wide Web. 7. CMLSpect, an XML vocabulary for spectral data. J. Chem. Inf. Model. 47: 2015–2034.

Lancashire, R.J. (2007). The JSpecView Project: an Open Source Java viewer and converter for JCAMP-DX, and XML spectral data files. Chem. Cent. J. 1: 31.

Levy, P.A. (2010). An overview of newborn screening. J. Dev. Behav. Pediatr. 31: 622–631.

Lewis, N.E., Nagarajan, H., and Palsson, B.O. (2012). Constraining the metabolic genotype-phenotype relationship using a phylogeny of in silico methods. Nat. Rev. Microbiol. 10: 291–305.

Lu, H., Liang, Y., Dunn, W.B. et al. (2008). Comparative evaluation of software for deconvolution of metabolomics data based on GC-TOF-MS. Trends Anal. Chem. 27: 215–227.

Markley, J.L., Ulrich, E.L., Berman, H.M. et al. (2008). BioMagResBank (BMRB) as a partner in the Worldwide Protein Data Bank (wwPDB): new policies affecting biomolecular NMR depositions. J. Biomol. NMR. 40: 153–155.

McDonald, R.S. and Wilks, P.A. (1988). JCAMP-DX: a standard form for exchange of infrared spectra in computer-readable form. Appl. Spectrosc. 42: 151–162.

Melamud, E., Vastag, L., and Rabinowitz, J.D. (2010). Metabolomic analysis and visualization engine for LC-MS data. Anal. Chem. 82: 9818–9826.

Nakamura, K., Shimura, N., Otabe, Y. et al. (2013). KNApSAcK-3D: a three-dimensional structure database of plant metabolites. Plant Cell Physiol. 54: e4.

Naz, S., Moreira dos Santos, D.C., García, A., and Barbas, C. (2014). Analytical protocols based on LC-MS, GC-MS and CE-MS for nontargeted metabolomics of biological tissues. Bioanalysis 6: 1657–1677.

Niedermeyer, T.H. (2016). Annotating and interpreting linear and cyclic peptide tandem mass spectra. Methods Mol. Biol. 1401: 199–207.

O'Boyle, N.M., Banck, M., James, C.A. et al. (2011). Open Babel: an open chemical toolbox. J. Cheminform. 3: 33.

Psychogios, N., Hau, D.D., Peng, J. et al. (2011). The human serum metabolome. PLoS One 6 (2): e16957.

Ravanbakhsh, S., Liu, P., Bjorndahl, T.C. et al. (2015). Accurate, fully-automated NMR spectral profiling for metabolomics. PLoS One 10: e0124219.

Ruppin, E., Papin, J.A., de Figueiredo, L.F., and Schuster, S. (2010). Metabolic reconstruction, constraint-based analysis and game theory to probe genome-scale metabolic networks. Curr. Opin. Biotechnol. 21: 502–510.

Schober, D., Jacob, D., Wilson, M. et al. (2018). nmrML: an open standard for the description, storage and exchange on NMR data. Anal. Chem. 90: 649–656.

Smith, C.A., Want, E.J., O'Maille, G. et al. (2006). XCMS: processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Anal. Chem. 78: 779–787.

Stein, S.E. (1999). An integrated method for spectrum extraction and compound identification from gas chromatography/mass spectrometry data. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 10: 770–781.

Steinbeck, C. and Kuhn, S. (2004). NMRShiftDB – compound identification and structure elucidation support through a free community-built web database. Phytochemistry 65: 2711–2717.

Steinbeck, C., Hoppe, C., Kuhn, S. et al. (2006). Recent developments of the chemistry development kit (CDK) an open-source java library for chemo- and bioinformatics. Curr. Pharm. Des. 12: 2111–2120.

Sud, M., Fahy, E., Cotter, D. et al. (2016). Metabolomics Workbench: an international repository for metabolomics data and metadata, metabolite standards, protocols, tutorials and training, and analysis tools. Nucleic Acids Res. 44 (D1): D463–D470.

Sumner, L.W., Amberg, A., Barrett, D. et al. (2007). Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics 3: 211–221.

Swainston, N., Smallbone, K., Hefzi, H. et al. (2016). Recon 2.2: from reconstruction to model of human metabolism. Metabolomics 12: 109.

Tautenhahn, R., Cho, K., Uritboonthai, W. et al. (2012). An accelerated workflow for untargeted metabolomics using the METLIN database. Nat. Biotechnol. 30: 826–828.

Tsugawa, H., Cajka, T., Kind, T. et al. (2015). MS-DIAL: data-independent MS/MS deconvolution for comprehensive metabolome analysis. Nat. Methods 12: 523–526.

van Iersel, M.P., Villéger, A.C., Czauderna, T. et al. (2012). Software support for SBGN maps: SBGN-ML and LibSBGN. Bioinformatics 28: 2016–2021.

Viant, M.R. (2008). Recent developments in environmental metabolomics. Mol. Biosyst. 4: 980–986.

Wang, T.J., Larson, M.G., Vasan, R.S. et al. (2011a). Metabolite profiles and the risk of developing diabetes. Nat. Med. 17: 448–453.

Wang, Z., Klipfell, E., Bennett, B.J. et al. (2011b). Gut flora metabolism of phosphatidylcholine promotes cardiovascular disease. Nature 472: 57–63.

Weininger, D. (1988). SMILES 1. Introduction and encoding rules. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 28: 31–38.

Westbrook, J.D. and Fitzgerald, P.M. (2003). The PDB format, mmCIF, and other data formats. Methods Biochem. Anal. 44: 161–179.

Wheeler, D.L., Barrett, T., Benson, D.A. et al. (2006). Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Res. 34 (Database issue): D173–D180.

Wild, C.P. (2005). Complementing the genome with an "exposome": the outstanding challenge of environmental exposure measurement in molecular epidemiology. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 14: 1847–1850.

Williams, A.J. (2008). Public chemical compound databases. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 11: 393–404.

Wishart, D.S. (2005). Metabolomics: the principles and potential applications to transplantation. Am. J. Transplant. 5: 2814–2820.

Wishart, D.S. (2008). Quantitative metabolomics using NMR. Trends Anal. Chem. 27: 228–237.

Wishart, D.S. (2011). Advances in metabolite identification. Bioanalysis 3: 1769–1782.

Wishart, D.S. (2016). Emerging applications of metabolomics in drug discovery and precision medicine. Nat. Rev. Drug Discov. 15: 473–484.

Wishart, D.S., Tzur, D., Knox, C. et al. (2007). HMDB: the human metabolome database. Nucleic Acids Res. 35 (Database issue): D521–D526.

Wishart, D.S., Arndt, D., Pon, A. et al. (2015). T3DB: the toxic exposome database. Nucleic Acids Res. 43 (Database issue): D928–D934.

Worley, B. and Powers, R. (2014). MVAPACK: a complete data handling package for NMR metabolomics. ACS Chem. Biol. 9: 1138–1144.

Xia, J. and Wishart, D.S